基因工程法合成間苯三酚

崔鑫 閻振鑫 宋偉國(guó)， 林文瀚 彼得·普勞克斯，

（1. 濰坊科技學(xué)院化工與環(huán)境學(xué)院，濰坊 262700；2. 壽光富康制藥研發(fā)部，濰坊 262700）

基因工程法合成間苯三酚

崔鑫1閻振鑫2宋偉國(guó)1，2林文瀚2彼得·普勞克斯1，2

（1. 濰坊科技學(xué)院化工與環(huán)境學(xué)院，濰坊 262700；2. 壽光富康制藥研發(fā)部，濰坊 262700）

為進(jìn)一步提高生物法合成間苯三酚的效率，探究生物合成間苯三酚的分子機(jī)理以及更加高效的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分。對(duì)來(lái)自熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的phlD基因進(jìn)行了克隆，在BL21（DE3）中重建間苯三酚的胞內(nèi)合成途徑，超表達(dá)多重抗藥基因正向調(diào)節(jié)因子（marA）和乙酰輔酶A羧化酶（ACCase），并分析不同碳源及培養(yǎng)基離子環(huán)境對(duì)間苯三酚積累量的影響。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建間苯三酚胞內(nèi)合成途徑，產(chǎn)量達(dá)到450 mg/L，marA基因能夠提高工程菌對(duì)間苯三酚抵抗力，使間苯三酚產(chǎn)量提高到1 060 mg/L；ACCase能夠提高胞內(nèi)丙二酰輔酶A的含量，使間苯三酚產(chǎn)量提高到2 120 mg/L；葡萄糖、甘油和丙酮酸鈉三種碳源的比較中，葡萄糖對(duì)合成間苯三酚最為有利，分別是甘油和丙酮酸鈉的1.8倍和2.4倍；培養(yǎng)基中鈣鎂離子對(duì)間苯三酚的合成沒(méi)有影響。marA和ACCase基因的超表達(dá)能大大提高間苯三酚生物合成的效率，以葡萄糖為碳源的無(wú)鈣鎂培養(yǎng)基為間苯三酚發(fā)酵的最適培養(yǎng)基。

間苯三酚；MarA；ACCase；PhlD

間苯三酚及其衍生物在自然界中分布廣泛，在多種植物和微生物中都有分布［1］。間苯三酚是一種重要的醫(yī)藥中間體和有機(jī)合成中間體，具有良好的抗病毒［2］、抗腫瘤［3］、抗菌、消炎［4］、止血及收縮子宮［5］等藥理活性，市場(chǎng)前景極為廣闊。其在國(guó)內(nèi)外的需求量逐年上升，而傳統(tǒng)的化學(xué)合成法生產(chǎn)技術(shù)落后，環(huán)境污染嚴(yán)重，產(chǎn)品質(zhì)量跟不上醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

Weller和Achkar等［6-7］發(fā)現(xiàn)在熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）中phlACBD 操縱子可以合成2，4-二乙?；g苯三酚（2，4- DA PG），而phlD是其中的關(guān)鍵基因，phlD與III型聚酮合酶（PKSIII）之一查爾酮合酶（Chalcone synthase，CHS）結(jié)構(gòu)和功能的相似性很高［8］。間苯三酚本身可作為黃酮及類黃酮合成的中間體，其合成和代謝途徑與CHS催化合成黃酮及類黃酮類物質(zhì)的途徑相似［9］。在大腸埃希菌胞內(nèi)的碳循環(huán)途徑中存在少量丙二酰輔酶A，phlD可利用3分子的丙二酰輔酶A合成1分子的間苯三酚［7］，單獨(dú)克隆phlD基因可合成間苯三酚［10-12］。在phlD的異源表達(dá)方面前人已經(jīng)做了較多研究。例如，Achkar等［7］在phlD的異源表達(dá)研究中將間苯三酚的產(chǎn)量提高到780 mg/L；Rao等［13］在phlD異源表達(dá)的穩(wěn)定性方面所做的研究使phlD蛋白在37℃下的半衰期比野生型提高了24倍。然而，由于目前單位產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高，間苯三酚的生物合成法沒(méi)有在工業(yè)生產(chǎn)中被推廣應(yīng)用。

