外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展

周曉雯，李鷹揚(yáng)，劉 政，袁小龍，陳雨航，謝小波

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，研究認(rèn)為該病的發(fā)生與軟骨退變、軟骨下骨退化、關(guān)節(jié)力學(xué)改變、神經(jīng)傳導(dǎo)異常等相關(guān)[1-2]。由于發(fā)病機(jī)制不詳，目前也缺乏特異性的治療手段。近幾年隨著外泌體研究的興起，探索外泌體和OA的關(guān)系逐漸成為骨科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3-6]。

外泌體是細(xì)胞主動(dòng)向胞外分泌的大小均一的囊泡樣小體，主要來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，直徑40～100 nm。研究表明，外泌體主要參與細(xì)胞之間的通訊過(guò)程，具有抗腫瘤免疫、促血管新生等生理功能，在遞呈抗原、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)遷移、修復(fù)損傷組織等多種生理及病理學(xué)過(guò)程中起到重要作用，在某些疾病的早期診斷及藥物靶向治療方面也展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[7-11]。由于外泌體來(lái)源多樣，不同細(xì)胞系來(lái)源的外泌體在OA發(fā)展進(jìn)程中的作用機(jī)制不盡相同。本文探討不同細(xì)胞系來(lái)源的外泌體在OA發(fā)病進(jìn)程中的作用機(jī)制，以期為OA治療研究提供新的思路。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來(lái)源外泌體與OA

維持正常的骨軟骨微環(huán)境能夠促進(jìn)骨軟骨組織的良好發(fā)育、自我平衡與修復(fù)等，但在OA等疾病狀態(tài)下，這一微環(huán)境受到破壞。目前骨科領(lǐng)域研究者對(duì)MSCs關(guān)注的焦點(diǎn)之一就在于其通過(guò)所分泌的外泌體，在促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)、組織生成及修復(fù)過(guò)程中表現(xiàn)出來(lái)的治療作用[12-14]。

MSCs外泌體參與調(diào)節(jié)的軟骨修復(fù)機(jī)制之一，是外泌體在CD73介導(dǎo)下激活了蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而加速了軟骨細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)；使用AKT或ERK磷酸化抑制劑可抑制外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移增加，而通過(guò)CD73抑制劑和腺苷受體拮抗劑削弱AKT和ERK信號(hào)傳導(dǎo)，可使軟骨細(xì)胞的增殖速度減慢，證實(shí)了外泌體CD73對(duì)軟骨細(xì)胞修復(fù)的促進(jìn)作用[15]。而這一功能是通過(guò)多種細(xì)胞類(lèi)型協(xié)調(diào)動(dòng)員和多個(gè)細(xì)胞過(guò)程激活而實(shí)現(xiàn)的。

1.1 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）來(lái)源外泌體

SMSCs是從滑膜組織中分離出來(lái)的具有強(qiáng)大分化功能的間質(zhì)干細(xì)胞，具有軟骨再生能力[16-17]。Guo等[18]的一系列體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SMSCs外泌體可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs）的增殖，同時(shí)具有抗凋亡能力，對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨壞死有預(yù)防作用。Tao等[19]進(jìn)一步對(duì)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）活化的機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從miR-140修飾細(xì)胞中提取的外泌體（SMSC-140-Exos）所攜帶的Wnt5a和Wnt5b，可通過(guò)替代Wnt信號(hào)通路激活YAP，YAP活化后利于軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，顯著降低了早期軟骨細(xì)胞分化的標(biāo)志基因——Sox9的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)分泌；同時(shí)，Wnt5a和Wnt5b在另一條通路中通過(guò)核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κ B）和 c-Jun 氨 基 末 端 激 酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）來(lái)抑制軟骨細(xì)胞肥大，促進(jìn)軟骨細(xì)胞繼續(xù)分化為成骨細(xì)胞，這些結(jié)果均提示，SMSC-140-Exos對(duì)OA或有一定的預(yù)防和治療效果。通過(guò)基因技術(shù)修飾外泌體，可能是未來(lái)OA的治療策略之一。

1.2 BMSCs來(lái)源外泌體

Cosenza等[20]發(fā)現(xiàn)，在OA患者的軟骨細(xì)胞中，BMSCs來(lái)源的外泌體可通過(guò)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞標(biāo)志物Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的表達(dá)，使軟骨細(xì)胞免于凋亡并抑制巨噬細(xì)胞活化。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，BMSCs來(lái)源外泌體可表現(xiàn)出類(lèi)似的軟骨保護(hù)和抗炎功能[21-22]，從而揭示外泌體對(duì)OA有一定的預(yù)防和治療作用。

