大腸桿菌表面感應(yīng)機(jī)制研究進(jìn)展

王立亮，高春輝，吳一超，黃巧云，蔡鵬

大腸桿菌是人和動(dòng)物胃腸道的主要兼性厭氧菌群，包括共生性和致病性2種類型，既能在人或動(dòng)物宿主體內(nèi)存活，也能在環(huán)境中傳播[1]。致病性大腸桿菌在環(huán)境中的傳播嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物的健康，每年造成大量的感染和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。糞肥和污水中的致病性大腸桿菌可經(jīng)土壤傳播到農(nóng)作物的根系或表面，進(jìn)入食品產(chǎn)業(yè)鏈，威脅人體健康[3-5]。

環(huán)境中的大腸桿菌能吸附在各種生物（植物根系或葉片）和非生物（土壤顆粒）表面，形成生物膜以存活和傳播[1]。生物膜的形成過程主要包括以下5個(gè)步驟。1）初始吸附，通常是可逆過程[6-7]；2）緊密吸附，即微生物通過分泌DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及多糖等胞外聚合物，改變自身的生理生化狀態(tài)，與表面發(fā)生緊密結(jié)合，通常是不可逆吸附[8]；3）形成微菌落：微生物不斷分泌胞外聚合物（extracellular polymeric substances,EPS），并形成一層凝膠層將細(xì)胞包裹在內(nèi)部區(qū)域[9]；4）生物膜的成熟：微菌落內(nèi)的細(xì)胞持續(xù)分泌EPS，最終形成具有三維空間結(jié)構(gòu)的成熟生物膜；5）生物膜的解體：受環(huán)境因子和細(xì)胞性質(zhì)等因素的影響，部分微生物從生物膜中逃離，重新分散到外部環(huán)境中[10]。在生物膜形成的多步驟過程中，微生物在固相表面的初始吸附是其形成生物膜的關(guān)鍵，該過程包括了微生物對固相表面的“感知”以及初始吸附后細(xì)胞的“響應(yīng)”，這一過程被稱為微生物的表面感應(yīng)[11]。

本文重點(diǎn)介紹了環(huán)境微生物-大腸桿菌表面感應(yīng)相關(guān)研究進(jìn)展，期望能為土壤環(huán)境中病原微生物的控制提供理論依據(jù)，同時(shí)也能加深對土壤生物膜的認(rèn)識，最終能揭開土壤中這些具有活性的生物膜的神秘面紗，深入理解土壤生物過程的本質(zhì)，從而更好地調(diào)控生物膜參與的養(yǎng)分循環(huán)和污染物降解等過程，保障土壤健康。

1 表面感應(yīng)概念內(nèi)涵

細(xì)菌生物膜形成的第一步是細(xì)胞與固相表面接觸，但細(xì)菌如何知道它正在靠近或已經(jīng)吸附在固相表面的這種由懸浮態(tài)向吸附態(tài)轉(zhuǎn)換的過程，實(shí)際上依賴于細(xì)菌對表面的“識別”和“響應(yīng)”，即“表面感應(yīng)”[12]。細(xì)菌表面感應(yīng)包含多種行為，在細(xì)菌與表面接近的過程中，可利用表面結(jié)構(gòu)（如鞭毛和菌毛）感知固相表面，通過胞內(nèi)信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和表面性質(zhì)調(diào)控吸附。例如：副溶血性弧菌利用鞭毛感知表面，刺激scrABC系統(tǒng)中的質(zhì)膜蛋白ScrC，誘導(dǎo)c-di-GMP水平上升，抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)并促進(jìn)吸附[13-14]；變形桿菌的鞭毛感知表面后，鞭毛基質(zhì)蛋白FliL能通過UmoA調(diào)節(jié)子調(diào)控鞭毛監(jiān)管蛋白FlhD，控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性[15]；枯草芽孢桿菌利用鞭毛感知表面，觸發(fā)DegS-DegU機(jī)械開關(guān)，影響枯草芽孢桿菌的吸附和生物膜的形成[16]；銅綠假單胞菌利用Ⅳ型菌毛（TFP）接受表面信號，TFP相關(guān)蛋白PilY1刺激c-di-GMP水平上調(diào)，抑制鞭毛運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入生物膜狀態(tài)[11]。

