氯過氧化物酶催化對(duì)氨基苯磺酸降解及其環(huán)境適應(yīng)性研究

盧 靖, 蔣育澄

(1.陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 陜西 西安 710119； 2.陜西科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

對(duì)氨基苯磺酸是一種酰胺類化工原料，在制造染料、農(nóng)藥、食用色素等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值.由于對(duì)氨基苯磺酸分子中含有苯環(huán)、氨基和磺酸基，其具有良好的水溶性和分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可在自然環(huán)境中長期穩(wěn)定存在.然而酰胺類化合物是一種危害動(dòng)植物健康的環(huán)境污染源，有研究報(bào)道對(duì)氨基苯磺酸可通過食物鏈進(jìn)入生物體并逐漸累積，以血紅蛋白結(jié)合態(tài)在神經(jīng)組織和血液中富集，干擾機(jī)體正常新陳代謝[1]，該類物質(zhì)目前已被列為可能致癌化合物[2].

酰胺類化合物大部分在水體中很難降解，用一般的絮凝、萃取和吸附等物理法難以徹底從環(huán)境中去除，化學(xué)氧化法可高效降解這類有機(jī)物，但會(huì)形成二次污染，而且在工業(yè)污水處理中成本較高[3,4].酶催化氧化環(huán)境毒物是一種高效、綠色、環(huán)境友好的方法.氯過氧化物酶(簡稱CPO)作為過氧化物酶家族中的一員，可催化降解非甾體抗炎藥[5]、蒽醌、三苯甲烷類有機(jī)染料[6]，噻唑化合物、2-巰基苯并化合物[7]等多種環(huán)境污染物，具有用量少、高效、快速等優(yōu)勢[8].然而氯過氧化物酶催化對(duì)氨基苯磺酸降解的作用目前仍不明確，本研究考察了酶催化反應(yīng)體系pH值、H2O2濃度、反應(yīng)時(shí)間和CPO用量對(duì)催化降解的影響，在此基礎(chǔ)上分析CPO催化對(duì)氨基苯磺酸降解歷程，并對(duì)其環(huán)境毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在尋求一種高效、經(jīng)濟(jì)、綠色的酰胺類污染物處理方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 CPO及底物溶液的準(zhǔn)備與配置

(1)CPO的培養(yǎng)和濃度測定：CPO由本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)Hager等人的方法進(jìn)行培養(yǎng)[9]，用丙酮作為酶分離沉淀溶劑進(jìn)行提純.酶濃度為91 200 L·mol-1·cm-1.

(2)底物溶液的配置：準(zhǔn)確稱取0.261 80 g對(duì)氨基苯磺酸定容于500 mL的容量瓶中，配置成初始濃度為3 mmol·L-1的溶液，用移液管移取不同體積的儲(chǔ)備液于50 mL的容量瓶中定容，配置成不同濃度的底物溶液，置于4 ℃冰箱保存.

1.2 底物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

不同濃度的底物標(biāo)準(zhǔn)溶液溶于甲醇中，經(jīng)過0.22μm 的有機(jī)相過濾膜過濾后用高效液相色譜(HPLC)分析濃度.色譜柱為C18反相色譜柱，內(nèi)徑4.6 mm，柱長250 mm.檢測條件：對(duì)氨基苯磺酸的檢測波長λ為249 nm；流動(dòng)相為甲醇∶水=50∶50(V/V)；流速v為0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量V為20μL.以吸收峰強(qiáng)度-濃度作圖得到底物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程[10].

1.3 CPO催化底物降解

磷酸緩沖液中加入適量底物和0.4μmol·L-1的CPO，加入H2O2開始反應(yīng)，避光、磁力攪拌下反應(yīng)一定時(shí)間.反應(yīng)結(jié)束后用乙酸乙酯萃取，所得萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，隨后加入甲醇溶解，經(jīng)0.22μm的有機(jī)相過濾膜過濾后用于高效液相色譜(HPLC)分析測定.降解率用公式(1)計(jì)算：

(1)

式(1)中：C0-底物的初始濃度,μmol/L；Ct-底物在t時(shí)刻的濃度,μmol/L；η-底物的降解率.

