三大基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介及其在畜牧育種中的研究進(jìn)展

時(shí)偉程

【摘 要】隨著社會(huì)的進(jìn)步和人們對(duì)美好社會(huì)需求的不斷提高，基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。本文對(duì)基因編輯的三大技術(shù)方法進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹，同時(shí)對(duì)其在畜牧育種中的研究進(jìn)行綜述，并對(duì)未來(lái)基因編輯技術(shù)進(jìn)行展望，以期為進(jìn)一步研究基因編輯技術(shù)提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】基因編輯技術(shù)；畜牧育種

基因編輯（Gene Editing）技術(shù)是指一種對(duì)目的基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行插入、敲除和定點(diǎn)突變等定點(diǎn)精確修飾的生物技術(shù)。該技術(shù)主要利用人工核酸酶實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組上特定DNA片段的敲除、敲入或修飾。目前主要有三大基因編輯技術(shù)，鋅指核酸酶（ZFNs）技術(shù)，類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)。近年來(lái)，這三大技術(shù)在畜牧育種中應(yīng)用廣泛，在動(dòng)物性狀改良方面起到了巨大作用。

一、鋅指核酸酶（ZFNs）技術(shù)

鋅指核酸酶（zinc finger nucleases， ZFNs）是第一代人工核酸內(nèi)切酶，由鋅指蛋白（zinc finger proteins， ZFPs）的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)與非特異性 FokI 核酸內(nèi)切酶融合而成。ZFPs組成的 DNA 識(shí)別域包含至少三個(gè)Cys2His2鋅指蛋白可與目的基因位點(diǎn)結(jié)合，而FokI 是一種核酸內(nèi)切酶發(fā)揮“剪刀”的功能，對(duì)目的基因進(jìn)行剪切，由此達(dá)到基因編輯的。ZFPs 作為一類(lèi)特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在生物體的細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育以及基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用。

在動(dòng)物活體細(xì)胞中，Bibikova等首次利用ZFN技術(shù)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因打靶，從此， ZFNs技術(shù)開(kāi)始被廣泛應(yīng)用于多種哺乳動(dòng)物的基因編輯中。2011年，Hauschild 等將 ZFNs基因組編輯技術(shù)應(yīng)用于豬，利用基因打靶獲得了α-1，3-半乳糖基因敲除豬，為器官移植技術(shù)提供了新的思路。Whyte等將體細(xì)胞核移植技術(shù)與ZFNs技術(shù)相結(jié)合，從而獲得轉(zhuǎn)基因豬。2013年，Marron等利用ZFN技術(shù)成功在豬上敲除了MSTN基因，使得豬肌肉生長(zhǎng)抑制素的形成被破壞，從而使得豬的瘦肉率得到顯著提高。Cui等在2015年利用ZFNs技術(shù)在豬上得到新的突破，獲得了具有生長(zhǎng)激素受體的轉(zhuǎn)基因豬， 使得研究人類(lèi)疾病有了理想的新動(dòng)物模型。ZFNs技術(shù)研究在牛上研究同樣廣泛，2011年Yu 等利用ZFNs 技術(shù)，獲得了具有更高牛奶營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因牛，他們敲除了β-乳球蛋白基因，該基因在牛奶中具有致敏性。

ZFNs技術(shù)由于發(fā)現(xiàn)時(shí)間較早，研究廣泛，試驗(yàn)技術(shù)雖相對(duì)完善，但脫靶現(xiàn)象嚴(yán)重，細(xì)胞毒性大等缺點(diǎn)使其進(jìn)一步推廣應(yīng)用受到嚴(yán)重制約。

二、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)

轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（transcription activator-like effector， TALE）和 FokI 連接構(gòu)成了TALEN 結(jié)構(gòu)。在ZFNs技術(shù)之后，TALEN是第二個(gè)被廣泛認(rèn)可的基因編輯技術(shù)。TALEN技術(shù)在應(yīng)用時(shí)，首先要設(shè)計(jì)TALE的識(shí)別單元，TALE的DNA識(shí)別域由多個(gè)重復(fù)氨基酸模塊組成，這些氨基酸序列十分保守。緊接著將識(shí)別單元與FokI相結(jié)合，構(gòu)建TALEN質(zhì)粒。TALEN技術(shù)的剪切機(jī)制是依靠TALE 特異性結(jié)合到靶位點(diǎn)上，其切割域形成特異性的二聚體，可使識(shí)別位點(diǎn)間的目標(biāo)基因核苷酸實(shí)現(xiàn)斷裂，從而完成目的基因編輯。目前構(gòu)建TALEN 的方法主要有：TALEs“黃金大門(mén)”克隆法；迭代帽組裝法；固相高通量自動(dòng)連接技術(shù)；非連接酶依賴(lài)型克隆法等。

