氨氯地平減輕腹主動脈縮窄性高血壓大鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

劉 靜，趙連友，李 雪，郭 麗，張志敏，丁 璐，李曉莉

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 陜西 西安 710038)

研究論文

氨氯地平減輕腹主動脈縮窄性高血壓大鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

劉 靜*，趙連友，李 雪，郭 麗，張志敏，丁 璐，李曉莉

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 陜西 西安 710038)

目的觀察高血壓大鼠心肌組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(GRP94)和CAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)的表達，探討氨氯地平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激高血壓大鼠心室肥厚的關系。方法將SD大鼠隨機分為假手術組、腹主動脈縮窄術(AAB)組和氨氯地平干預(AAB+Aml)組，每組40只。給予氨氯地平10 mg/(kg·d)。隨機分為2、4和8周3個亞組，測定平均動脈壓(MAP)；計算左心室質(zhì)量/體質(zhì)量(LVM/BW)；HE染色觀察心肌細胞的形態(tài)；免疫組化及Western blot檢測心肌組織GRP94和CHOP的表達。結(jié)果隨著術后時間的延長，AAB組MAP逐漸升高，明顯高于假手術組[2周(144±10)比(118±9)、4周(163±8)比(120±7)、8周(177±10)比(120±6)mmHg](P<0.05)；AAB組LVM/BW顯著高于假手術組[2周(2.21±0.17)比(1.91±0.12)、4周(2.45±0.16)比(2.01±0.14)、8周 (2.68±0.15)比(2.05±0.09)mg/g](P<0.05)； AAB組心肌細胞較假手術組明顯肥大；術后2周 AAB組心肌組織GRP94明顯表達，4周達最高值，8周減低；AAB組GRP94表達量高于假手術組(P<0.05)；隨術后時間的延長，CHOP蛋白含量逐漸增加，8周達最高值。使用氨氯地平后，AAB+Aml組較AAB組MAP降低[2 周(126±6)比(144±10)、4 周(125±8)比(163±8)、8 周(128±5)比(177±10)mmHg](P<0.05)；使用氨氯地平后，AAB+Aml組較AAB組LVM/BW降低[2周(2.21±0.17)比(1.94±0.15)、4周(2.45±0.16)比(2.13±0.08)、8周(2.68±0.15)比(2.18±0.10) mg/g](P<0.05)；使用氨氯地平后AAB+Aml組較AAB組心肌細胞肥大程度減低。AAB+Aml組心肌組織GRP94及CHOP表達量低于AAB組(P<0.05)。結(jié)論氨氯地平可能通過減弱高血壓觸發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激而保護心肌細胞及減弱心室肥厚。

氨氯地平；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94；CAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白；心室肥厚

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有折疊蛋白、維持鈣穩(wěn)態(tài)及合成脂質(zhì)的功能。氧化應激、缺血性損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失衡和未/誤折疊蛋白大量聚集時都會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[1]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose-regulated protein 94,GRP94)是ERS的分子伴侶，主要功能是與未折疊蛋白結(jié)合使蛋白不相互聚集，維持細胞穩(wěn)態(tài)[2]；CAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CAAT/enhancer-binding protein homologous protein. CHOP)為ERS特異的轉(zhuǎn)錄因子，是由抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)換的重要信號分子[3]。多種心血管疾病的病理生理過程均有ERS的參與[4]，但是否參與高血壓左心室肥厚，是哪些分子發(fā)揮作用尚不清楚。氨氯地平是新型鈣拮抗劑，因降壓平穩(wěn)和副作用少，且對靶器官具有保護作用而被廣泛應用于臨床。但其保護靶器官的具體機制目前仍不清楚。本研究探討大鼠高血壓時心肌組織發(fā)生ERS的機制及氨氯地平減弱左室肥厚的分子機制，為氨氯地平的臨床應用提供更充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級SD大鼠120只，雄性，鼠齡8～10周齡，體質(zhì)量180～220 g(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，動物合格證號：2012- 0007)。氨氯地平(蘇州東瑞制藥有限公司)；兔抗大鼠GRP94抗體和兔抗大鼠CHOP抗體(Epitomics公司)；辣根過氧化物酶標記(HRP)的羊抗兔二抗(Santa Cruz公司)；

