結(jié)直腸癌KRAS突變與臨床病理特征的關(guān)系

晉 龍，眭玉霞，王麗萍，陳靈鋒，陳小巖

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 福建省立醫(yī)院 1.病理科； 2.藥學(xué)部， 福建 福州 350001)

研究論文

結(jié)直腸癌KRAS突變與臨床病理特征的關(guān)系

晉 龍1，眭玉霞2*，王麗萍1，陳靈鋒1，陳小巖1

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 福建省立醫(yī)院 1.病理科； 2.藥學(xué)部， 福建 福州 350001)

目的檢測結(jié)直腸患者KRAS的突變情況，分析KRAS突變與臨床病理特征的關(guān)系。方法應(yīng)用蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)熒光定量PCR技術(shù)，檢測結(jié)直腸癌患者KRAS第12和13位密碼子的突變情況并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果1 207例結(jié)直腸癌KRAS突變率為42.92%(518/1 207)。第12號密碼子6種突變類型，其中G12D突變率16.32%(197/1 207)；G12V突變率10.36%(125/1 207)；G12C突變率3.31%(40/1 207)；G12S突變率2.40%(29/1 207)；G12A突變率1.74%(21/1 207)；G12R突變率0.58%(7/1 207)。第13號密碼子G13D突變率為9.69%(117/1 207)。還檢測出8種同時存在兩種突變類型及一種同時存在3種突變類型。女性患者KRAS突變率(46.21%)高于男性(40.46%，P<0.05)。KRAS在右半結(jié)腸突變率(46.45%)和直腸突變率(44.50%)均高于左半結(jié)腸(37.50%，P<0.05)。結(jié)論結(jié)直腸癌KRAS突變有多種類型，并且多種突變類型可同時存在。女性患者突變率高于男性患者，右半結(jié)腸和直腸突變率均高于左半結(jié)腸。

結(jié)直腸腫瘤；DNA突變分析；基因；ras；聚合酶鏈反應(yīng)

最新癌癥統(tǒng)計結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC) 發(fā)病率居全球常見惡性腫瘤的第3位，病死率居第4位[1]。隨著CRC病死率逐年增高，臨床標準的手術(shù)及放、化療方案已滿足不了現(xiàn)狀[2]，伴隨著精準醫(yī)療理念的準入，CRC的治療也迎來個體化靶向治療時代。分子靶向藥物西妥昔單抗應(yīng)用于結(jié)直腸癌治療是近年來結(jié)直腸癌藥物治療的重大進展之一[3]。

藥物臨床研究結(jié)果表明，KRAS的2號外顯子第12、13位密碼子的突變狀態(tài)與阻斷EGFR的單克隆抗體——西妥昔單抗、帕尼單抗的療效明確相關(guān)，KRAS野生型的患者可以從西妥昔單抗和帕尼單抗的治療中獲得最大化的生存效益，而KRAS突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益，反而徒增不良反應(yīng)危險和治療費用[4- 5]。

早在2008年確定KRAS狀態(tài)為是否對結(jié)直腸癌患者使用西妥昔單抗的標準之一。同時中國衛(wèi)生部頒布的《結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2010年版)》中也推薦西妥昔單抗用于治療KRAS野生型患者。2011年美國《國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實踐指南》已明確提出KRAS狀態(tài)檢測為是否對結(jié)直腸癌患者使用西妥昔單抗或帕尼單抗的標準，接受EGFR單抗治療前需進行KRAS檢測。

應(yīng)用蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(scorpions amplification refractory mutation system, scorpions ARMS)熒光定量PCR方法，對1 207例結(jié)直腸癌腫瘤組織標本進行KRAS2號外顯子第12、13位密碼子的7個突變位點進行檢測，分析其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料：收集福建省立醫(yī)院病理科2013年9月至2016年7月確診的1 207例行手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標本。其中男性692例，女性515例，年齡24～83歲，平均62.46歲。所有材料均為10%中性甲醛固定、石蠟包埋的組織。該研究經(jīng)本單位倫理委員會批準并取得所有涉及該項研究患者的同意。

1.1.2 試劑： DNA/RNA共分離試劑盒及KRAS突變基因檢測試劑(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 組織DNA的提?。呵腥?張5 μm厚的石蠟包埋組織樣本，置于1.5 mL EP管內(nèi)，二甲苯脫蠟后用DNA分離試劑盒提取基因組DNA。使用Nanodrop 2000測定DNA的濃度，DNA的A260/A280介于1.8～2.1。

