曲美他嗪對(duì)心梗后心衰大鼠心功能及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

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目前缺血性心臟病的治療取得了很大的進(jìn)展，但是心衰作為各種心血管疾病的終末期表現(xiàn)，仍是心血管疾病高病死率和高致殘率的主要原因。曲美他嗪作為一種新型的心肌代謝類藥物，無論動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均表明其對(duì)急、慢性心肌缺血有保護(hù)作用。本研究旨在評(píng)價(jià)曲美他嗪對(duì)心肌梗死后心衰大鼠心功能及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠50只(體重200 g～250 g)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院倫理委員會(huì)監(jiān)督。分籠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，自然光照，飼以標(biāo)準(zhǔn)的大鼠合成飼料，自由飲用純凈水，環(huán)境溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度(45%～70)%。

1.2 儀器 HP 5500彩色多普勒超聲顯像儀(PHILIPS，America)；HX-200動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司，中國(guó))；BL-820S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，中國(guó))；SIM-F124制冰機(jī)(SANYO，Japan)；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器(SANYO，Japan)；BA110S千分位電子天平(Sartorius AG，German)；ASP200S脫水機(jī)(Leica，German)；EG1150H包埋機(jī)(Leica，German)；RM2245切片機(jī)(Leica，German)；IX70光學(xué)顯微鏡(OLYPUS，Japan)無菌手術(shù)器械(彎鉗，鑷子，彎鑷，持針器，眼科剪，3×8圓針，6-0線，1號(hào)縫合線)和載玻片、PV管。

1.3 藥物與試劑

1.3.1 藥物 曲美他嗪片(遠(yuǎn)大醫(yī)藥有限公司，中國(guó)，批號(hào)：12070404)；戊巴比妥粉劑(上海艾研生物有限公司，中國(guó)，批號(hào)：081130251)；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，中國(guó)，批號(hào)： H13020657)。

1.3.2 試劑 10%中性甲醛(北京世濟(jì)合力生物科技有限公司，中國(guó)，生產(chǎn)日期：2013年6月3日)；伊紅染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，中國(guó)，批號(hào)：713051)；蘇木素體細(xì)胞染色液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，中國(guó)，批號(hào)：130604445H)；蘇木色精返藍(lán)液(北京世濟(jì)合力生物科技有限公司，中國(guó)，生產(chǎn)日期：2013年6月3日)；蘇木色精分色液(北京世濟(jì)合力生物科技有限公司，中國(guó)，生產(chǎn)日期：2013年6月3日)；Masson三色染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，中國(guó)，批號(hào)：YZB/粵珠0011-2013)。

1.4 動(dòng)物模型制備 SD大鼠以2%戊巴比妥液(40 mg/kg體重)進(jìn)行腹腔麻醉[1]，仰臥位固定于大鼠臺(tái)上，胸部、頸部手術(shù)視野區(qū)常規(guī)備皮、消毒，同時(shí)記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖；頸部手術(shù)視野區(qū)沿氣管方向作長(zhǎng)約3 cm左右的縱行切口，逐步分離頸部肌肉，暴露氣管，采用內(nèi)直徑3 mm的氣管導(dǎo)管經(jīng)大鼠口腔插入氣管內(nèi)，以無創(chuàng)縫合線將導(dǎo)管打結(jié)固定于大鼠下顎，氣管一端連接HX-200動(dòng)物呼吸機(jī)，輔助大鼠呼吸(呼吸機(jī)潮氣量為(9～12) mL，頻率(85～90)次/min，吸呼比為1∶2)；在距胸骨左緣0.5 cm，第3～4肋骨間作長(zhǎng)3 cm的縱形切口，從左側(cè)第四肋間鈍性分離皮膚、胸大肌，打開胸腔，用眼科開瞼器拉開第3、4肋，顯示手術(shù)視野，暴露心臟，剪開心包，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界下(1～2) mm處用3×8圓針穿過，用6-0無創(chuàng)性縫線，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)，以穿刺而未結(jié)扎大鼠作為假手術(shù)組；以結(jié)扎部位遠(yuǎn)端心肌變白、搏動(dòng)減弱且心電圖出現(xiàn)ST段弓背向上明顯抬高為急性心肌梗死(AMI)造模成功標(biāo)志。然后擠出胸腔內(nèi)氣體，縫合外皮，碘伏消毒；術(shù)后連續(xù)3 d注射20萬單位青霉素抗感染。

