高效液相色譜-原子熒光光譜(HPLC-AFS)法測(cè)定水產(chǎn)動(dòng)植物樣品中無(wú)機(jī)砷

劉海濤 姚夢(mèng)楠 薛慧 閆京山 王俊杰

（北京海光儀器有限公司，北京100016）

前言

砷元素廣泛存在于自然界中，尤其在食品安全和環(huán)境領(lǐng)域，越來(lái)越受到社會(huì)的廣泛重視，作為重金屬元素之一的砷，已成為食品安全重點(diǎn)檢測(cè)的項(xiàng)目。經(jīng)過(guò)大量食品中砷的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，海產(chǎn)品中砷的含量普遍高于陸地生長(zhǎng)物種[1]，有些要高出陸地物種好幾倍，其中典型代表就是海藻類植物，如海帶、紫菜、羊棲菜等本身具有很強(qiáng)的吸附特性，會(huì)富集大量的砷。然而，我們常以藻類或其它海產(chǎn)品為食，造成大量中毒現(xiàn)象卻沒(méi)有發(fā)生。后來(lái)，經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)海產(chǎn)品中存在的砷形態(tài)與陸生物種不盡相同，其大多存在砷形態(tài)為有機(jī)砷，例如砷糖、砷甜菜堿、砷膽堿等，其毒性很弱，甚至有報(bào)道研究為無(wú)毒砷形態(tài)；而毒性很強(qiáng)的無(wú)機(jī)砷含量比較低。所以我們?cè)诜治龃祟惍a(chǎn)品砷含量時(shí)，要加以區(qū)分有毒和無(wú)毒砷形態(tài)，制定出行之有效的檢測(cè)方法。

目前國(guó)內(nèi)新修訂現(xiàn)行的食品中無(wú)機(jī)砷檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.11—2014方法中采用聯(lián)用方法分析測(cè)定無(wú)機(jī)砷[2]。目前GB5009.11—2014中規(guī)定此類產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷采用液相色譜梯度洗脫，分離有機(jī)砷和無(wú)機(jī)砷，以達(dá)到消除有機(jī)砷對(duì)無(wú)機(jī)砷測(cè)定干擾的目的。樣品提取方法中，砷糖等有機(jī)砷以及提取過(guò)程中的中間有機(jī)砷產(chǎn)物可能和三價(jià)砷在色譜分離出峰位置上距離較近，有些難以分開(kāi)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，尤其藻類等植物體內(nèi)含有大量砷糖類化合物，會(huì)干擾三價(jià)無(wú)機(jī)砷檢測(cè)。而動(dòng)物類產(chǎn)品中含有大量砷膽堿、砷甜菜堿等有機(jī)砷物質(zhì)，此類砷化合物在通常條件下很難發(fā)生氫化物反應(yīng)，原子熒光不會(huì)檢出信號(hào)，因此不會(huì)對(duì)無(wú)機(jī)砷造成干擾，動(dòng)物類樣品用等度洗脫分離完全可以滿足無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)。本文重點(diǎn)在于對(duì)植物樣品無(wú)機(jī)砷檢測(cè)方法進(jìn)行研究，樣品前處理方法加以改進(jìn)。

當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)中，梯度洗脫就是利用較低強(qiáng)度的緩沖液流動(dòng)相將前期出峰的色譜圖完全分開(kāi)，不干擾三價(jià)無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)。然而液相梯度分析過(guò)程比較繁瑣，出峰時(shí)間長(zhǎng)，需要二元高壓泵或其它帶有梯度模式色譜泵才能實(shí)現(xiàn)，對(duì)操作人員和技術(shù)要求均較高，尤其對(duì)于廣大從事無(wú)機(jī)元素分析的人員來(lái)說(shuō)，操作更為困難。本文提出一種新的測(cè)定方法，對(duì)梯度法進(jìn)行改進(jìn)，僅用等度液相泵就可以完成分析過(guò)程。本文實(shí)驗(yàn)用最佳的樣品提取酸度和溫度，樣品處理后，為解決三價(jià)砷出峰位置和有機(jī)砷干擾重合問(wèn)題，加入一定量的H2O2氧化三價(jià)砷到五價(jià)砷，這樣測(cè)定五價(jià)砷的量即為總的無(wú)機(jī)砷含量。本方法既解決了三價(jià)砷和有機(jī)砷難以分開(kāi)問(wèn)題，又可以使用簡(jiǎn)單的等度液相洗脫方法分離砷形態(tài)，使得分析樣品時(shí)間大大縮短，較好解決了此類樣品中無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)問(wèn)題。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料