1.2.2 蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(scorpions amplification refractory mutation system, scorpions ARMS)熒光定量PCR檢測石蠟包埋組織KRAS的2號外顯子12、13位密碼子的7個突變位點：根據(jù)試劑盒說明操作：PCR反應(yīng)條件為：第1階段：42 ℃ 5 min，95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；第2階段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s,10個循環(huán)；第3階段：93 ℃ 20 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，共30個循環(huán)；信號收集：第3階段60 ℃時收集FAM和HEX信號，進行實時定量PCR。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組間KRAS突變與CRC臨床病理特征參數(shù)關(guān)系用χ2檢驗及Fisher精確概率法進行檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS在結(jié)直腸癌中突變檢測結(jié)果

1 207例結(jié)直腸癌標本中檢測到518例KRAS突變，突變檢出率為 42.92%(518/1207)。第12號密碼子檢出6種突變類型和第13號密碼子檢出1種突變。并且還檢測出8種同時存在兩種突變類型(雙突變)及一種同時存在3種突變類型(3突變)，五例G12D和G12C雙突變，三例G12D和G13D雙突變，三例G12D和G12V雙突變，二例G12D和G12A雙突變，二例G12A和G12C雙突變，G12D和G12S雙突變、G12A和G12V雙突變及G12V和G12C雙突變各一例。3突變類型為G12D、G13D及G12A同時突變1例(圖1，表1)。

A.G12D mutation; B.G12V mutation; C.G12C mutation; D.G12S mutation; E.G12A mutation; F.G12R mutation; G.G13D mutation

圖1 KRAS突變Fig 1 KRAS mutations

2.2 KRAS突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

本組研究中女性結(jié)直腸癌患者KRAS突變檢出率為46.21%(238/515)，明顯高于男性患者40.46%(280/692)(P<0.05)。并且檢測還發(fā)現(xiàn)，KRAS在右半結(jié)腸癌突變率(46.45%，131/282)和直腸癌突變率(44.50%，255/573)高于左半結(jié)腸(37.50%，132/352)(P<0.05)。而與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期、分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。KRAS突變在術(shù)前血清癌胚抗原(CEA)升高組的突變檢出率50.00%(247/494)高于術(shù)前血清癌胚抗原(CEA)正常組34.56%(179/518)(P<0.05)。并且KRAS突變在術(shù)前血清CA199升高組的突變檢出率57.53%(168/292)高于術(shù)前血清CA199正常組35.44%(252/711)(P<0.05)(表2)。

3 討論

應(yīng)用將蝎形探針(scorpion)及擴增阻滯突變系統(tǒng)結(jié)合起來的scorpion ARMS法熒光定量PCR技術(shù)檢測1 207例結(jié)直腸癌患者KRAS2號外顯子第12和13位密碼子的突變變情況。該方法最大的優(yōu)點是敏感性高達1.0%，可檢測出樣品中含量低至1.0%的突變基因，可以最大限度地縮短目標產(chǎn)物的長度，解決因石蠟包埋組織標本提取的DNA大部分片段化而無法得到準確檢測結(jié)果的難題。

表2 KRAS突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05 compared with left colon；**P<0.05 compared with left colon.

研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌突變檢出率為42.92%。與文獻報道的結(jié)直腸癌KRAS突變檢出率30%～45%相符[4- 7]，ARMS熒光定量PCR技術(shù)可以快速準確地檢測出結(jié)直腸癌石蠟組織KRAS的突變狀態(tài)。KRAS突變檢出率與國內(nèi)研究相比稍偏高[8]，這有可能與福建省為胃腸道惡性腫瘤高發(fā)地區(qū)有關(guān)。

國內(nèi)外均報道少見KRAS2號外顯子第12和13位密碼子同時突變，而本次研究發(fā)現(xiàn)8種同時存在2種突變類型(雙突變)及一種同時存在3種突變類型(3突變)，包括五例G12D和G12C雙突變，三例G12D和G13D雙突變，三例G12D和G12V雙突變，二例G12D和G12A雙突變，二例G12A和G12C雙突變，G12D和G12S雙突變、G12A和G12V雙突變及G12V和G12C雙突變各一例。3突變類型為G12D、G13D及G12同時突變一例。雖然G12D和G12S及G12A和G12V雙突變類型國內(nèi)學(xué)者有報道[10]，但是其余雙突變類型國內(nèi)鮮有報道。國外學(xué)者也有報道在結(jié)直腸癌病例中同時檢測到第12和13位密碼子雙突變或者3突變，如G12D與G13D雙突變，G12S、G12A與G13S3突變等[9- 10]。說明在結(jié)直腸癌腫瘤組織中KRAS突變類型有多種形式，并見可以存在多種突變類型同時存在。

