響應(yīng)面法優(yōu)選銀槐解毒顆粒提取工藝

張江++張麗++木卡代斯?斯依提++趙翡翠

摘要：目的 優(yōu)選銀槐解毒顆粒提取工藝。方法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法考察提取時(shí)間、料液比、浸泡時(shí)間對(duì)銀槐解毒顆粒中綠原酸、總黃酮提取方法的影響。采用HPLC同時(shí)測定綠原酸、總黃酮的含量，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～20 min，13%A；20～30 min，13%～18%A；30～55 min，18%～20%A；55～65 min，20%～23%A），綠原酸和黃酮類成分的檢測波長分別為327、256 nm。結(jié)果 最佳提取工藝條件為浸泡時(shí)間60 min，加12倍量水，提取130 min，提取2次。綠原酸、蘆丁、黃芩苷平均濃度分別為51.497、68.872、25.763 ?g/g，平均浸膏得率為33.105%。結(jié)論 優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定可行，可為銀槐解毒顆粒后續(xù)生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：銀槐解毒顆粒；綠原酸；蘆??；黃芩苷；響應(yīng)面分析法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.014

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）01-0064-05

Optimization of Extraction Process of Yinhuai Jiedu Granula by Response Surface Methodology

ZHANG Jiang1， ZHANG Li2， Mukadaisi SIYITI1， ZHAO Fei-cui3

1. College of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China；

2. Examination and Verification Center for Food and Drug in Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000， China；

3. Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China

Abstract： Objective To optimize extraction process of Yinhuai Jiedu Granula. Methods On the basis of single factor experiments， effects of soaking time， solvent dosage and extracting time on contents of chlorogenic acid and total flavonoids were investigated by response surface methodology. HPLC was used to determine contents of chlorogenie acid and total flavonoids with mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid for gradient elution （0–20 min， 13%A； 20–30 min， 13%–18%A； 30–55 min， 18%–20%A； 55–65 min， 20%–23%A） and detection wavelengthes of 327 nm and 256 nm for chlorogenic acid and total flavonoids respectively. Results Optimal extraction process was as following： soaked 60 minutes and extracted twice with 12 times the amount of water per time of 130 minutes. Concentrations of chlorogenic acid， rutin and baicalin were 51.497， 68.872， 25.763 ?g/g respectively. The average extract yield was 33.105%. Conclusion The optimized extraction process is feasible and stable， which can provide data support for the further research on Yinhuaijiedu granula.

Keywords： Yinhuai Jiedu Granula； chlorogenic acid； rutin； baicalin； response surface

銀花散為新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，為該院劉紅霞教授多年臨床實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)方，由金銀花、槐花、黃芩等15味藥組成，具有清熱解毒、消癰散結(jié)之功效，臨床用于治療肺胃濕熱所致的尋常型痤瘡、酒渣鼻、酒渣樣皮炎、脂溢性皮炎。方中金銀花、槐花、黃芩為君藥。研究表明，金銀花水提液體

基金項(xiàng)目：烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（Y151310012）

通訊作者：趙翡翠，E-mail：1017987429@qq.com

內(nèi)或體外均具有明顯的抑菌、抗菌作用[1-3]；槐花中的蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物是其主要藥理活性成分[4-6]，有抗病毒、抗真菌、止血、降壓、擴(kuò)冠等作用[7]；黃芩苷是黃芩及其制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)成分[8-9]，具有極為廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤、保肝、保護(hù)心血管及神經(jīng)系統(tǒng)等多種作用[10]。由于銀花散口感較差，且該處方藥味較多，故擬將銀花散改劑型為顆粒劑。銀槐解毒顆粒是在銀花散基礎(chǔ)上開發(fā)研制而成。結(jié)合中試生產(chǎn)成本，選擇水為提取溶媒，以綠原酸、蘆丁、黃芩苷質(zhì)量濃度的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)面法對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為中試生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。endprint