LC-AFS9560液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀（北京海光儀器有限公司）；液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器（Spark Holland）；超聲波振蕩器；漩渦混合器；高速離心機(jī)；恒溫水浴震蕩器；溶劑過(guò)濾器。陰離子交換色譜柱（漢密爾頓），陰離子保護(hù)柱（漢密爾頓）。

鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、硝酸（優(yōu)級(jí)純）、硼氫化鉀（KBH4）、氫氧化鈉（NaOH）、甲醇（色譜純）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、甲酸、正己烷，三價(jià)砷As（Ⅲ）、五價(jià)砷As（V），均為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)于中國(guó)計(jì)量院，一甲基砷[CH3AsO（ONa）2·6H2O，MMA，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)于中國(guó)計(jì)量院]、二甲基砷[（CH3）2AsO2H，DMA，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)于中國(guó)計(jì)量院）、氬氣（純度≥99.99%）、0.45μm濾膜。，除另有說(shuō)明外，所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 樣品處理

1.2.1 水產(chǎn)動(dòng)物樣品

取水產(chǎn)動(dòng)物樣品可食部分進(jìn)行粉碎勻漿，稱取勻漿后樣品1.0 g（或干樣0.2～0.5 g）（精確至0.000 1 g），置于50 m L離心管中，加入20 m L HNO3（0.15 mol/L）作提取劑，在漩渦混合器上充分混勻。于90℃水浴下恒溫震搖浸提2.5 h，每半小時(shí)搖勻1次。提取結(jié)束，需冷卻到室溫，于離心機(jī)5 000 r/min下離心20 min。取10 m L上層清液置于離心管中，加入10 m L正己烷，用力振搖1 min后，除去脂肪及大量有機(jī)物，舍棄上層液體。于離心機(jī)5 000 r/min下再離心20 min。按此過(guò)程重復(fù)萃取一次，舍棄上層液體，用滴管吸取下層清液，依次用C18小柱凈化及0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.2.2 水產(chǎn)植物樣品

稱取1.0 g（精確至0.000 1 g）海藻類干樣于50 m L離心管中，加人20 mLHCl（1.0%）提取劑，在漩渦混合器上充分混勻，于90℃水浴恒溫震搖浸提2.5 h，提取完畢，需冷卻到室溫，于離心機(jī)5 000 r/min下離心20 min。滴管吸取上層清液用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，取0.5 mL濾液，加入0.2 m L過(guò)氧化氫（H2O2），用水稀釋定容至2.0 m L，搖勻后于70℃水浴下恒溫氧化20 min，將三價(jià)砷氧化為五價(jià)砷，取出冷卻至室溫，上機(jī)測(cè)定，最終通過(guò)對(duì)五價(jià)砷的測(cè)定得到樣品中總無(wú)機(jī)砷含量。對(duì)于無(wú)機(jī)砷含量較低的水產(chǎn)植物類樣品，可直接吸取1.8 m L上清液加人0.2 m L雙氧水，直接氧化，搖勻后，于70℃水浴下恒溫氧化20 min，取出冷卻至室溫，上機(jī)測(cè)量。過(guò)氧化氫加入量為確定定容體積的10%。樣品和提取液中總砷的分析測(cè)定，參考《食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》（GB/T5009.11—2014）[2]。

1.3 儀器工作條件選擇

實(shí)驗(yàn)中具體條件見(jiàn)表1。

表1 無(wú)機(jī)砷測(cè)定的LC-AFS條件Table 1 LC-AFS of inorganic arsenic detection conditions

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

砷的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液需要相應(yīng)的MMA、DMA、Asバ和As（V）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋得到，砷的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，由于溶液穩(wěn)定性易受環(huán)境影響，容易轉(zhuǎn)化，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，本實(shí)驗(yàn)配制成10、20、40、80、100μg/L的濃度曲線。在優(yōu)化好的儀器實(shí)驗(yàn)條件下，計(jì)算擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，混合標(biāo)準(zhǔn)分離色譜圖見(jiàn)圖1，線性方程見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相選擇

圖1 不同濃度砷形態(tài)分離譜圖Figure 1 Chromatogram of arsenic in different concentrations.