TALEN基因編輯技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多種飼養(yǎng)動(dòng)物中，2012年Carlson 等利用TALEN 技術(shù)敲除了豬細(xì)胞中多個(gè)基因，為 TALEN 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因豬上的廣泛應(yīng)用提供了研究思路。2013年， Xin等又利用該技術(shù)將豬的GGTA1基因成功進(jìn)行定點(diǎn)敲除。2014年，Li等在豬上發(fā)現(xiàn)了ROSA26 基因位點(diǎn)，并成功利用 TALEN 技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)敲入。2015年，Wu等利用 TALE技術(shù)成功在牛的常染色體中敲入小鼠的 SP110 基因，從而得到了23 頭可抵抗牛結(jié)核分枝桿菌的轉(zhuǎn)基因牛。同年在轉(zhuǎn)基因羊的研究上，Cui 等利用TALEN技術(shù)將人乳鐵蛋白敲入羊的常染色體使其替代了羊自身的β乳球蛋白，從而使得羊奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到了顯著提高。

TALEN技術(shù)相較于ZFNs技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于可以定點(diǎn)識(shí)別目標(biāo)基因，從而使得基因剪切編輯更加準(zhǔn)確高效，同時(shí)與ZFNs技術(shù)相比它的脫靶效應(yīng)以及細(xì)胞毒性都得到了有效改善。

三、CRISPR/Cas9技術(shù)

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種由RNA介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)的興起引發(fā)了基因編輯領(lǐng)域新的革命。CRISPR是從對(duì)真菌和古菌宿主的研究中衍生而來(lái)的，1987年日本的Ishino等，在大腸桿菌的DNA中發(fā)現(xiàn)有串聯(lián)間隔重復(fù)序列的特殊結(jié)構(gòu)交替出現(xiàn)。一直到2012年，這種重復(fù)序列才被命名為規(guī)律性聚簇間隔短回文重復(fù)即CRISPR。CRISPR系統(tǒng)可分為三大類(lèi)型： I型、II型和III型，CRISPR/Cas9便屬于II型，II型系統(tǒng)相較于其他類(lèi)型，結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單， 只需要一個(gè)Cas9蛋白來(lái)識(shí)別目的基因序列。現(xiàn)在最簡(jiǎn)便且應(yīng)用最廣泛的CRISPR/Cas9 技術(shù)是將利用sgRNA引導(dǎo)Cas9 蛋白識(shí)別特定基因序列的PAM區(qū)，造成雙鏈 DNA 斷裂，并啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制。

目前CRISPR/Cas9技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。2014年，Hai等利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯豬的vWF基因，從而為治療血管性血友病提供了新的研究模型。2015年，水牛 BMP15 和 GDF9 基因被CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行編輯，從而加快了水牛繁殖性能的提高。2016年， Han等使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了豬的Hoxc13基因， 從而為人類(lèi)治療外胚層發(fā)育不良提供了模型。2016年，在我國(guó)新疆，利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功培育出具有不同毛色的轉(zhuǎn)基因綿羊。2017年，Gao 等首次將NRAMP1基因利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲入奶牛的基因組中，成功獲得了轉(zhuǎn)基因奶牛共11頭，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，11頭奶牛均未發(fā)生脫靶效應(yīng)，說(shuō)明CRISPR/Cas9技術(shù)可使基因編輯脫靶效應(yīng)降低，從而為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因家畜提供理論基礎(chǔ)。此外，CRISPR/Cas9技術(shù)在小鼠細(xì)胞、恒河猴、食蟹猴、小鼠和人上均有相關(guān)研究報(bào)道。

CRISPR/Cas9技術(shù)與TALEN技術(shù)和ZFNs技術(shù)相比， 其切割效率相對(duì)較高且操作簡(jiǎn)單。同時(shí)，能夠更為精確且高效的對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，并且同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)的編輯。CRISPR/Cas9 技術(shù)目前還具有一定的局限性，其受到 PAM 元件的制約，不能完全識(shí)別特異性的DNA序列。

四、展望

基因編輯技術(shù)被認(rèn)為是一種理想的基因操作手段，至今已達(dá)到一定的高度，具有效率高、定向編輯準(zhǔn)確性高、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)。隨著科學(xué)的快速發(fā)展，基因編輯技術(shù)必將不斷完善，通過(guò)敲除和敲入等手段獲得家畜優(yōu)良的生產(chǎn)性狀，加快我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的速度，從而為改善國(guó)民生活做出貢獻(xiàn)，此外也可利用基因編輯技術(shù)，建立動(dòng)物研究模型，使其在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)方面更好的為人類(lèi)服務(wù)。此外，基因編輯技術(shù)還存在脫靶率高、特異性以及效率低等問(wèn)題，更加有效的利用基因編輯技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。隨著科學(xué)的發(fā)展，各種各樣的基因編輯工具不斷更新，使得人們對(duì)基因編輯的研究也更加深入，不過(guò)想要真正將其應(yīng)用于畜牧育種中，還需科技工作者繼續(xù)努力。

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