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及高血壓模型的建立：將大鼠隨機分為假手術組、腹主動脈縮窄術(AAB)組和氨氯地平干預(AAB+Aml)組，每組40只。分為2、4和8周3個亞組，每組隨機選取6只進行后續(xù)測定。腹主動脈縮窄術高血壓大鼠模型建立方法參考文獻[5]。

1.2.2 大鼠平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)及左心室質(zhì)量/體質(zhì)量(left ventricular mass/body mass, LVM/BW)的測定：具體方法參考文獻[6]。

1.2.3 HE染色及免疫組化染色檢測心肌組織GRP94和CHOP的表達：具體實驗方法參考文獻[7]。

1.2.4 Western blot檢測心肌組織GRP94和CHOP蛋白的表達：提取心肌組織總蛋白，測定蛋白含量。每孔道加入50 μg蛋白進行SDS-PACE電泳并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后于50 g/L脫脂奶粉TBST下室溫封閉2 h，分別加入1∶1 000兔抗大鼠GRP94和CHOP，4 ℃振搖孵育過夜。TBS洗膜10 min×3次，加入二抗(1∶6 000), 室溫下振搖90 min并洗膜。然后加入ECL試劑發(fā)光，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，以靶蛋白IOD值/β肌動蛋白(β-actin) IAD值反映靶蛋白的相對水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 氨氯地平對大鼠血壓的影響

與假手術組相比，各時間點AAB組血壓明顯升高(均P<0.05)。較AAB組相比，AAB+Aml組血壓明顯下降(均P<0.05)(表1)。

表1 不同時間各組大鼠的MAP

*P<0.05 compared with sham group；△P<0.05 compared with AAB group of 2 weeks；#P<0.05 compared with AAB group of 4 weeks；☆P<0.05 compared with AAB group.

2.2 氨氯地平對大鼠LVM/BW的影響

假手術組在2、4和8周3個時間點LVM/BW無明顯差異。AAB組大鼠LVM/BW隨著術后時間延長而增加(P<0.05)。與假手術組相比，AAB組LVM/BW升高(均P<0.05)。與AAB組相比，AAB+Aml組LVM/BW下降(P<0.05)(表2)。

表2 不同時間各組大鼠的LVM/BW

*P<0.05 compared with sham group；△P<0.05 compared with AAB group of 2 weeks；#P<0.05 compared with AAB group of 4 weeks；☆P<0.05 compared with AAB group.

2.3 各組大鼠心肌細胞形態(tài)的變化

與假手術組相比，AAB組心肌細胞肥大程度明顯增強。與AAB組相比，AAB+Aml組心肌細胞肥大程度明顯減小(圖1)。

2.4 大鼠心肌細胞GRP94的定性表達

AAB組大鼠心肌GRP94的表達主要定位于心肌細胞胞質(zhì)中，染色呈棕黃色，術后2周時表達微量，4周時增強，8周時減弱。與假手術組比較，AAB組心肌細胞中棕黃色顆粒即GRP94表達明顯；與AAB組比較，AAB+Aml組心肌細胞中棕黃色顆粒即GRP94表達不明顯(圖2)。

2.5 大鼠心肌細胞CHOP的定性表達

AAB組大鼠心肌CHOP的表達主要定位于心肌細胞胞質(zhì)中，染色呈棕黃色，AAB組術后2周時表達微量，4周時增強，8周時最強。AAB組心肌細胞中棕黃色顆粒即CHOP表達較假手術組明顯；AAB+Aml組心肌細胞中棕黃色顆粒即CHOP表達較AAB組不明顯(圖3)。