1.4 氯過氧化物酶催化降解方法的安全性評(píng)估

CPO催化酰胺類環(huán)境污染物的降解方法的安全性評(píng)估主要通過降解前后的物質(zhì)對(duì)單細(xì)胞綠藻(中國科學(xué)院淡水藻種庫提供)生長的影響來衡量[11].毒性評(píng)估采用綠藻的EC50值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，EC50是指引起綠藻半數(shù)抑制率時(shí)的濃度，EC50值越大，則代表毒性越小[12].

綠藻實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過程如下：

將被CPO催化降解后的液體按一定比例與培養(yǎng)基液混合，隨后將綠藻種加入，混合溶液放置于錐形瓶中，在2 000 lux光照下,無菌培養(yǎng)72 h.用紫外分光光度計(jì)檢測綠藻在680 nm下的吸光度，根據(jù)公式(2)計(jì)算其平均生長率μ，根據(jù)公式(3)計(jì)算抑制率i：

μ=(lnODt-lnODto)/(t-t0)

(2)

i=(μc-μt)/μc×100%

(3)

式(2)、(3)中：ODto為t0時(shí)刻的光吸收；ODt為t時(shí)刻的光吸收；μ為綠藻的平均生長率(s-1)；μc為空白組的平均生長率(s-1)；μt為加入降解前/后反應(yīng)液的平均生長率(s-1)；t-t0為培養(yǎng)時(shí)間(s)；i為抑制率.

以加入的濃度對(duì)抑制率作圖，使得各個(gè)圖的線性相關(guān)系數(shù)r>0.99，根據(jù)得到的線性方程計(jì)算抑制率為50%時(shí)的濃度，即EC50值.

1.5 氯過氧化物酶促降解在模擬廢水中的應(yīng)用

配置人工模擬廢水，組成如下：葡萄糖12 g·L-1，淀粉12 g·L-1、硫酸銨3.42 g·L-1，磷酸二氫鉀1.68 g·L-1，硫酸鎂0.033 g·L-1、乙酸鈉0.015 g·L-1，氯化鈣 0.24 g·L-1，硫酸錳0.12 g·L-1，蛋白胨0.07 g·L-1與硫酸亞鐵 0.000 16 g·L-1[13-15]，pH3.6.

準(zhǔn)確稱取對(duì)氨基苯磺酸0.261 80 g，用人工模擬廢水作為溶劑定容于500 ml的容量瓶中，配置成對(duì)氨基苯磺酸初始濃度為3 mmol·L-1的溶液，4 ℃保存.催化降解過程及表征與步驟2.3相同.

2 結(jié)果與討論

2.1 底物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對(duì)氨基苯磺酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.在初始濃度為100～800μmol·L-1范圍內(nèi)，高效液相色譜所檢測的吸收峰強(qiáng)度與底物濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=40 876.621 9x+507 999.142 86，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999；因此，根據(jù)底物標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行CPO催化對(duì)氨基苯磺酸降解影響因素的考察.

圖1 底物測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 介質(zhì)pH值對(duì)降解率的影響

CPO對(duì)環(huán)境的酸堿度較為敏感，當(dāng)介質(zhì)pH值超出其耐受范圍時(shí)，酶的活性降低，當(dāng)pH>7或<2時(shí)甚至?xí)姑甘Щ?本文討論介質(zhì)pH值在2～6范圍內(nèi)CPO催化對(duì)氨基苯磺酸降解的趨勢.反應(yīng)體系介質(zhì)的pH值是指配置溶液所用到緩沖液的pH，即溶液在未加入底物之前的原始pH值.在底物濃度不變、H2O2用量為3 mmol·L-1、CPO濃度是0.4μmol·L-1和反應(yīng)時(shí)間10 min的情況下，對(duì)氨基苯磺酸降解率變化如圖2所示.

