基于RNAi的轉基因作物研發(fā)進展

張守路 饒力群 汪啟明

摘要 轉基因技術作為現(xiàn)代生物技術的重要組成部分，在緩解資源匱乏、提高糧食產(chǎn)量、保護生態(tài)環(huán)境安全、拓展農(nóng)業(yè)功能等方面做出巨大貢獻。RNAi是迅速發(fā)展起來的一種新興基因阻斷技術，近年來，在作物防治病蟲害和品質改良方面取得了顯著成效，商業(yè)化應用已成為現(xiàn)實。因此，基于RNAi的轉基因作物研發(fā)現(xiàn)狀越來越受到人們的關注。本文就已產(chǎn)業(yè)化的RNAi轉基因產(chǎn)品、RNAi轉基因植物的研究進展及對RNAi轉基因作物安全評價研究展望進行綜述。

關鍵詞 核酸干擾技術；轉基因作物；基因沉默；安全評價

中圖分類號 S188；Q785 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）21-0003-02

Advances in Research and Development of Genetically Modified Crops Based on RNAi

ZHANG Shou-lu RAO Li-qun WANG Qi-ming *

（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128）

Abstract As an important part of modern biotechnology，genetically modified technology has made great contributions to alleviating resource shortage，increasing food production，protecting ecological environment and expanding agricultural functions. RNA interference（RNAi）is an emerging genetic blocking technology which developed rapidly. In recent years，remarkable achievements have been made in crop pest control and quality improvement，and commercial application has become a reality. Therefore，the research and development status of RNAi-based transgenic crops has attracted more and more attention. In this paper，the research progress of the industrialized RNAi transgenic products，RNAi transgenic plants and the safety evaluation research prospects of RNAi genetically modified crops were summarized.

Key words RNA interference technology；genetically modified crop；gene silencing；safety evaluation

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘導細胞內(nèi)同源mRNA高效特異性降解，從而使特定基因表達受抑制或使其沉默的現(xiàn)象[1]。雙鏈RNA（dsRNA）是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補的單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）的降解。在ATP作用下，經(jīng)過Dicer酶（一種具有RNAaseⅢ活性的核酸酶）的加工，細胞中較長的dsRNA（30 bp以上）首先被降解形成21～25 bp的小分子干擾核糖核酸（short interfering RNA，siRNA），并有效地定位目標mRNA。siRNA具有特殊的結構特征，即5′端磷酸基團和3′端的羥基，其2條鏈的3′端各有2個堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈指導合成一種被稱為RNA誘導的沉默復合體（RISC）核蛋白體，再由RISC介導切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域，從而實現(xiàn)干擾靶基因表達的功能。

RNAi技術具有序列的高度特異性、抑制基因表達的高效性、沉默信號的高穩(wěn)定性、沉默信號的可遺傳性和可傳遞性的特點。

1 已商業(yè)化應用的RNAi轉基因植物產(chǎn)品

RNAi以其序列特異性的優(yōu)勢廣泛應用于阻斷或抑制基因表達，這也使得它成為轉基因植物研發(fā)的強大工具。RNAi作為新型轉基因技術已經(jīng)在植物抗病蟲害和品質改良等方面得到了廣泛應用，一批RNAi轉基因植物開始商業(yè)化應用。

1.1 基于RNAi的抗蟲轉基因植物產(chǎn)品

由于Bt抗蟲轉基因作物大面積連年種植，害蟲產(chǎn)生了較強的抗性。因此，研發(fā)新的轉基因抗蟲作物刻不容緩。以表達V-ATPase dsRNA的轉基因玉米喂養(yǎng)玉米根蟲，發(fā)現(xiàn)根蟲的該基因表達量下降，玉米根部受損程度明顯降低[2]；當以表達CYP6AE14 dsRNA的轉基因擬南芥和煙草喂養(yǎng)棉鈴蟲時，該基因在蟲體中腸里的表達量下降，幼蟲生長發(fā)育減緩[3]。此外，棉鈴蟲取食在棉花中表達的半胱氨酸蛋白酶后更易吸收dsRNA[4]。另外，發(fā)現(xiàn)參與膜受體運輸?shù)腟nf7基因在玉米根蟲的防治上效果更顯著，孟山都公司研發(fā)的轉基因玉米MON87411含有玉米根蟲DvSnf7基因的dsRNA，根蟲取食該轉基因玉米后體內(nèi)的基因就會被DvSnf7 dsRNA靶向結合并干擾，進而致死[5]。轉基因玉米MON87411已在美國、巴西、日本等8個國家和地區(qū)通過轉基因安全評價，并已向我國申請進口安全證書。