1.5 分組及給藥 動(dòng)物購(gòu)回后在SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d進(jìn)入實(shí)驗(yàn)；術(shù)前每只大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)檢測(cè)；術(shù)前禁食12 h后，體重均衡，隨機(jī)分為造模組與假手術(shù)組。假手術(shù)組16只和造模組34只；造模組大鼠按本文1.4所述方法造模，術(shù)后大鼠復(fù)蘇24 h后行超聲心動(dòng)檢測(cè)，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)值較手術(shù)前下降大于15%判定為心力衰竭模型復(fù)制成功；造模成功大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、曲美他嗪組。

各組大鼠術(shù)后72 h開始灌胃給藥，模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水4 ml/kg；曲美他嗪組給予曲美他嗪10 mg/kg溶于生理鹽水灌胃。各組連續(xù)給藥8周，每天1次，于每日09：00-10：00間灌胃給藥，以5 mL注射器連接灌胃針給大鼠灌胃；每周稱量體重1次，根據(jù)體重計(jì)算調(diào)整給藥劑量。

1.6 大鼠心功能檢測(cè) 大鼠分別于術(shù)前、術(shù)后24 h及藥物干預(yù)后8周行超聲心動(dòng)檢測(cè)。大鼠稱重并以2%戊巴比妥液(40 mg/kg體重)腹腔麻醉，大鼠左胸前廣泛備皮后，仰臥位固定，選取標(biāo)準(zhǔn)左室乳頭肌短軸切面和左室長(zhǎng)軸切面結(jié)合M型和多普勒超聲進(jìn)行檢查(CL15-7高頻線陣探頭、7 MHz～15 MHz)，探頭置于其左胸，在取得較理想的胸骨旁左心室短軸二維圖像后，在乳頭肌水平將M型取樣線垂直室間隔和左心室后壁獲得M型超聲心動(dòng)圖，測(cè)定左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)，并計(jì)算出LVEF、左室短軸縮短率(FS)和心輸出量(CO)。計(jì)算由超聲機(jī)自動(dòng)完成。所檢測(cè)數(shù)據(jù)均測(cè)量3次以取其平均值。超聲檢查的操作及分析由不知曉大鼠分組情況的超聲?？漆t(yī)生完成。

1.7 大鼠心肌樣本取材 各組大鼠于給藥第8周，于末次給藥后12 h后采集心肌樣本，每組隨機(jī)采集6例心肌樣本。大鼠麻醉后，迅速打開胸腔，剪開心包，剔除附屬物。心臟經(jīng)生理鹽水溶液反復(fù)沖洗至溶液變清亮，心臟浸入10%中性甲醛溶液室溫固定。

1.8 大鼠心肌樣本制備

1.8.1 大鼠心肌組織HE染色 從10%中性甲醛溶液中取出心臟，修整組織，經(jīng)橫斷切面取出左室中部組織塊，放入包埋盒中，置入脫水機(jī)中脫水，然后常規(guī)石蠟包埋。之后經(jīng)修片、切片、裱片、烤片結(jié)束之后，即可進(jìn)行染色、封片。

1.8.2 大鼠心肌組織Masson染色 充分固定和脫蠟后于玻片心肌組織移入Bouin氏液或Zenker氏液，流水沖洗過夜，常規(guī)脫水包埋；切片脫蠟至水；Weigert鐵蘇木素(Weigert鐵蘇木素A、B液等比例混合液)染(5～10) min，流水稍洗；1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)分鐘；麗春紅酸性品紅染液染(5～30) min，1%冰醋酸沖洗；磷鉬酸溶液處理約5 min后棄掉，不用水洗直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染5 min；1%冰醋酸處理1 min，快速用95%酒精脫水多次；無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組內(nèi)前后對(duì)照采用配對(duì)資料t檢驗(yàn)。各組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較時(shí)先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行，不滿足方差齊性采用Dunnetts-t檢驗(yàn)。假設(shè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 模型復(fù)制及分組 實(shí)驗(yàn)SD大鼠共計(jì)50只，隨機(jī)分為假手術(shù)組16只，造模組34只。假手術(shù)組手術(shù)后存活13只，給藥期間無死亡；造模組復(fù)制模型成功28只，以隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為模型組14只、曲美他嗪組14只；給藥期間，模型組死亡2只，曲美他嗪組死亡2只。