研究結(jié)果顯示，女性患者KRAS突變率高于男性，這與國內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果相符[11],這可能提示KRAS突變直接或間接與性激素相關(guān)。而KRAS突變與患者年齡、腫瘤大小、分化程度、組織學(xué)類型無相關(guān)性。

并且還發(fā)現(xiàn)KRAS在右半結(jié)腸癌突變率和直腸癌突變率高于左半結(jié)腸。有學(xué)者報道，KRAS突變與結(jié)直腸癌發(fā)生部位具有明顯關(guān)系，認為KRAS突變在近端結(jié)腸更常見，其中KRAS以第13位密碼子突變在近端結(jié)腸更常見[9],但也有報道KRAS第12密碼子突變更常見于近端結(jié)腸癌[12]，這也與研究結(jié)果KRAS突變更常見于右半結(jié)腸相符。而且檢測KRAS以G12D位點突變最多見，由于此位點靠近基因的功能區(qū)，是導(dǎo)致KRAS功能喪失的主要原因，提示KRAS功能的喪失在右半結(jié)腸癌和直腸癌要比左半結(jié)腸癌更為普遍。

目前CRC可通過手術(shù)切除、化療、放療和靶向治療等多種方式進行治療，靶向結(jié)直腸癌治療的EGFR單抗藥物出現(xiàn)對治療CRC具有里程碑的意義，結(jié)直腸癌患者組織中KRAS存在較高的突變率，通過檢測KRAS突變狀態(tài)可以有針對性地篩選出對抗EGFR單抗藥物治療有效的結(jié)直腸癌患者，能夠更有效地指導(dǎo)精準醫(yī)學(xué)個體化治療。

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Correlation ofKRASmutations and clinicopathological parameters in colorectal carcinoma

JIN Long1, SUI Yu-xia2*, WANG Li-ping1, CHEN Ling-feng1, CHEN Xiao-yan1

(1.Dept. of Pathology; 2.Dept. of Pharmacy, Fujian Provincial Hospital, Fujian Provincial Clinical Medical College,Fujian Medical University, Fuzhou 350001，China)

ObjectiveTo investigate mutation rate and types ofKRASin colorectal carcinoma, and to analyze the relationship betweenKRASmutation and clinicopathological parameters in patients with colorectal carcinoma(CRC).MethodsScorpions Amplification Refractory Mutation System(ARMS) fluorescence quantitative PCR was performed to detect the mutations in codons 12 and 13 ofKRASand to correlate between clinicopathological characteristics and the presence of variousKRASmutations of colorectal carcinoma.ResultsKRASmutations were identified in 518 patients(42.92%)，including G12D(197 cases, 16.32%)，G12V(125 cases, 10.36%)，G12C(40 cases, 3.31%)，G12S(29 cases, 2.40%)，G12A(21cases, 1.74%)，G12R(7 cases, 0.58%)，13D(117 cases, 9.69%). Female patients had a higherKRASmutation rate than male (46.21%, 238/515 vs.40.46%, 280/692,P<0.05).KRASmutation was significantly higher in right colon cancer(46.45%，131/282)and in rectal cancer(44.50%，255/573)than that in left colon cancer(37.50%，132/352)(P<0.05，P<0.05).ConclusionsThere are many types ofKRASmutations in colorectal cancer, and many mutation types exist simultaneously.The detection rate ofKRASmutation is higher in female CRC patients than in the males. The detection rate ofKRASmutation is significantly higher in right colon cancer and in rectal cancer than that in left colon cancer.

colorectal neoplasms; DNA mutational analysis; genes; ras; polymerase chain reaction

2016- 12- 12

2017- 03- 23

福建省自然科學(xué)基金(2015J01424)；福建省立醫(yī)院院內(nèi)優(yōu)秀青年基金(2014074)

*通信作者(correspondingauthor)：suiyuxiapharmacy@163.com

1001-6325(2018)01-0032-05

R735.35

A