遠(yuǎn)志總皂苷對癲癇模型大鼠nAChRɑ7亞基表達的影響

， ， ，新毅

癲癇是由多種原因?qū)е碌哪X部神經(jīng)元高度同步化異常放電所致的臨床綜合征。癲癇的核心內(nèi)容是癲癇發(fā)作，但30%～40%的癲癇病人除癲癇癥狀外，常伴有學(xué)習(xí)記憶減退，注意力分散等認(rèn)知功能障礙表現(xiàn)[1]。迄今為止，癲癇對認(rèn)知功能影響的機制仍未完全闡明，且缺乏有效的防治藥物。膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)與注意力、學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知過程有關(guān)[2]。煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)廣泛分布在海馬、前額皮質(zhì)等與認(rèn)知功能密切相關(guān)的區(qū)域。煙堿型乙酰膽堿受體ɑ7(nAChRɑ7)是nAChR的一種重要亞型，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可能在認(rèn)知過程中發(fā)揮重要作用[3]。

遠(yuǎn)志是我國傳統(tǒng)的安神益智良藥，其中的遠(yuǎn)志總皂苷(Tenuigenin，TEN)被認(rèn)為是其有效成分，在提高學(xué)習(xí)記憶方面有顯著的作用，可通過降低膽堿酯酶活性，保護中樞膽堿能系統(tǒng)改善學(xué)習(xí)記憶[4-5]。前期實驗證實TEN可改善癲癇模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬LTP的抑制[6]。本實驗在前期實驗基礎(chǔ)上觀察大鼠海馬CA1區(qū)nAChRɑ7亞基表達的變化及TEN對其影響，探討TEN改善學(xué)習(xí)記憶功能的部分可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性Wistar大鼠，體重250 g～300 g，來源于北京海淀興旺動物養(yǎng)殖場，室溫(25.5±2)℃喂養(yǎng)。

1.1.2 藥品、試劑及實驗儀器 遠(yuǎn)志總皂苷(Tenuigenin，TEN)，純度為72%，在山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心提取，取37.5 g溶于1 L的蒸餾水中，充分溶解后置于4℃環(huán)境保存；戊四氮(Pentylenetetrazole，PTZ)購于Sigma公司，將其溶于生理鹽水配成1%的溶液(10 mg/mL)后置于4℃環(huán)境保存；SABC免疫組化染色試劑盒(羊抗兔IgG，SABC液，5%BSA封閉液)購于武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠nAChRɑ7購于北京博奧森公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及造模 將32只雄性Wister大鼠隨機分為對照組(8只)、模型組(12只)、TEN防治組(12只)。模型組每天腹腔注射致驚厥劑量的PTZ(40 mg/kg)，注射完觀察大鼠2 h，記錄發(fā)作分級、次數(shù)，根據(jù)大鼠體重進行劑量調(diào)節(jié)，連續(xù)給藥28 d，停藥7 d，再以相同劑量點燃，驚厥發(fā)作以Racine法分級標(biāo)準(zhǔn)進行判斷，以連續(xù)2次以上、5級以上發(fā)作視為造模成功。TEN防治組在造模的同時灌服TEN溶液(375 mg/kg)，連續(xù)給藥35 d，然后腹腔注射PTZ點燃。對照組則灌服等劑量的生理鹽水。造模結(jié)果：對照組8只大鼠均存活；癲癇模型組12只大鼠癲癇發(fā)作死亡3只，未達標(biāo)1只，造模成功8只；TEN防治組大鼠癲癇發(fā)作死亡2只，未達標(biāo)1只，造模成功9只。

1.2.2 切片制備 采用7% 水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔麻醉，剪開胸腹腔，暴露心臟和肝臟，剪開左心尖及右心耳部，將導(dǎo)管插入左心室并固定，快速注入約250 mL生理鹽水至肝臟完全變白，右心耳流出澄清液體后，再注入40 g/L 多聚甲醛固定液數(shù)分鐘，待大鼠肝臟變硬、肢體僵直后斷頭，取出完整鼠腦并投入含4%的多聚甲醛中4℃固定(4～6) h，脫水，透明，石蠟包埋。冠狀位連續(xù)切片，切片厚度為2 μm。