分別對(duì)磷酸二氫鈉、流動(dòng)相磷酸二氫銨、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀混合液作為流動(dòng)相進(jìn)行選擇實(shí)驗(yàn)，選取最佳分離條件[6-7]。以磷酸二氫鈉（10 mmol/L）溶液為流動(dòng)相，p H值為9.0進(jìn)行分離測(cè)定時(shí)，分離效果較好，但DMA和Asバ信號(hào)強(qiáng)度低，分析時(shí)間較長(zhǎng)；以磷酸二氫銨（15 mmol/L）溶液為流動(dòng)相，調(diào)節(jié)p H值為6.0進(jìn)行分離測(cè)定時(shí)，砷各形態(tài)出峰時(shí)間均較長(zhǎng)，DMA和As（V）信號(hào)強(qiáng)度較低，分離效果較好，見(jiàn)圖2；以磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀混合液為流動(dòng)相，p H值為5.92進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)時(shí)，砷4種形態(tài)在6 min內(nèi)完全分離，峰形尖銳，且信號(hào)強(qiáng)度高，見(jiàn)圖3，因此實(shí)驗(yàn)選擇磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀混合液作為流動(dòng)相。

表2 砷形態(tài)曲線回歸方程Table 2 Regression equation of arsenic speciation curve

2.2 提取劑及濃度選擇

提取劑是保證樣品中砷形態(tài)提取效率的前提，也是制約本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度的關(guān)鍵。目前，海產(chǎn)品中砷形態(tài)常用的提取劑主要有水、酸、和堿[7]，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)比較，稀酸為良好的砷提取劑，通常首選鹽酸體系。選擇無(wú)機(jī)砷含量較高的樣品羊棲菜為研究對(duì)象，稱取1.0 g干樣（精確至0.000 1 g，粉碎均勻后使用），采用不同濃度酸進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，比較研究了在0.5%～50%鹽酸溶液范圍內(nèi)，90℃水浴下恒溫震搖2.5 h后測(cè)定?？紤]到羊棲菜中無(wú)機(jī)砷含量可能偏高以及色譜柱的耐酸程度，提取完畢后，將實(shí)驗(yàn)中各鹽酸濃度浸提液稀釋10倍后上機(jī)測(cè)定，無(wú)機(jī)砷含量結(jié)果見(jiàn)表3。

重點(diǎn)研究不同濃度鹽酸溶液對(duì)無(wú)機(jī)砷提取率的影響，由圖4可知，提取劑鹽酸濃度在0.5%～50%范圍，測(cè)得無(wú)機(jī)砷含量變化在29.68～31.25 mg/kg，當(dāng)鹽酸濃度在1.0%～40%范圍變化時(shí)，相對(duì)于其它濃度提取的無(wú)機(jī)砷效率較高，通過(guò)提取率實(shí)驗(yàn)可知，較低濃度鹽酸已完全將羊棲菜等藻類植物中的無(wú)機(jī)砷提取。考慮到陰離子交換色譜柱耐酸性較差，沒(méi)有對(duì)大于50%的高濃度鹽酸實(shí)驗(yàn)。同時(shí)為減小稀釋倍數(shù)過(guò)大帶來(lái)的測(cè)量誤差，有利于低濃度樣品的檢出，因此提取劑的濃度選用濃度較低的鹽酸（1.0%）溶液，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 氧化劑加入對(duì)中間產(chǎn)物影響

氧化劑的使用可以完全將三價(jià)砷氧化成五價(jià)砷，但是，氧化劑會(huì)不會(huì)對(duì)樣品中的有機(jī)砷產(chǎn)生影響呢，也許會(huì)存在有機(jī)砷向無(wú)機(jī)砷轉(zhuǎn)化的過(guò)程，也會(huì)造成對(duì)五價(jià)砷測(cè)定的干擾。帶著這樣的疑問(wèn)，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究氧化劑對(duì)于有機(jī)砷的干擾問(wèn)題。許多實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，使用酸浸提會(huì)使樣品中大分子有機(jī)砷，如砷糖，砷脂類等分解轉(zhuǎn)化為小分子有機(jī)砷，DMA、MMA等。為了驗(yàn)證用鹽酸（1.0%）提取劑提取樣品，大分子有機(jī)砷及中間產(chǎn)物是否受氧化劑影響，分別進(jìn)行了加標(biāo)回收和對(duì)比實(shí)驗(yàn)。在樣品中加入DMA和MMA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品處理方法進(jìn)行酸提取及H2O2氧化的全過(guò)程，然后上機(jī)測(cè)定，結(jié)果DMA和MMA的加標(biāo)回收率均在90%～105.0%，五價(jià)砷的含量沒(méi)有增加，說(shuō)明樣品中的有機(jī)砷或中間產(chǎn)物DMA和MMA在酸提取及H2O2氧化過(guò)程中不會(huì)轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)砷，不會(huì)對(duì)無(wú)機(jī)砷的測(cè)定造成干擾。加入氧化劑H2O2只會(huì)氧化三價(jià)砷到五價(jià)砷，圖5（a）為空白樣品中加入無(wú)機(jī)砷和DMA、MMA標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖，圖5（b）為經(jīng)過(guò)氧化后測(cè)試譜圖，有機(jī)砷DMA和MMA無(wú)變化，三價(jià)砷被氧化為五價(jià)砷。

表3 羊棲菜樣品在不同鹽酸濃度下砷的提取率和無(wú)機(jī)砷含量Table 3 The extraction rate of Sargassum samples in different concentration of hydrochloric acid and arsenic and inorganic arsenic /(mg·kg-1)

圖4 不同提取酸度下無(wú)機(jī)砷測(cè)定值Figure 4 Determination of different extraction acidity of inorganic arsenic.