2 大腸桿菌表面感應(yīng)模式系統(tǒng)

大腸桿菌是自然環(huán)境和哺乳動(dòng)物胃腸道中普遍存在的重要微生物，是研究細(xì)菌表面感應(yīng)的重要模式系統(tǒng)，其中，細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)信號系統(tǒng)是影響大腸桿菌表面感應(yīng)的主要因素。大腸桿菌能通過鞭毛、Ⅰ型菌毛和膜蛋白感知表面，通過雙組分系統(tǒng)控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和表面性質(zhì)（表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞分泌、表面電荷和疏水性），調(diào)控大腸桿菌在不同表面的吸附。

2.1 表面結(jié)構(gòu)

大腸桿菌在表面吸附的初始階段，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)如鞭毛、菌毛、脂多糖、膜蛋白等是影響細(xì)菌在表面吸附的主要因素[17]，環(huán)境因素如pH、離子強(qiáng)度和溫度也可通過表面結(jié)構(gòu)影響細(xì)菌在表面的吸附。

細(xì)菌鞭毛能幫助細(xì)胞克服環(huán)境中的流體作用力和細(xì)胞與表面間的靜電斥力，從而誘發(fā)初始吸附[18]；當(dāng)細(xì)胞靠近表面，鞭毛旋轉(zhuǎn)受阻，結(jié)構(gòu)發(fā)生形變，鞭毛在細(xì)胞與表面間起到橋接作用[12]。由鞭毛介導(dǎo)的可逆吸附階段主要受環(huán)境因素（如pH、離子強(qiáng)度、溫度）和表面性質(zhì)（褶皺、疏水性）影響[18]。PRATT等[19]利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入法制備大腸桿菌突變體，篩選了聚氯乙烯（polyvinyl chloride,PVC）表面生物膜形成能力有缺陷的突變體菌株，發(fā)現(xiàn)有超過半數(shù)的突變體菌株有鞭毛功能缺陷，這暗示了鞭毛運(yùn)動(dòng)性與大腸桿菌生物膜形成密切相關(guān)，這可能是由于大腸桿菌必須依賴鞭毛運(yùn)動(dòng)才能靠近PVC表面，也可能因?yàn)楸廾谴竽c桿菌與PVC表面直接接觸的橋梁。WOOD等[20]制備大腸桿菌鞭毛突變株（fliA）和運(yùn)動(dòng)性缺陷突變株（motA），對比菌株形成生物膜的差異，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性最好的野生型細(xì)胞成膜能力最強(qiáng)（≈43 μm厚，表面覆蓋率21%～34%），含有鞭毛結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)性缺陷突變株motA成膜能力次之（≈13 μm厚，表面覆蓋率41%～58%），無運(yùn)動(dòng)性也沒有鞭毛結(jié)構(gòu)的突變株fliA成膜能力最差（表面覆蓋率小于5%）。這些結(jié)果證實(shí)了鞭毛運(yùn)動(dòng)性和結(jié)構(gòu)對大腸桿菌生物膜形成至關(guān)重要。

