瀕危植物單性木蘭外植體啟動培養(yǎng)

楊梅　劉暢等

摘要：以單性木蘭（Kmeria septentrionalis）種子、帶有腋芽的莖段為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基探討不同消毒劑、消毒時(shí)間以及不同的培養(yǎng)基配方對單性木蘭誘導(dǎo)不定芽及愈傷組織的啟動培養(yǎng)研究。結(jié)果表明：種子外植體以37%NaCIO溶液聯(lián)合0.1%HgCl₂溶液的效果優(yōu)于75%乙醇聯(lián)合0.1%HqCl₂溶液的消毒效果，且37%NaCIO10min+0.1%HqCl₂10min的消毒效果最佳，污染率為13.3%。帶有腋芽的莖段作為外植體，75%乙醇50s+0.1%HgCl₂18min時(shí)消毒效果最好，污染率為9%。培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mq/L+KT 2.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L可以誘導(dǎo)腋芽和愈傷組織的生長，啟動率是70%。

關(guān)鍵詞：單性木蘭；外植體；啟動培養(yǎng)

單性木蘭（Kmeria septentrionalis）為木蘭科（Magno-liaceae）單性木蘭屬（Kmeria），是一級重點(diǎn)保護(hù)植物，主要分布于廣西西北部的羅城、環(huán)江和貴州荔波縣，生長在海拔300～500m的石灰?guī)r山地林中，多數(shù)呈零散分布，成片分布僅見環(huán)江境內(nèi)廣西木論國家級自然保護(hù)區(qū)，面積大約3hm，現(xiàn)存成林樹約為200株。其種源稀少，自然更新能力弱，結(jié)實(shí)率、產(chǎn)籽率低，傳統(tǒng)的繁殖法繁殖倍數(shù)低，組織培養(yǎng)繁殖法可快速繁殖苗木。為此，對單性木蘭進(jìn)行了外植體的啟動培養(yǎng)研究，以期為種群擴(kuò)繁、保護(hù)及適度利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

單性木蘭供試種子和莖段采自于廣西武鳴縣里建單性木蘭基地。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子外植體和莖段外植體的消毒。選取飽滿干凈的種子用37%NaClO溶液消毒10min（分3組編號T₁、T₂、T₃）和75%乙醇溶液消毒10min（分3組編號T₄、T₅、T₆），無菌水沖洗后用0.1%HgCl₂分別消毒5、7、10min，再用無菌水沖洗；將采集處理好的莖段用75%乙醇消毒50s，無菌水沖洗后分為5組，編號T₂～T₁₁，用0.1%HgCl₂分別消毒8、10、15、18、20min，再用無菌水沖洗后將莖段切成帶1個(gè)腋芽且芽兩邊各留Icm左右的莖段外植體。均接種在MS培養(yǎng)基上，每處理20瓶，重復(fù)3次。

1.2.2單性木蘭莖段的啟動培養(yǎng)。將無菌莖段外植體接種于不同啟動培養(yǎng)基上（表1）。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

外植體接入培養(yǎng)基后，10～15d統(tǒng)計(jì)污染率和無菌活體得率，20～30d統(tǒng)計(jì)啟動率和死亡率，觀察生長狀況。計(jì)算方法如下：污染率=（污染數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%；無菌活體得率=（無菌活體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%；死亡率=（芽點(diǎn)或外植體干枯數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%；啟動率=（腑芽萌動莖段數(shù)/無菌莖段數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1種子外植體的消毒

不同消毒處理對單性木蘭種子外植體的消毒效果不同（表2），總體來看，37%NaCIO溶液+0.1%HgCl₂溶液的消毒效果優(yōu)于75%乙醇聯(lián)合0.1%HgCl2溶液的消毒效果，但2種消毒方式中都表現(xiàn)出隨著消毒時(shí)間的延長，污染率下降的趨勢。其中37%NaCIO溶液消毒10min聯(lián)合0.1%HgCl₂溶液消毒10min的效果最佳，污染率為13.3%。由于多方面的原因，在經(jīng)過60d的培養(yǎng)后未污染的種子中仍未有萌動跡象，后期可以進(jìn)一步對其進(jìn)行試驗(yàn)研究。