我國在轉基因重大專項的支持下，RNAi轉基因植物的研發(fā)也取得了很大進展。中國科學院微生物研究所通過RNAi抑制棉花黃萎病原真菌大麗輪枝菌中致病基因的表達，開發(fā)了抗黃萎病棉花，抗性較對照處理提高了20%以上[6]；中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所和南京農(nóng)業(yè)大學通過RNAi技術阻斷棉鈴蟲保幼激素合成，獲得了抗蟲轉基因棉花，尤其對于Bt抗性棉鈴蟲品系有很好的防治效果[7]。

1.2 基于RNAi的品質改良轉基因植物產(chǎn)品

蘋果、馬鈴薯等果蔬在生產(chǎn)、貯藏、加工等過程中經(jīng)常出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，產(chǎn)生異味，損失營養(yǎng)，造成巨大的經(jīng)濟損失。科學研究發(fā)現(xiàn)，植物組織的褐變與多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）有關，抑制多酚氧化酶活性可以減弱作物的褐變程度。奧卡諾根特色水果公司利用RNAi技術抑制蘋果體內(nèi)多酚氧化酶基因（PGAS PPO suppression gene），研發(fā)了轉基因蘋果GD743等3個轉化體，能減緩蘋果褐化，已在美國和加拿大通過了轉基因安全評價并已商業(yè)化應用；辛普勞公司利用RNAi技術抑制asn1和ppo5基因，研發(fā)了轉基因馬鈴薯E12，能夠減少黑斑，降低致癌物質丙烯酰胺的含量，已在美國、加拿大、澳大利亞等5個國家通過轉基因安全評價和商業(yè)化應用。利用RNAi技術降低支鏈淀粉等物質含量，改良作物品質，已在玉米、水稻、小麥等作物中得到廣泛應用，獲得了一系列有產(chǎn)業(yè)化價值的轉基因材料。

可見，RNAi已成為新型轉基因植物研發(fā)的重要類型，既有國外產(chǎn)品陸續(xù)問世并期望進入我國市場，國內(nèi)自主研發(fā)的RNAi轉基因產(chǎn)品也不斷出現(xiàn)。

2 RNAi轉基因植物的研發(fā)進展

2.1 特異轉化體構建

RNAi是轉入的非編碼的核酸序列，其發(fā)揮作用是依靠影響靶基因的表達而體現(xiàn)出來的，涉及到對靶基因表達的干擾效果以及非靶標的影響等方面。要綜合考慮不同靶位點、不同干擾片段劑量和不同檢測時間的干擾效果進行構建特異轉化體。楊中俠等[8]通過對比試驗構建了70 nL劑量CAD1位點對應的dsRNA注射到幼蟲體內(nèi)48 h后干擾效果最佳的RNAi沉默小菜蛾類鈣粘蛋白基因體系。李 嬌等[9]成功構建了注射CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ靶位點2種dsRNA 1.5 ng劑量，在96 h后作用最強的沉默稻縱卷葉螟幾丁質合成酶A基因的體系。張淑靜等[10]構建了注射針對vatp1亞基位點合成的dsRNA 100 nL劑量，在72 h后，V-ATPase H亞基mRNA表達幾乎被完全抑制的沉默東方粘蟲V-ATP酶H亞基的體系。Zha等[11]利用RNAi轉基因水稻靶向表達褐飛虱中腸里高表達的Nltry、Nlcar和NIHT1這3個基因的dsRNA，發(fā)現(xiàn)褐飛虱在進食這種轉基因水稻之后發(fā)生了RNAi效應，最終表現(xiàn)為中腸里的這3個基因的表達量明顯下降。

2.2 遺傳轉化方法

植物遺傳轉化和轉化體的篩選是植物基因工程的重要環(huán)節(jié)，目前在植物遺傳轉化中運用較多的是載體法和外源目的DNA直接轉化法兩大類。其中，載體法主要包括農(nóng)桿菌Ti或Ri質粒介導法、葉盤法、真空滲入法、原生質體法、脂質體法、原生質球法；另外，基于載體法，新的轉基因方法[12]有基于AC/DS轉座系統(tǒng)建立的轉化載體、利用噬菌體P1Cre-lox位點的特異性重組系統(tǒng)、利用酵母線粒體I-SceI核酸內(nèi)切酶特異性誘導植物DNA雙鏈斷開引起的同源重組系統(tǒng)、利用雙元細菌人造染色體載體系統(tǒng)等，可以提高轉化率或轉基因位點質量。Liang等[13]構建了由胚乳特異啟動子啟動的小麥籽粒PPO基因IR-RNAi載體（正義臂和反義臂之間插入了擬南芥FAD2的intron9），并已成功轉化小麥。