2.2 曲美他嗪對(duì)心梗后心衰大鼠心功能的影響 治療后與模型組比較，曲美他嗪組左室舒張末內(nèi)徑和左室收縮末內(nèi)徑均減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；LVEF、FS、CO均明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

曲美他嗪組治療后與治療前比較，治療后LVIDd與療前無明顯變化；治療后LVIDs較治療前減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后LVEF、FS較治療前明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療后CO較治療前增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心功能參數(shù)比較(±s)

2.3 曲美他嗪對(duì)心梗后心衰大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 HE染色 假手術(shù)組光鏡下心肌細(xì)胞形態(tài)基本正常，胞質(zhì)、胞核清晰，可見清晰的心內(nèi)膜層、肌層和外膜層。心肌細(xì)胞核呈橢圓形，胞漿內(nèi)肌絲排列整齊，心肌纖維著色均勻(見圖1)。模型組光鏡下心肌梗死灶廣泛分布，梗死灶內(nèi)可見壞死組織及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胞漿嗜酸性變，紅染似肌凝狀態(tài)；心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂，呈灶性壞死，細(xì)胞核消失，可見大量膠原纖維組織，梗死灶內(nèi)有散在島狀分布的存活心肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞稀少，肉芽組織生長(zhǎng)稀少(見圖2)。曲美他嗪組光鏡下心肌梗死灶較局限，心肌細(xì)胞部分壞死，心肌纖維排列不整齊，散在心肌纖維斷裂消失，可見梗死灶內(nèi)呈島狀分布的存活心肌細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減少?？梢姵衫w維細(xì)胞和肉芽組織增生較模型組增多(見圖3)。

2.3.2 Masson染色 假手術(shù)組心肌細(xì)胞質(zhì)、肌纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色，膠原纖維呈藍(lán)色。可見心肌細(xì)胞排列整齊，正常心肌組織小動(dòng)脈周圍及心肌細(xì)胞間隙有少許膠原纖維(見圖4)。模型組在梗死灶及周邊，可見壞死心肌細(xì)胞被膠原組織代替。可見心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，心肌組織小動(dòng)脈周圍有較多膠原沉積，并有向心肌細(xì)胞間隙伸展的趨勢(shì)。心肌組織間隙的膠原沉積也顯著增加(見圖5)。曲美他嗪組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：可見部分心肌細(xì)胞被膠原纖維代替，膠原纖維與心肌細(xì)胞相間(見圖6)。

圖1 假手術(shù)組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周HE×100)

圖2 模型組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周HE×100)

圖3 曲美他嗪組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周HE×100)

圖4 假手術(shù)組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周Masson×100)

圖5 模型組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周Masson×100)

圖6 曲美他嗪組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周Masson×100)

3 討 論

曲美他嗪作為一種心血管病治療的輔助藥物，由于其特有的優(yōu)化心肌能量代謝的藥理機(jī)制，目前主要用于心肌缺血和心功能不全的輔助治療。正常心肌的能量主要來源于葡萄糖和脂肪酸氧化代謝。脂肪酸氧化代謝產(chǎn)生等量ATP的耗氧量比糖代謝高，因此其產(chǎn)生ATP的效率低于糖代謝。當(dāng)心肌缺血時(shí)，冠脈血循環(huán)中的脂肪酸升高，心肌能量代謝以脂肪酸代謝為主，葡萄糖氧化代謝受阻，不但會(huì)使耗氧增加，還使糖酵解的產(chǎn)物如乳酸增加。曲美他嗪通過抑制心肌能量代謝中的脂肪酸氧化，使之向葡萄糖氧化轉(zhuǎn)化，提高ATP生成的效率，達(dá)到改善心肌缺血和心功能的作用。