2.2莖段外植體的消毒

由表3可知，隨著消毒時(shí)間的延長，外植體的污染率逐漸降低，其中以75%乙醇50s+0.1%HgCl₂溶液處理18min時(shí)污染率最低為9%。當(dāng)時(shí)間延長至20min時(shí)，無菌活體得率為70.3%，死亡率為19.7%。說明消毒時(shí)間過短，污染率較高；消毒處理時(shí)間過長，對外植體毒害作用較大，以致無菌活體致死。故75%乙醇消毒50s+0.1%HgCl₂溶液處理18min的消毒效果最佳。

2.3單性木蘭莖段的啟動培養(yǎng)

將獲得的帶腋芽萌發(fā)點(diǎn)的無菌莖段接種在啟動培養(yǎng)基A₁～A₈上，20d后A₁未有腋芽萌發(fā)，A₂～A₈腋芽陸續(xù)萌動，但萌發(fā)的快慢和啟動率有所不同（表4），25d后可見鮮綠嫩芽，且A₆～A₈的腋芽生長狀況優(yōu)于A₂～A₅。其中A₆啟動率為70%，腋芽萌發(fā)速度最快，且有少量黃綠色、致密的顆粒狀愈傷組織產(chǎn)生，A₂中有少量灰褐色愈傷組織產(chǎn)生。從A₅～A₈中可發(fā)現(xiàn)，在6-BA和KT的基礎(chǔ)上添加2，4-D效果優(yōu)于添加NAA，且NAA濃度與生長狀態(tài)呈反比。約35d后將有腋芽萌動的莖段轉(zhuǎn)接到A6培養(yǎng)基中，無叢生芽產(chǎn)生，但產(chǎn)生多片新葉且節(jié)間伸長。轉(zhuǎn)接時(shí)只將新生芽接到培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)后期嫩芽全部枯萎為棕褐色。故轉(zhuǎn)接時(shí)將整個(gè)莖段接入培養(yǎng)基中的生長效果要優(yōu)于只接新生芽?？傊?，6-BA、KT和2，4-D對莖段腋芽啟動、愈傷組織和芽誘導(dǎo)有明顯地促進(jìn)作用。綜合啟動率和整體生長狀況最優(yōu)培養(yǎng)基是組合A6：MS+6-BA 2.0mg/L+KT2.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L。

3結(jié)論及討論

本研究突破單性木蘭種子主要集中于播種育苗方面的試驗(yàn)，以單性木蘭種子和莖段分別為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，以種子為外植體時(shí)無萌芽跡象，表明單性木蘭種子發(fā)芽率低，這和楊成華等進(jìn)行的試驗(yàn)結(jié)果一致，無萌發(fā)記錄。以單性木蘭莖段為外植體時(shí)較易污染，75%乙醇50s+0.1%HgCl₂18min消毒效果最佳，污染率為9%。由于消毒劑的種類、濃度、處理時(shí)間以及取材的時(shí)間、部位等不同對外植體的消毒效果不同，故外植體的消毒處理在組織培養(yǎng)中是至關(guān)重要的。

木蘭科植物組織培養(yǎng)在不定芽和愈傷組織的誘導(dǎo)上有較大難度。本研究利用單性木蘭幼嫩莖段作外植體，有效地誘導(dǎo)了腋芽生長，試驗(yàn)中6-BA、KT和2，4-D的聯(lián)合使用在單性木蘭腋芽的誘導(dǎo)中起積極作用，但6-BA濃度過高會影響芽的生長，出現(xiàn)畸形M。本試驗(yàn)中培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0mg/L+KT 2.0mg/L+2，4-D0.5mg/L既能促進(jìn)腋芽的萌動，也能誘導(dǎo)少量愈傷組織，再次轉(zhuǎn)接到該培養(yǎng)基后，單性木蘭莖段誘導(dǎo)的腋芽并未進(jìn)入穩(wěn)定的增殖階段，且沒有可用于生根的有效芽，說明該培養(yǎng)基對單性木蘭莖段腋芽的啟動有明顯的促進(jìn)作用，但對于后期的增殖培養(yǎng)基還需進(jìn)一步的試驗(yàn)探索。endprint