2.6 大鼠心肌細胞GRP94及CHOP的定量表達

假手術組大鼠3個時間點心肌組織GRP94無明顯變化。AAB組大鼠心肌組織GRP94蛋白2周表達明顯，4周表達最強，8周表達有所減弱，4周時，AAB組GRP94蛋白表達水平較假手術組和AAB+Aml組明顯升高(P<0.05)(圖4)。

假手術組大鼠3個時間點心肌組織CHOP無明顯意義。AAB組CHOP蛋白表達呈逐漸增加，8周最強。4周和8周時， AAB組CHOP蛋白表達水平較假手術組和AAB+Aml組升高(P<0.05)。AAB+Aml組CHOP蛋白表達呈逐漸增加趨勢，8周最強。

圖1 大鼠心肌細胞HE染色結(jié)果Fig 1 HE staining results of rats myocardial cell(×200)

3 討論

腹主動脈縮窄致高血壓可引起血管平滑肌細胞(VSMCS)ERS反應，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關因子鈣網(wǎng)蛋白表達增加及caspase- 12的活化增高；拉西地平通過下調(diào)ERS水平，逆轉(zhuǎn)高血壓所致的VSMCS的損傷作用，對VSMCS具有保護作用[5]。本研究通過大鼠腹主動脈縮窄術建立了高血壓模型。

*P<0.05 compared with sham group； △P<0.05 compared with AAB group of 2 weeks

腹主動脈縮窄后，大鼠血壓及LVM/BW較假手術組升高，心肌細胞較假手術組明顯肥大，說明發(fā)生了高血壓左心室肥厚，模型建立成功。給予大鼠鈣拮抗劑氨氯地平干預后，大鼠血壓、LVM/BW較AAB組降低，心肌細胞肥大程度較AAB組明顯減輕，說明氨氯地平減輕心肌細胞受損。

GRP94是ERS分子伴侶，主要于ERS早期表達，加快蛋白折疊，促進細胞存活，其表達量在一定程度上反映了ERS的強度[8]。有報道在主動脈弓縮窄術的高血壓小鼠模型，1周后發(fā)現(xiàn)小鼠心肌組織中GRP94、GRP78、p-PERK及p-ERK等ERS信號分子表達較假手術組明顯增加[9]。本實驗觀察到，腹主動脈縮窄術后2周，GRP94就有一定表達，4周時達最大值，之后減少。說明GRP94主要于心肌肥厚早期高表達，提示其可能發(fā)揮了保護心肌細胞的作用。氨氯地平明顯減少GRP94表達量，提示氨氯地平可能在高血壓觸發(fā)的ERS早期通過降低ERS反應強度減弱了心室肥厚。

CHOP是ERS標志性凋亡分子，于ERS后期表達增強，加快細胞凋亡[10]。腹主動脈縮窄可使p38α未缺失的小鼠心肌中CHOP強表達，而p38α缺失的小鼠心肌中CHOP則未表達[11]。有報道隨著模型大鼠血壓的不斷升高可誘導以CHOP蛋白為代表的凋亡因子在心肌中超表達，誘導細胞凋亡[12]。本實驗觀察到，腹主動脈縮窄2周，CHOP有弱表達，4周時稍強，8周時最強。提示CHOP可能與高血壓后期左心室肥厚有關，激活下游凋亡通路，加速心肌細胞凋亡。氨氯地平后明顯減少CHOP表達量，提示氨氯地平可能在高血壓觸發(fā)的ERS后期可通過降低ERS反應強度減弱了心室肥厚。

綜上所述，在高血壓大鼠模型心肌組織中，ERS信號分子GRP94和CHOP表達增加，提示高血壓觸發(fā)的ERS可能與高血壓引起的心室肥厚有關；而氨氯地平可能通過降低ERS反應強度影響了心室肥厚。但是否還有其他信號分子參與有待進一步研究。

國內(nèi)外已有結(jié)論:腹主動脈縮窄致可引起大鼠血壓升高、心肌細胞形態(tài)改變并導致心室肥厚。ERS在多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。氨氯地平是新型鈣拮抗劑，因降壓平穩(wěn)副作用少且對靶器官具有保護作用而被廣泛應用于臨床。