1 儀器與試藥

1525型高效液相色譜儀（包括2489型PAD檢測器、Empower Pro工作站，美國Waters公司），Centra-20型紫外-可見分光光度計(jì)（GBC科學(xué)儀器有限公司），AG-135型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司），KDM型調(diào)溫電熱套（山東鄄城光明儀器有限公司），DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器有限公司），GZX-GF101-2-BS-Ⅱ/H型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-201415，供定量測定用，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以96.2%計(jì)）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-201409，供定量測定用，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以91.9%計(jì)）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715-201016，供定量測定用，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以94.0%計(jì)），中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

金銀花、槐花、黃芩等飲片購自新疆玖元堂中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院李永和主任中藥師鑒定，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)項(xiàng)下要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法

取金銀花、槐花、黃芩等飲片，加入10倍量水，浸泡1 h，提取2次，每次2 h。檢測提取液中綠原酸、蘆丁、黃芩苷的含量，以及浸膏得率，計(jì)算綜合評(píng)分。

2.2 綠原酸、蘆丁、黃芩苷定量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件

XTerra C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～20 min，13%A；20～30 min，13%～18%A；30～55 min，18%～20%A；55～65 min，20%～23%A）；流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 ?L；柱溫30 ℃；綠原酸檢測波長為327 nm，黃酮類成分檢測波長為256 nm。色譜圖見圖1。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、蘆丁、黃芩苷對(duì)照品適量，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇配成濃度分別為0.50、0.54、0.30 mg/mL的對(duì)照品溶液。加甲醇分別制成一定濃度的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

按照各試驗(yàn)參數(shù)設(shè)計(jì)對(duì)藥材進(jìn)行提取，放冷，將提取液經(jīng)紗布過濾，取濾液20 mL蒸干，加甲醇5 mL溶解，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方量稱取除去金銀花或黃芩的樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，分別進(jìn)樣1、4、8、10、12、14 ?L，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。綠原酸Y=13 601 155.63X+435 940.02（r=0.999 0），線性范圍0.50～7.00 ?g；蘆丁Y=18 925 224.34X-273 481.69（r=0.999 7），線性范圍2.16～7.56 ?g；黃芩苷Y=20 884 554.03X-21 504.29（r=0.999 4），線性范圍0.30～4.20 ?g。

2.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸、蘆丁、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.74%、1.84%、2.58%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 ?L，記錄色譜峰面積，計(jì)算綠原酸、蘆丁、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.67%、2.48%、1.71%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按處方量精密稱取飲片6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜峰面積，計(jì)算綠原酸、蘆丁、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.18%、1.81%、1.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知濃度的待測溶液6份，分別精密加入綠原酸、蘆丁、黃芩苷2.85、3.60、1.55 mg，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，其平均回收率分別為101.13%、102.74%、101.99%，RSD分別為1.86%、1.67%、1.89%。結(jié)果表明，本方法有良好的回收率。

2.3 浸膏得率測定

精密量取供試品溶液50 mL，置于已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸干，轉(zhuǎn)移至烘箱內(nèi)，105 ℃干燥至恒定質(zhì)量，取出，置干燥器中冷卻至室溫，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 提取次數(shù)初步考察

將加水倍數(shù)固定為10倍，浸泡時(shí)間固定為1 h，提取時(shí)間固定為2 h，分別按1、2、3次進(jìn)行提取，結(jié)果綜合評(píng)分在1～3次呈增加趨勢，但提取2次與3次相差不大，見圖2。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況，選取2次作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取次數(shù)。

2.4.2 提取時(shí)間初步考察

將提取次數(shù)固定為2次，加水倍數(shù)固定為10倍，分別按1、1.5、2、2.5 h進(jìn)行提取，結(jié)果綜合評(píng)分在1～2 h呈增加趨勢，在2～3 h呈遞減趨勢，見圖3。故2 h為最佳提取時(shí)間。