2.4 氧化劑加入量的影響

既然選擇加入過(guò)氧化氫來(lái)氧化三價(jià)無(wú)機(jī)砷到五價(jià)砷[8]，可以解決海產(chǎn)品有機(jī)砷對(duì)于三價(jià)砷干擾問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)對(duì)氧化劑加入量以及氧化時(shí)間進(jìn)行探索，在樣品提取液中分別加入5%、10%、20%、30%、40%、50%不同比例過(guò)氧化氫，按同一條件70℃恒溫水浴20 min，冷卻后測(cè)定，結(jié)果表明，10%～50%的氧化劑氧化后，測(cè)得的總無(wú)機(jī)砷量無(wú)變化（見(jiàn)表4），說(shuō)明10%氧化劑量足以將三價(jià)無(wú)機(jī)砷完全氧化到五價(jià)砷，所以實(shí)驗(yàn)選擇氧化劑為過(guò)氧化氫（10%）。同時(shí)還對(duì)水浴溫度對(duì)氧化效率進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)不同溫度50～90℃下影響，結(jié)果表明，溫度越低，完全氧化需要時(shí)間較長(zhǎng)，提高溫度有助于快速氧化，但考慮到溫度過(guò)高，過(guò)氧化氫會(huì)分解，且過(guò)氧化氫氧化能力很強(qiáng)，最快15 min就能氧化完全，綜合考慮，實(shí)驗(yàn)最終選擇10%氧化劑量，水浴溫度70℃，氧化時(shí)間20 min較好。羊棲菜樣品氧化后見(jiàn)圖6、圖7。

圖5 有機(jī)砷氧化過(guò)程轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)對(duì)比Figure 5 Comparison of conversion experiments of organic arsenic oxidation process.

圖6 羊棲菜氧化實(shí)驗(yàn)圖Figure 6 The chart of oxidation experiment of sargassum.

2.5 方法準(zhǔn)確度及精密度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分別以動(dòng)物性海產(chǎn)品和藻類產(chǎn)品為測(cè)定對(duì)象，藻類樣品提取液測(cè)試前加入過(guò)氧化氫氧化后測(cè)定，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分析樣品采用超市和市場(chǎng)上常見(jiàn)的海產(chǎn)品進(jìn)行分析，國(guó)家食品污染物限量[3]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于海產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷限量要求小于0.5 mg/kg，采集樣本后，處理前分別添加0.5 mg/kg和1.0 mg/kg無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。實(shí)際樣品分析平均加標(biāo)回收率都在85%～105%，每個(gè)樣品平行三個(gè)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)用分析方法可以滿足無(wú)機(jī)砷檢測(cè)需求。分析結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖7 不同過(guò)氧化氫含量下無(wú)機(jī)砷測(cè)定值Figure 7 Determination of hydrogen peroxide content under different inorganic arsenic.

圖8 實(shí)際樣品及加標(biāo)譜圖Figure 8 The spectrum of actual sample and standard.

表4 樣品測(cè)試結(jié)果Table 4 Sample test results /(mg·kg-1)

3 結(jié)論

采用液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用分析方法對(duì)原有無(wú)機(jī)砷檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)研究，證明了原有海產(chǎn)品無(wú)機(jī)砷檢測(cè)方法的主要問(wèn)題在于需要運(yùn)用梯度洗脫方式才能有效分離樣品中的有機(jī)和無(wú)機(jī)砷形態(tài)，過(guò)程比較繁瑣，分析周期較長(zhǎng)，且對(duì)于儀器操作者和儀器設(shè)備均提出較高要求。本文對(duì)當(dāng)前方法進(jìn)行改進(jìn)，尤其對(duì)藻類等植物樣品處理上，通過(guò)加入氧化劑氧化三價(jià)砷方式和干擾有機(jī)砷分離，而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也證明了有機(jī)砷不會(huì)向無(wú)機(jī)砷轉(zhuǎn)化，不會(huì)對(duì)無(wú)機(jī)砷測(cè)定產(chǎn)生干擾。本實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)證明可以應(yīng)用于海產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)。

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