本文的特色與見解：高血壓大鼠模型心肌組織中，ERS信號分子GRP94和CHOP表達增加，提示高血壓觸發(fā)的ERS可能與高血壓引起的心室肥厚有關；而氨氯地平可能通過降低GRP94及CHOP表達減弱了ERS，從而減弱了心室肥厚。

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Amlodipine decreases myocardial endoplasmic reticulum stress in rats with abdominal aortic banding hypertension

LIU Jing*, ZHAO Lian-you, LI Xue, GUO Li, ZHANG Zhi-min, DING Lu, LI Xiao-li

(Dept. of Cardiology, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038,China)

ObjectiveTo study the expression of protein 94 (GRP94) and C/EBP-homologous protein (CHOP) in myocardial tissue of hypertensive rats and to investigate the effects of amlodipine on endoplasm retieulum stress(ERS) and ventricular hypertrophy in abdominal aortic banded rats.MethodsOne hundred and twenty adult male SD rats with criteria were divided randomly into three groups：sham-operated group, abdominal aortic banding(AAB) and AAB treated with amlodipine (AAB+Aml)groups(n=40). In sham-operated rats, the abdominal aorta was isolated but not constricted, while the abdominal aorta were constricted in AAB rats. The AAB+Aml group was treated by abdominal aortic constriction and treated with amlodipine [10 mg/(kg·d)]. According to the time of surgery，each group was further divided into 2, 4 and 8-week postoperative subgroups (n=6). Mean arterial pressure (MAP), the 1eft ventricular mass (LVM) and body mass (BM) were measured and (LVM/BM) was calculated. The morphology of cardiomyocytes was observed by HE staining. The protein level of GRP94 and CHOP was analyzed by immunohistochemistry and western blot.Results1)With time after surgery, MAP and LVM/BW of AAB group increased gradually, and they were obviously higher than the sham operation group[MAP: 2 weeks (144 ± 10)vs(118 ± 9), 4 weeks (163±8)vs(120±7), 8 weeks(177±10)vs(120±6)mmHg; LVW/BW: 2 weeks (2.21±0.17)vs(1.91±0.12), 4 weeks (2.45±0.16)vs(2.01±0.14), 8 weeks (2.68±0.15)vs(2.05±0.09)mmHg；(P<0.05)].The cardiomyocytes in AAB group were hypertrophic as compared to the sham group. The expression of GRP94 in AAB group increased significantly at 2 weeks post-operation, and reached peak level at 4 weeks after the surgery and was on the decline thereafter. The expression of CHOP and GRP94 in AAB rats were significantly higher than sham group, and reached the peak at the 8 weeks after surgery. 2)Treatment with amlodipine significantly reduced MAP and LVM/BW in AAB rats[(MAP: 2 weeks (126±6)vs(144±10), 4 weeks (125±8)vs(163±8), 8 weeks (128±5)vs(177±10)mmHg；LVM/BW: 2 weeks (1.94±0.15)vs(2.21±0.17), 4 weeks (2.13±0.08)vs(2.45±0.16), 8 weeks (2.18±0.10)vs(2.68±0.15)mg/g; (P<0.05)].The myocardial hypertrophic was alleviated in AAB+Aml group. The level of GRP94 and CHOP in AAB+Aml group was lower than those in AAB rats(allP<0.05).ConclusionsEndoplasmic reticulum stress is involved in the ventricular remodeling caused by hypertension, and use of amlodipine can reduce ventricular hypertrophy in hypertension models possibly by inhibiting endoplasmic reticulum stress via down-regulation of GRP94 and CHOP.

amlodipine；endoplasmic reticulum stress；glucose-regulated protein 94; CAAT/enhancer-binding protein homologous protein; ventricular hypertrophy

2016- 11- 29

2017- 03- 28

*通信作者(correspondingauthor)：liujing1314aiwojia@163.com

1001-6325(2018)01-0080-07

R544.1

A