圖2 介質(zhì)pH值對(duì)底物降解率的影響

2.3 H2O2濃度對(duì)底物降解率的影響

大量研究已證實(shí)，H2O2在CPO酶催化反應(yīng)中起著重要的作用，當(dāng)反應(yīng)體系中加入H2O2時(shí)，它首先氧化靜態(tài)的CPO產(chǎn)生compoundⅠ，compoundⅠ具有很高的活性[16]，可以氧化底物分子降解.另一方面，CPO具有過氧化氫酶的活性，也會(huì)促使H2O2分解.因此，溶液中H2O2濃度存在最佳值，如果濃度過低，反應(yīng)體系中無法產(chǎn)生足夠的compoundⅠ，降解效果欠佳；但當(dāng)H2O2的濃度過高時(shí)，又會(huì)對(duì)CPO的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)造成氧化性破壞[17]，導(dǎo)致CPO的活性降低甚至失活，降解率隨之下降.

本實(shí)驗(yàn)中H2O2濃度范圍設(shè)定在0～4 mmol·L-1，CPO濃度0.4μmol·L-1，介質(zhì)pH4.0，反應(yīng)時(shí)間10 min.從圖3的結(jié)果可以看出：當(dāng)不加H2O2的時(shí)候，對(duì)氨基苯磺酸降解率為零.隨著H2O2濃度的增大其降解率逐漸增大.H2O2加入量小于2 mmol·L-1時(shí)，底物的降解率基本呈線性增長，當(dāng)H2O2的濃度為3 mmol·L-1時(shí)，降解率達(dá)到了97.28 %，隨后繼續(xù)增加H2O2濃度到4 mmol·L-1，其降解率不再增加.說明在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的范圍內(nèi)，H2O2最佳用量為3 mmol·L-1.

圖3 H2O2的濃度對(duì)底物降解率的影響

2.4 CPO濃度對(duì)底物降解率的影響

在H2O2濃度3 mmol·L-1，介質(zhì)pH4.0，反應(yīng)10 min的條件下，考察CPO用量對(duì)底物降解率的影響.從圖4可以看出，隨著CPO濃度的增大，對(duì)氨基苯磺酸的降解率不斷增大.CPO濃度在0.05～0.3μmol·L-1范圍內(nèi)，降解率線性增加.CPO濃度為0.4μmol·L-1時(shí)，降解率達(dá)到96.36 %， 隨后降解率值維持基本不變.從數(shù)據(jù)可以看出，降解率達(dá)到90%以上時(shí)CPO的濃度僅是底物濃度的萬分之一.因此，CPO催化氧化降解酰胺類環(huán)境污染物的一大優(yōu)勢是用量極少.

圖4 CPO濃度對(duì)底物降解率的影響

2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)底物降解率的影響

選取CPO濃度為0.4μmol·L-1，H2O2濃度為3 mmol·L-1，介質(zhì)pH為4.0的條件，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)底物降解率的影響.從圖5可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的增大降解率逐漸增大，降解率的變化與時(shí)間基本呈線性增長關(guān)系.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到10 min時(shí)降解反應(yīng)基本達(dá)到平衡狀態(tài)，此時(shí)降解率達(dá)到了96.21%，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，降解率變化很小趨于恒定值.說明CPO催化降解環(huán)境有機(jī)毒物的又一優(yōu)勢即降解所需的時(shí)間短.

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)底物降解率的影響

2.6 降解產(chǎn)物分析及降解途徑推測

在最佳反應(yīng)條件下，即CPO的濃度為0.4μmol·L-1，H2O2的濃度為3 mmol·L-1，緩沖溶液pH為4，反應(yīng)時(shí)間為10 min，催化對(duì)氨基苯磺酸降解.采用質(zhì)譜分析降解產(chǎn)物組成并推測降解途徑.