外源目的DNA直接轉化法包括基因槍法、化學藥劑誘導法、花粉管通道法，此外，其他遺傳轉化方法還有顯微注射法、激光微束穿刺法、多聚陽離子基因導入法等，均在不同植物上有成功的應用。盧東長城[14]實驗室用基因sbeIIb和sbeI的末端編碼區(qū)（約200 bp）、3′末端非編碼區(qū)（3′-untran-slatedregion，3′-UTR）構建了2個Sense-RNAi載體和2個hpRNAi載體，用基因槍同時或分別轉化玉米，得到了穩(wěn)定遺傳的高直鏈淀粉轉基因玉米。

不管是載體法還是外源目的DNA直接轉化法，RNAi的載體與傳統(tǒng)轉基因載體無明顯差異，使用時要根據(jù)不同植物、不同受體等多種因素選擇最佳方法。

2.3 轉化體篩選方法

目前，應用于轉基因植株的篩選鑒定方法主要為利用標記基因進行鑒定、分子檢測和免疫技術三大類。由于RNAi轉基因無表達蛋白，只能通過在DNA和RNA水平進行檢測。孫重霞等[15]通過PCR、Southern雜交、半定量RT-PCR、Northern雜交、酶活篩選等分子檢測方法對RNAi抑制小麥籽粒PPO轉基因植株及其后代株系進行篩選。張 燕等[16]同樣利用了RT-PCR、PCR方法對RNAi防治水稻條紋葉枯病植株進行了鑒定。

3 RNAi轉基因植物產(chǎn)品的安全評價展望

隨著RNAi技術在轉基因作物中應用的深入和RNAi轉基因作物逐漸商業(yè)化的推廣，RNAi轉基因技術所可能產(chǎn)生的風險和其產(chǎn)品的安全性也越來越受到人們的關注。對RNAi轉基因作物的安全評價尤為重要，但目前國內(nèi)尚無專門針對基于RNAi的轉基因產(chǎn)品安全評價指南。因此，根據(jù)RNAi的轉基因特性，提出幾點建議。

3.1 非預期效應的出現(xiàn)

相對于傳統(tǒng)轉基因植物，RNAi轉基因植物的安全評價與傳統(tǒng)轉基因植物要更加關注dsRNA在植物細胞內(nèi)的插入位點、穩(wěn)定性和序列的特異性。明確插入位點在染色體上的準確位置，確定是否會對體內(nèi)基因的表達造成影響。更長周期地觀察插入的干擾片段能否穩(wěn)定高效地表達和遺傳，建議至少跟蹤觀察規(guī)模種植后3代以上轉基因植物的穩(wěn)定性。由于核酸序列在生物體內(nèi)代謝的復雜性，需要更加全面和系統(tǒng)地比對特異RNAi干擾序列與植物基因組序列、生物圈相關生物體以及相關微生物基因組序列的互補情況，明確是否會影響非目標基因的表達而對植物的生長代謝和品質等造成影響。

3.2 對非靶標生物的影響

RNAi轉基因作物的殺蟲作用方式是通過昆蟲攝食進入其體內(nèi)。因此，應該建立農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性數(shù)據(jù)庫，明確接觸RNAi轉基因作物的生物種類，并且建立這些種類生物的基因組數(shù)據(jù)庫，了解與siRNA具有同源性序列的基因的表現(xiàn)型，以確定RNAi轉基因作物的殺蟲活性譜[17]。明確RNAi轉基因作物是否會對土壤微生物產(chǎn)生影響，是否存在通過基因飄移siRNA影響其他作物的基因表達等。另外，RNAi轉基因作物產(chǎn)品中雖然沒有外源蛋白質的表達，但要按照現(xiàn)有轉基因作物食用安全評價標準確定dsRNA是否對人體生理功能產(chǎn)生影響。

4 結語

基因編輯CRISPR/Cas9利用同源重組可使特定基因功能完全失活，但存在脫靶效應，且對于多倍體植物而言，基因組改造的難度很大。而RNAi操作較簡便，耗時較短，在不改變基因組DNA序列的情況下抑制或降低靶基因表達。盡管RNAi技術存在抑制效率不一致等不足，但作為一種高效、特異性的基因阻斷技術，在植物抗病蟲害、作物品質改良及提升作物經(jīng)濟價值等領域的應用愈發(fā)凸顯[18]。在以后RNAi轉基因作物產(chǎn)品的研發(fā)過程中應確保干擾序列的特異性、精確控制dsRNA的劑量、杜絕對非靶標基因的影響，讓RNAi 技術在生命科學應用領域發(fā)揮更加重要的作用。

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