本研究中，與心梗后心衰模型組相比較，曲美他嗪組可以明顯減小心衰后擴(kuò)大的左室收縮末內(nèi)徑和舒張末內(nèi)徑，尤其減小左室收縮末內(nèi)徑，提高左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率，提高心輸出量，改善心梗后心衰大鼠的心臟收縮功能，這與以往的研究結(jié)果相符[2]。這除了曲美他嗪影響心肌細(xì)胞代謝以外，可能還有其他的機(jī)制參與其中，如①曲美他嗪通過改善缺血細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，減少細(xì)胞內(nèi)H+、Na+、Ca2+的超負(fù)荷，抑制氧自由基的生成，提高氧自由基的清除功能，減少細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化，而具有強(qiáng)大的抗氧化作用[3]。②在缺氧狀態(tài)下，線粒體內(nèi)Ca2+超負(fù)荷可以引起線粒體腫脹，氧化磷酸化障礙，曲美他嗪可以與膜上的可通透性蛋白結(jié)合并使之失活以抑制Ca2+引起的線粒體腫脹，從而減少凋亡蛋白細(xì)胞色素C釋放，抑制下游的caspase酶，阻止細(xì)胞凋亡[4-5]。

心功能的改善依賴于心肌細(xì)胞的存活。本研究中，模型組心肌梗死灶內(nèi)可見壞死組織及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂，呈灶性壞死，細(xì)胞核消失，梗死灶內(nèi)有散在島狀分布的存活心肌細(xì)胞，肉芽組織生長(zhǎng)稀少。在梗死灶及周邊，可見壞死心肌細(xì)胞被膠原組織代替。曲美他嗪組心肌梗死灶較局限，心肌細(xì)胞部分壞死，散在心肌纖維斷裂消失，可見梗死灶內(nèi)呈島狀分布的存活心肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和肉芽組織增生較模型組增多，部分心肌細(xì)胞被膠原纖維代替，膠原纖維與心肌細(xì)胞相間。提示曲美他嗪可能有抑制心梗后心肌細(xì)胞凋亡、改善心肌纖維化的作用。這與之前的研究結(jié)果相一致[6-7]。

曲美他嗪作為一種優(yōu)化心肌代謝的藥物，在不影響心率、血壓的情況下，通過優(yōu)化心肌的能量代謝而改善心室的收縮功能、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而阻止心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心梗后心衰大鼠的心功能和心肌超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生有益的影響。其臨床療效也逐漸得到證實(shí)，在心絞痛、心力衰竭、心肌再灌注損傷等方面都有一定的治療作用。

[1] Pfeffer MA，Braunwald E.Ventricular remodelling after myocardial infarction：experimental observations and clinical implications[J].Circulation，1990，81：1161-1172.

[2] 李兵，陳相健，朱舒舒，等.曲美他嗪對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌能量代謝及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2008，10(6)：447-450.

[3] 張銳，韋建瑞，尹海燕，等.曲美他嗪對(duì)休克患者腎功能影響的臨床研究[J].中華危重癥急救醫(yī)學(xué)，2014，26(1)：219-222.

[4] Gong X，F(xiàn)an G，Wang W，et.al.Trimetazidine protects umbilical cord mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation induced apoptosis by activation of akt[J].Cell Physiol Biochem，2014，34：2245-2255.

[5] Singh D，Chopra K，RETRACTED：Effect of trimetazidine on renal ischemia /reperfusion injury in rats[J].Pharmacological Research，2004，50：623-629.

[6] Xu H，Zhu G，Tian Y.Protective effects of trimetazidine on bone marrow mesenchymal stem cells viability in an ex vivo model of hypoxia and in vivo model of locally myocardial ischemia[J].J Huazhong Univ Sci Technology Med Sci，2012，32：36-41.

[7] 馮翔宇，李彤，李秀華，等.曲美他嗪與雷米普利對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2014，16：856-859.