圖6和表1列出了對(duì)氨基苯磺酸降解后的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物的主要分子片段，從中可以看出對(duì)氨基苯磺酸可能通過兩種方式來降解.一種是：對(duì)氨基苯磺酸去除掉硫酸根生成中間產(chǎn)物[a]，進(jìn)一步降解生成產(chǎn)物II(4-nitrosophenol)，其分子量為123，[2II+H]+對(duì)應(yīng)的m/z為285.73的峰.另一種是：對(duì)氨基苯磺酸脫磺酸基和氨基，生成中間產(chǎn)物[b]，進(jìn)一步羥基氧化生成產(chǎn)物I (benzoquinone)，其分子量為108，[2I+H]+對(duì)應(yīng)的m/z為217.82的峰.CPO-H2O2體系催化對(duì)氨基苯磺酸降解的產(chǎn)物如表1所示.

圖6 CPO催化氧化降解對(duì)氨基苯磺酸的降解產(chǎn)物質(zhì)譜分析及降解途徑推測

產(chǎn)物代碼推測方法分子量m/z結(jié)構(gòu)式化學(xué)名稱Ⅰ[2I+H]+108217OObenzoquinoneⅡ[2II+Na]+123285OHOH4?nitrosophenol

2.7 氯過氧化物酶催化降解方法的安全性評(píng)估

毒性評(píng)估采用綠藻的EC50值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，EC50是指引起綠藻半數(shù)抑制率時(shí)的濃度，EC50值越大，則代表毒性越小.圖7為對(duì)氨基苯磺酸降解前后EC50值隨降解率變化的趨勢圖.從圖7可以看出，隨著底物降解率的增大EC50值也在增大.由此可以說明對(duì)氨基苯磺酸通過酶促降解后的產(chǎn)物比原底物對(duì)綠藻的生長的抑制降低，即產(chǎn)物的毒性明顯小于降解前.這證明了CPO在催化酰胺類環(huán)境污染物方面具有應(yīng)用前景，這種方法不但能夠高效消除酰胺類環(huán)境污染物，而且產(chǎn)物安全無毒.

圖7 對(duì)氨基苯磺酸降解前后EC50值隨降解率變化趨勢圖

2.8 氯過氧化物酶促降解在模擬廢水中的應(yīng)用

為探究CPO酶促降解體系在工業(yè)廢水中應(yīng)用的可行性，本文進(jìn)一步將酶促降解體系應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室配置的人工模擬廢水中.在對(duì)氨基苯磺酸最佳降解率的條件下(CPO的濃度為0.4μmol·L-1，H2O2的濃度為3 mmol·L-1，反應(yīng)時(shí)間為10 min降解)，計(jì)算其降解率.

通過三組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值計(jì)算，結(jié)果表明：對(duì)氨基苯磺酸的降解率是57.23%.分析原因，可能是模擬廢水中存在的金屬離子抑制CPO的活性.在此基礎(chǔ)上提高CPO和H2O2的濃度，延長反應(yīng)時(shí)間，測定其降解率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果為，當(dāng)CPO的濃度為0.7μmol·L-1，H2O2的濃度為5 mmol·L-1，反應(yīng)時(shí)間為12 min時(shí)，模擬廢水中對(duì)氨基苯磺酸的降解率達(dá)到最大為64.23 %.

3 結(jié)論

氯過氧化物酶催化對(duì)氨基苯磺酸降解，其最佳工作條件是：CPO的濃度為0.4μmol·L-1，H2O2的濃度為3 mmol·L-1，反應(yīng)時(shí)間為10 min.在此條件下，對(duì)氨基苯甲酸可按照兩種路徑降解：一種是去除硫酸根，進(jìn)一步降解生成產(chǎn)物4-亞硝基苯酚;另一種是脫磺酸基和氨基，進(jìn)一步羥基氧化生成苯醌.毒性評(píng)估實(shí)驗(yàn)顯示降解后產(chǎn)物對(duì)綠藻的生長抑制明顯降低，產(chǎn)物安全，毒性很低.

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