菌毛是大腸桿菌與表面在不可逆吸附階段起主要功能的細(xì)胞器，可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生不可逆吸附[21]。大腸桿菌的Ⅰ型菌毛（主要由fim基因編碼的FimA菌毛蛋白組成，末端含有特異性吸附素FimH）和P型菌毛（主要由pap基因編碼的PapA菌毛蛋白組成，末端含有特異性吸附素PapG）在大腸桿菌初始吸附過程中起著重要作用。在大腸桿菌與PVC的吸附體系中，fim（Ⅰ型菌毛）基因突變株在PVC表面的成膜量較低，其主要原因是突變株在PVC表面的初始吸附量較少。Ⅰ型菌毛上的定位吸附蛋白-FimH既能誘導(dǎo)大腸桿菌與生物表面甘露糖的特異性結(jié)合，也能調(diào)控大腸桿菌在無機(jī)表面（如PVC）的非特異性吸附。這些結(jié)果表明，Ⅰ型菌毛是大腸桿菌在無機(jī)表面初始吸附過程中必不可少的組分[19,22]。在大腸桿菌與聚苯乙烯的吸附體系中，編碼菌毛的csgA基因突變株成膜量顯著降低，ompR基因突變株顯著提高csgA表達(dá)量，表明菌毛是大腸桿菌在惰性表面形成生物膜的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，且受EnvZ-OmpR雙組分系統(tǒng)調(diào)控[23]。

除了細(xì)胞膜外部結(jié)構(gòu)，一些鑲嵌在細(xì)胞膜上的跨膜蛋白也能調(diào)節(jié)細(xì)胞吸附，膜蛋白在表面結(jié)構(gòu)與胞內(nèi)信號系統(tǒng)間傳遞信號。通過雙向電泳發(fā)現(xiàn)，吸附在涂有金膜石英晶體表面的大腸桿菌OmpA、OmpX、Slp和TolC等4種膜蛋白表達(dá)量下調(diào)，ompX突變株提高了細(xì)胞Ⅰ型菌毛和胞外多糖的表達(dá)量，降低了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性[24]。外膜脂蛋白NlpE能通過誘導(dǎo)Cpx系統(tǒng)響應(yīng)表面吸附引發(fā)的細(xì)胞膜擾動(dòng)，激活細(xì)菌對無機(jī)疏水性表面的響應(yīng)。例如，在大腸桿菌K-12與玻璃珠混合的體系中，cpxR與nlpE突變株在玻璃表面的吸附量顯著降低，約為野生型菌株吸附量的1/3；在吸附4 h的過程中，野生型大腸桿菌表達(dá)了大量的CpxR蛋白，而cpxR與nlpE突變株幾乎不表達(dá)CpxR蛋白，表明NlpE蛋白能通過激活Cpx系統(tǒng)刺激大腸桿菌在玻璃表面的吸附[25]。

脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁最外層的一層較厚（8～10 nm）的類脂多糖類物質(zhì)，由類脂A、核心多糖和O-特異側(cè)鏈組成[26]。LPS能將細(xì)胞固定在距離表面20 nm處的位置，并在細(xì)胞與表面之間形成氫鍵[27]。LPS也能通過調(diào)控細(xì)胞表面疏水性影響細(xì)胞對不同表面的吸附性。LPS有2種形態(tài)：A-LPS和B-LPS。A-LPS提高細(xì)胞表面疏水性，B-LPS提高細(xì)胞表面親水性。B-LPS含量越高，細(xì)胞對親水性玻璃表面的吸附量就越高。A-LPS和B-LPS的相對含量受環(huán)境因子控制，通過改變細(xì)胞表面性質(zhì)可以選擇合適的表面以供吸附，有助于細(xì)菌在環(huán)境中的存活[28]。LPS缺失，則降低了大腸桿菌在無機(jī)表面的吸附能力[29]。例如：在大腸桿菌K-12與聚苯乙烯的吸附體系中，細(xì)胞表面LPS結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變降低了菌株的吸附量（約為野生型菌株吸附量的50%～80%）；細(xì)胞在軟瓊脂平板上的運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)也表明，LPS突變株的運(yùn)動(dòng)性顯著低于野生型菌株；利用斑點(diǎn)印跡法分析野生型和LPS突變株的Ⅰ型菌毛的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)LPS突變株的Ⅰ型菌毛含量只有野生型細(xì)胞的20%～60%。這些結(jié)果表明，LPS能通過影響Ⅰ型菌毛的產(chǎn)量和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性影響大腸桿菌在聚苯乙烯表面的吸附[29]。