1.2.3 免疫組化染色 采用SABC(Strept Actividin-Biotin Complex)免疫組化染色法。①石蠟切片常規(guī)脫蠟；②PBS洗2 min×2 次，3% 的H2O2溶液，室溫10 min；③PBS洗2 min×2 次，加入枸櫞酸緩沖液中于高壓鍋中煮沸2 min，冷卻至室溫；④PBS洗2 min×2次，滴加5% BSA 封閉液，室溫30 min，甩去多余液體；⑤滴加稀釋的兔抗大鼠nAChRɑ7稀釋液(1∶50)，4 ℃ 過夜；⑥ 復(fù)溫40 min，PBS 沖洗2 min×2次；⑦滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 30 min，PBS洗2 min×2次；⑧滴加SABC，37℃ 20 min，PBS 洗2 min×3 次；⑨ DAB 顯色，(7～8) min后蒸餾水終止顯色反應(yīng)；⑩蘇木素復(fù)染11 s。脫水，封片。光鏡下觀察。

1.2.4 陰性對照的建立 以10% PBS 代替一抗，其余步驟同前。

1.2.5 灰度值測定 應(yīng)用美國aperio公司Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)，400倍物鏡下，在相對應(yīng)的海馬CA1區(qū)內(nèi)，隨機各取5個視野，測單個視野中nAChRɑ7的灰度值。

2 結(jié) 果

各組海馬CA1區(qū)nAChRɑ7亞基免疫組化結(jié)果見圖1，免疫染色陽性物質(zhì)主要存在于神經(jīng)元細(xì)胞表面。其中對照組細(xì)胞密集、免疫染色深；模型組細(xì)胞稀疏、免疫染色淡，其平均灰度值顯著大于對照組(P<0.05)；TEN防治組免疫染色陽性細(xì)胞較密集，染色較深，其平均灰度值顯著小于模型組(P<0.05)。詳見表1。

圖1 各組海馬CA1區(qū)nAChRɑ7表達免疫組化結(jié)果

表1 各組海馬CA1區(qū)nAChRɑ7表達的平均灰度值(±s)

3 討 論

癲癇后繼發(fā)認(rèn)知功能損害的現(xiàn)象已逐漸引起廣泛重視，但目前癲癇對認(rèn)知功能影響的機制仍未完全闡明，且缺乏有效的防治藥物。膽堿能假說認(rèn)為膽堿能突觸是一種記憶突觸，與學(xué)習(xí)記憶過程密切相關(guān)[7]，乙酰膽堿釋放減少或乙酰膽堿受體數(shù)目減少會導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。煙堿型乙酰膽堿受體ɑ7(nAChRα7)是煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)的重要亞型之一，由5個相同的α7亞基構(gòu)成，屬于配體門控離子通道，廣泛分布于海馬、下丘腦、皮質(zhì)下基底核等部位，可能在認(rèn)知過程中發(fā)揮重要作用[3， 8]。研究表明缺乏nAChRα7的小鼠存在認(rèn)知能力減退[9]，而使用煙堿或其他nAChRα7激動劑可改善認(rèn)知功能，改善學(xué)習(xí)、記憶功能[10]。

遠(yuǎn)志在臨床上的應(yīng)用歷史悠久，具有改善認(rèn)知能力的功效，TEN作為其主要成分，對學(xué)習(xí)記憶影響也日益受到重視[10]。TEN可改善癲癇模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬LTP的抑制[6]。本實驗在此基礎(chǔ)上觀察大鼠海馬CA1區(qū)nAChRɑ7亞基表達的變化及TEN對其影響，結(jié)果提示TEN能夠提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)nAChRɑ7表達。TEN可顯著提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)NMDA 受體的表達[11]。

TEN可改善癲癇模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬LTP的抑制，其可能是通過提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體和nAChRɑ7的表達起到改善癲癇模型大鼠認(rèn)知障礙的作用，該系列研究結(jié)果為臨床研制新藥提供了理論依據(jù)。

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