2.4.3 浸泡時(shí)間初步考察

將提取次數(shù)固定為2次，加水倍數(shù)固定為10倍，提取時(shí)間固定為2 h，按浸泡時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5 h進(jìn)行提取，結(jié)果綜合評(píng)分在0.5～1 h呈增加趨勢，在1～2.5 h呈遞減趨勢，見圖4。故1 h為最佳浸泡時(shí)間。endprint

2.4.4 加水倍數(shù)初步考察

將提取次數(shù)固定為2次，提取時(shí)間固定為2 h，加水倍數(shù)分別按8、10、12、14、16倍進(jìn)行提取，結(jié)果綜合評(píng)分在8～10倍呈增加趨勢，在10～14倍呈遞減趨勢，見圖5。故10倍為最佳加水倍數(shù)。

2.5 提取工藝優(yōu)選

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按處方量精密稱取飲片，根據(jù)各因素的特點(diǎn)及影響程度，確定綜合評(píng)分=綠原酸×0.4+總黃酮×0.4+浸膏得率×0.2（總黃酮=蘆丁×0.5+黃芩苷×0.5），選擇提取時(shí)間（A）、浸泡時(shí)間（B）、加水倍數(shù)（C）為自變量，綠原酸、蘆丁、黃芩苷含量為因變量，采用Design-Expert8.0.4軟件Central Composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行研究，結(jié)果見表1。

2.5.2 模型的擬合

采用方差分析對(duì)各因素進(jìn)行多元二次回歸，得回歸方程Y=80.72+1.56A+0.70B+2.79C-0.16AB+0.37AC-0.58BC-1.91A2-0.19B2-1.29C2。從表2可以看出，A、C、A2、C2具有顯著影響，影響程度為C>A>B；失擬項(xiàng)P>0.05，表明失擬不顯著；r=0.940 8，表明該模型擬合較好，試驗(yàn)誤差小，可用該模型對(duì)不同條件下的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行測定。根據(jù)回歸分析結(jié)果繪制三維響應(yīng)面圖，見圖6。

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過對(duì)數(shù)據(jù)的綜合分析，最佳提取工藝為：浸泡時(shí)間63.28 min，加12倍量水，提取時(shí)間135.01 min；結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)確定最佳工藝為浸泡60 min，加12倍量水，提取130 min。按處方量稱取3份飲片，每份176 g（其中金銀花、槐花、黃芩各10 g），按優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果綠原酸、蘆丁、黃芩苷平均質(zhì)量濃度分別為55.28、69.26、26.78 ?g/g；浸膏得率為33.72%，綜合評(píng)分與預(yù)測值的偏差為1.66%，表明該二項(xiàng)式模型擬合效果良好，可信度較高。

3 討論

本研究在單因素試驗(yàn)中通過考察多個(gè)水平，篩選出各因素的最佳提取方案，縮小進(jìn)入響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的范圍；在工藝的優(yōu)選上，固定提取次數(shù)為2次，以浸泡時(shí)間、加水倍數(shù)、提取時(shí)間為主要影響因素，3味君藥主要成分的含量和浸膏得率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)選銀槐解毒顆粒最佳水提工藝。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)的綜合分析可以看出，加水倍數(shù)和提取時(shí)間對(duì)該處方提取工藝有顯著影響，且加水倍數(shù)的影響大于提取時(shí)間；浸泡時(shí)間對(duì)該處方提取工藝并無顯著影響，考慮可能該處方中以花類藥物為主，根莖類藥材較少，故浸泡時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分無顯著影響，與理論預(yù)期較為符合。在驗(yàn)證試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，預(yù)測值與真實(shí)值比較接近，測定結(jié)果穩(wěn)定，且3個(gè)成分的轉(zhuǎn)移率分別為綠原酸85.60%（處方中山楂和菊花也含有綠原酸[8]）、黃芩苷83.12%、蘆丁73.32%，表明優(yōu)選的最佳水提工藝對(duì)3種指標(biāo)性成分提取效率高，可以成為中試生產(chǎn)的依據(jù)。

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（收稿日期：2017-06-13）

（修回日期：2017-07-17；編輯：陳靜）endprint