1.3 胚胎干細(xì)胞源性間充質(zhì)干細(xì)胞（embryonic stem cell derived-mesenchymal stem cells，ESCMSCs）來(lái)源外泌體

ESC-MSCs是由胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的MSCs，具有與BMSCs相似的生物學(xué)功能。Wang等[23]的研究結(jié)果表明，ESC-MSCs外泌體通過(guò)促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白合成，及降低經(jīng)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β處理的血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶5（A disintegrin and metallo-proteinase with thrombospondin 5，ADAMTS5）表達(dá)水平來(lái)維持軟骨細(xì)胞的表型；進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射ESC-MSCs可減輕軟骨破壞和基質(zhì)降解，這一效應(yīng)是通過(guò)ESC-MSCs來(lái)源外泌體的作用實(shí)現(xiàn)的，而關(guān)節(jié)內(nèi)注射ESC-MSCs來(lái)源外泌體，可在內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)動(dòng)物模型中成功阻礙對(duì)軟骨的破壞進(jìn)程。因此人們推測(cè)，ESC-MSCs產(chǎn)生的外泌體可能通過(guò)平衡軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，起到對(duì)OA的治療作用。

1.4 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ASCs）來(lái)源外泌體

Maumus等[24]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASCs的分泌物能阻止軟骨細(xì)胞出現(xiàn)與OA相關(guān)的退化，ASCs-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后可維持聚集蛋白聚糖和Sox9的表達(dá)，ColⅡB表達(dá)降低，透明質(zhì)酸和蛋白聚糖連接蛋白1表達(dá)增加；而肥大軟骨細(xì)胞標(biāo)記物基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-13、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和Runx2的表達(dá)水平顯著降低，ColⅩ趨于減少，證實(shí)ASCs在保護(hù)軟骨細(xì)胞免于凋亡及成熟軟骨細(xì)胞表型喪失方面具有強(qiáng)有力的作用。

1.5 誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells derived-mesenchymal stem cell，iMSC）來(lái)源外泌體

Zhu等[25]對(duì)iMSC分泌的外泌體（iMSC-Exos）和SMSCs分泌的外泌體（SMSC-Exos）治療小鼠OA的效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)軟骨細(xì)胞的遷移和增殖均有促進(jìn)作用，但前者更能顯著增強(qiáng)小鼠軟骨細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和增殖能力，治療效果更佳。由于iMSC可從患者體內(nèi)獲得，不涉及倫理問(wèn)題，因此iMSC-Exos作為治療OA的潛在方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體與OA

成骨細(xì)胞是骨形成的關(guān)鍵細(xì)胞，其分泌的外泌體通過(guò)真核起始因子2（eukaryotic initiation factor，EIF2）信號(hào)通路完成調(diào)控成骨的功能。其機(jī)制為，外泌體通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)令EIF2α磷酸化來(lái)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子4mRNA的翻譯水平，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及骨形成增加[26]，而新形成的成骨細(xì)胞再次分泌外泌體激活通路，形成正反饋循環(huán)機(jī)制。其中EIF2α的磷酸化水平可用于評(píng)估骨疾病的嚴(yán)重程度。

runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）是BMSCs向成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[27]。Cui等[28]將礦化的前成骨細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面出現(xiàn)成骨標(biāo)志；而Runx2和ALP表達(dá)上調(diào)，基質(zhì)的礦化程度增加，也提示成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體能促進(jìn)BMSCs分化為成骨細(xì)胞[29]。也就是說(shuō)，可以通過(guò)抑制Runx2的降解來(lái)達(dá)到促進(jìn)成骨的目的，這為OA治療提供了新的途徑。

Deng等[30]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，成骨細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中含有RANKL蛋白，其通過(guò)與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面上的RANK靶向結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的RANKL-RANK通路，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成，增強(qiáng)骨的吸收活性。

Priam等[31]從經(jīng)特殊處理的壓縮成骨細(xì)胞分泌的外泌體中提取出14-3-3蛋白來(lái)刺激軟骨細(xì)胞，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的mRNA水平顯著降低，進(jìn)而引起軟骨損傷；有研究者將OA患者軟骨下骨的成骨細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其分泌物能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變并進(jìn)一步分化[32]。由此可見(jiàn)，成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體通過(guò)介導(dǎo)成骨細(xì)胞間的通訊交流來(lái)參與骨重建機(jī)制，在軟骨細(xì)胞的破壞和分化中起到重要作用。