胞外聚合物（EPS）是大腸桿菌生物膜的主要組分，在大腸桿菌生物膜的形成過程中具有重要作用。大腸桿菌與表面的吸附能促進(jìn)EPS的分泌，但EPS對初始吸附和生物膜形成的影響卻不同。莢膜異多糖酸是大腸桿菌EPS的主要組分。DANESE等[30]檢測了野生型大腸桿菌K-12和莢膜異多糖酸突變株在PVC表面的吸附量，發(fā)現(xiàn)二者吸附量沒有顯著差異；進(jìn)一步利用熒光顯微鏡觀察野生型大腸桿菌K-12和莢膜異多糖酸突變株生物膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)莢膜異多糖酸突變株的生物膜只有薄薄的一層，且表面沒有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。

2.2 細(xì)胞密度

除了細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，細(xì)胞密度（懸浮密度和沉積密度）也能影響細(xì)胞在表面的吸附。大腸桿菌的懸浮密度通常在1.06～1.13 g/mL之間，此時(shí)懸浮液中的細(xì)胞緩慢向固體表面沉積[31]。當(dāng)大腸桿菌進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞懸浮密度增加，促進(jìn)細(xì)胞在表面上的快速聚集[32]。MAUTER等[33]通過改變離子強(qiáng)度控制大腸桿菌K-12在石英柱表面上的沉積密度，運(yùn)用基因芯片和代謝組學(xué)技術(shù)測量了不同沉積密度對大腸桿菌吸附過程中基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：離子強(qiáng)度越高，大腸桿菌吸附量越高，細(xì)胞沉積密度也越高；細(xì)胞沉積密度越高，大腸桿菌中琥珀酸、脯氨酸、焦谷氨酸和色氨酸的催化基因含量越低，導(dǎo)致胞內(nèi)的代謝物濃度越高；在高沉積密度條件下，吸附態(tài)細(xì)胞的菌毛含量比懸浮態(tài)細(xì)胞高出了約4倍；色氨酸的代謝產(chǎn)物能作為群體感應(yīng)的信號調(diào)節(jié)大腸桿菌的運(yùn)動(dòng)性，表明表面細(xì)胞沉積密度能通過改變大腸桿菌的代謝強(qiáng)度、群體感應(yīng)和表面結(jié)構(gòu)影響細(xì)菌在無機(jī)表面的吸附。

2.3 胞內(nèi)雙組分信號系統(tǒng)

胞內(nèi)信號系統(tǒng)主要通過改變細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和響應(yīng)環(huán)境壓力2種方式調(diào)控表面感應(yīng)。調(diào)控大腸桿菌表面感應(yīng)的系統(tǒng)主要是Cpx、Rcs和EnvZ-OmpR雙組分系統(tǒng)。雙組分系統(tǒng)是細(xì)菌的“神經(jīng)中樞”，是最先感應(yīng)到環(huán)境信號的組分，主要由位于內(nèi)膜上的組氨酸激酶（histidine kinases,HK）和胞內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)子（response regulator,RR）組成。當(dāng)HK檢測到環(huán)境信號，首先自磷酸化，然后將磷酸基傳遞給RR，誘導(dǎo)一系列下游基因表達(dá)變化[34]。

調(diào)控菌毛的表達(dá)量是胞內(nèi)信號系統(tǒng)調(diào)控表面感應(yīng)的重要途徑（圖1）。Cpx系統(tǒng)中的CpxR蛋白是csgA的負(fù)調(diào)節(jié)因子，cpxA基因能通過CpxR的去磷酸化增加csgA轉(zhuǎn)錄水平，提高菌毛表達(dá)量[35]；Rcs系統(tǒng)能調(diào)節(jié)csgDEFG的表達(dá)，RcsA和RcsB能激活csgD，抑制csgBA的表達(dá)，從而降低菌毛合成[36]；EnvZOmpR系統(tǒng)中的OmpR蛋白能與csgD啟動(dòng)子結(jié)合刺激其轉(zhuǎn)錄，CsgD激活編碼菌毛的csgBA啟動(dòng)子，提高菌毛表達(dá)量[37]。不同信號系統(tǒng)也能互相影響，OmpR只能特異性的與csgD啟動(dòng)子結(jié)合，而CpxR能與多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，當(dāng)CpxR的識別位點(diǎn)與csgDOmpR結(jié)合位點(diǎn)重疊時(shí)，能抑制菌毛表達(dá)[38]。

圖1 大腸桿菌表面感應(yīng)模型Fig.1 Model of Escherichia coli surface sensing

胞內(nèi)信號系統(tǒng)也能通過響應(yīng)環(huán)境壓力（滲透壓、pH）調(diào)控表面感應(yīng)（圖1）。當(dāng)環(huán)境pH高于7.4，Cpx系統(tǒng)能激活virF基因，提高IpaBCD蛋白含量，促進(jìn)細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞；當(dāng)pH低于6.0，virF的表達(dá)受到抑制[39]。大腸桿菌K-12在微量滴定板上的生物膜量隨滲透壓的升高而降低。相對于低滲透壓環(huán)境，在高滲透壓條件下CpxR蛋白合成量提高40%，總CpxR蛋白磷酸化水平從25%提高到超過50%，表明Cpx系統(tǒng)可以從轉(zhuǎn)錄和翻譯2個(gè)水平響應(yīng)滲透壓變化[38]。

胞內(nèi)信號系統(tǒng)對環(huán)境壓力的響應(yīng)和對表面結(jié)構(gòu)的調(diào)控是一個(gè)互相聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)。在低滲透壓條件下，OmpR和H-NS激活csgD轉(zhuǎn)錄，Rcs系統(tǒng)中的RcsB抑制csgD表達(dá)；在高滲透壓條件下，CpxR磷酸化水平上升1倍，抑制csgD的表達(dá)，而H-NS仍能激活csgD[38]；EnvZ-OmpR系統(tǒng)中的OmpA蛋白能感應(yīng)滲透壓變化，通過Cpx系統(tǒng)抑制纖維素產(chǎn)物，并提高大腸桿菌成膜量[40]；通過抑制表面蛋白OmpX的產(chǎn)量可降低細(xì)胞表面疏水性和電負(fù)性，抑制EPS產(chǎn)量并增強(qiáng)細(xì)胞的群集運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)細(xì)胞對抗生素（丁胺卡那霉素、頭孢菌素、慶大霉素、新生菌素和萘啶酸）的抗性，促進(jìn)細(xì)胞在疏水性無機(jī)表面的吸附[41]。

3 展望

大腸桿菌的表面感應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的、互相協(xié)調(diào)的過程，通過一套復(fù)雜的系統(tǒng)調(diào)控生物膜的形成。目前已知大腸桿菌的菌毛和鞭毛能感知表面，但其他表面結(jié)構(gòu)是否具有感知表面的能力還不得而知；而且胞內(nèi)雙組分系統(tǒng)如何改變表面結(jié)構(gòu)，特別是從細(xì)胞接收信號到改變細(xì)胞行為這一過程，具體的機(jī)制仍然未知；多重調(diào)控系統(tǒng)共存時(shí)，系統(tǒng)間的互作及對表面感應(yīng)的影響也不清楚，這些工作是大腸桿菌表面感應(yīng)研究今后需著重解決的主要科學(xué)問題[42-43]。對于土壤系統(tǒng)，由于其固相組成復(fù)雜，影響大腸桿菌存活和傳播的因子眾多，從生物學(xué)角度去理解大腸桿菌對土壤組分的表面感應(yīng)機(jī)制還是空白，這也是值得土壤學(xué)工作者今后研究的方向。

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