3 破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體與OA

破骨細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-214-3p抑制了成骨細(xì)胞的形成。Sun等[33]發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞分泌含有miRNA的外泌體，其中包括骨重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑miR-214，且能通過(guò)Runx和β-catenin等通路影響成骨細(xì)胞的分化。Li等[34]分別提取骨折和非骨折老年女性患者成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞外泌體的miRNA，同時(shí)建立小鼠模型并進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)果表明，提高破骨細(xì)胞中miR-214-3p的表達(dá)水平可抑制骨形成，降低成骨細(xì)胞活性。破骨細(xì)胞前體分泌的外泌體還可刺激破骨細(xì)胞形成，而成熟的破骨細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體則通過(guò)與RANKL特異性結(jié)合形成通路，來(lái)抑制破骨細(xì)胞的生成[35-37]。對(duì)破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成的機(jī)制進(jìn)行深入研究，有望為OA患者提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

4 軟骨、軟骨下骨細(xì)胞來(lái)源外泌體與OA

López-Ruiz等[38]的研究證實(shí)，OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞提取出的外泌體能誘導(dǎo)髕下脂肪墊提取的MSCs分化為軟骨細(xì)胞，隨后軟骨細(xì)胞進(jìn)一步增殖和分化，形成循環(huán)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）受體在OA軟骨中呈高水平表達(dá)[39]；而在IL-1β處理過(guò)的軟骨細(xì)胞外泌體培養(yǎng)基中可檢測(cè)到更高水平的NGF，這可能是軟骨細(xì)胞對(duì)IL-1β促炎效應(yīng)的細(xì)胞反應(yīng)之一。

Leyh等[40]將OA軟骨下骨細(xì)胞、BMSCs、BMSCs與OA軟骨下骨細(xì)胞、BMSCs與正常軟骨細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)膠原蛋白基因COL1A1、COL2A1等的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨細(xì)胞分泌的外泌體能夠抑制BMSCs分化成軟骨細(xì)胞，同時(shí)抑制軟骨細(xì)胞的增殖分化。

5 其他細(xì)胞來(lái)源外泌體與OA

眾所周知，IL-1β在軟骨降解和OA發(fā)病過(guò)程中起到重要作用[7,41]，滑膜成纖維細(xì)胞（synovial fibroblast，SFB）分泌的外泌體經(jīng)IL-1β刺激后可進(jìn)一步誘導(dǎo)軟骨生長(zhǎng)。Kato等[42]分別以未被IL-1β刺激和經(jīng)IL-1β刺激的SFB外泌體與小鼠股骨頭軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，后者能分泌更多的外泌體，亦能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞釋放更多的蛋白多糖，并可在體外模型中引起類(lèi)似OA的表現(xiàn)。

亦有研究表明，經(jīng)樹(shù)突狀來(lái)源外泌體（DCex）作用后的MSCs其ALP活性升高，并表達(dá)成骨細(xì)胞標(biāo)志物——Runx2轉(zhuǎn)錄因子，提示DCex能誘導(dǎo)MSCs分化成成骨細(xì)胞，修復(fù)已被破壞的骨質(zhì)，對(duì)OA有一定的治療效果[43]。

綜上，外泌體既可緩解OA的病理變化，又能促進(jìn)OA的發(fā)展，其作用取決于外泌體的來(lái)源以及其所處的微環(huán)境。

6 小結(jié)

國(guó)內(nèi)外諸多研究表明，外泌體參與OA的多種生理及病理學(xué)過(guò)程，但其在OA發(fā)病進(jìn)程中的作用機(jī)制目前尚不十分清楚。盡管外泌體廣泛存在于人類(lèi)體液中，在一定條件下能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞生成，但將其作為治療手段，目前尚未進(jìn)入臨床研究；即使通過(guò)基因調(diào)控能夠?qū)崿F(xiàn)靶向治療，但無(wú)論是生產(chǎn)和提純，還是靶向輸送問(wèn)題，目前均無(wú)解決方案。然而隨著研究的不斷深入，相信外泌體研究作為一個(gè)新的方向，在OA治療中將大有可為。