導(dǎo)致生物合成法產(chǎn)量低的關(guān)鍵問(wèn)題是：（1）間苯三酚是多種抗生素的前體［14］，具有較強(qiáng)的抑菌能力，且其水溶液呈酸性，在培養(yǎng)基中積累后嚴(yán)重抑制工程菌的生長(zhǎng)；（2）phlD合成間苯三酚的直接前體丙二酰輔酶A在大腸埃希菌胞內(nèi)含量較低，且胞內(nèi)存在多條消耗丙二酰輔酶A的競(jìng)爭(zhēng)性代謝通路［15］。大腸埃希菌多重抗藥基因正向調(diào)節(jié)因子（marA）能參與調(diào)控60多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，能提高大腸埃希菌的主動(dòng)外排泵系統(tǒng)（AcrAB-TolC）的外排能力，提高大腸埃希菌對(duì)抗生素的抵抗能力［16-17］。乙酰輔酶A羧化酶（ACCase，EC 6.4.1.2）可以催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A［18］。所以在大腸埃希菌細(xì)胞中超表達(dá)marA和ACCase能夠較好的解決上文提到的這兩個(gè)問(wèn)題。

雖然對(duì)phlD基因的研究論文較多，但是與marA及ACCase關(guān)聯(lián)研究并且對(duì)培養(yǎng)基的碳源及離子環(huán)境進(jìn)行綜合探索的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究克隆并超表達(dá)基因MarA和ACCase，以提高細(xì)胞對(duì)間苯三酚的抵抗能力和胞內(nèi)丙二酰輔酶A的含量［13］；探究甘油、葡萄糖、丙酮酸鈉等不同碳源以及Mg2+和Ca2+對(duì)間苯三酚產(chǎn)量的影響，旨在使生物合成法制備間苯三酚的成本進(jìn)一步降低。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 本研究所用菌株和質(zhì)粒均為本研究構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)自全式金生物技術(shù)有限公司和Novagen公司，詳見(jiàn)表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒與菌株

1.1.2 酶、引物及相關(guān)試劑盒 高保真DNA聚合酶KOD-plus購(gòu)自TOYOBO（東洋紡），Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒及細(xì)菌總DNA提取試劑盒均購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶及T4連接酶購(gòu)自Thermo Scientific公司，PCR引物（表2）由生工生物（上海）有限公司合成。間苯三酚色譜級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，氯化鈉10.0，酵母粉5.0，用1N氫氧化鈉調(diào)整pH為7.4；制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加2%的瓊脂。TB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化鈉1.0，磷酸二氫鉀17 mmol/L，磷酸氫二鉀72 mmol/L，用1N氫氧化鈉調(diào)整pH為7.4。M9改良培養(yǎng)基（g/L）：磷酸氫二鈉3.0、磷酸二氫鉀1.5、氯化銨0.5，蛋白胨10.0。

表2 本實(shí)驗(yàn)使用到的引物

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)：挑取生長(zhǎng)良好的單一菌落，接種于25 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min，震蕩培養(yǎng)24 h。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將2%種子培養(yǎng)液接種于100 mL TB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min，震蕩培養(yǎng)至光密度值optical density，OD值0.6-0.8，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至0.1 mmol/L，24℃、160 r/min 培養(yǎng)48 h，定時(shí)取樣，檢測(cè)間苯三酚的積累量。

M9培養(yǎng)基發(fā)酵：將2%種子培養(yǎng)液接種于100 mL M9培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min，震蕩培至OD值0.6-0.8，加IPTG至0.1 mmol/L，32℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，HPLC檢測(cè)間苯三酚的積累量。

1.2.2 基因的擴(kuò)增與質(zhì)粒的構(gòu)建 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得熒光假單胞菌（P. fluorescens F113）來(lái)源的phlD基因序列（GenBank ID：11830552）。phlD經(jīng)大腸埃希菌密碼子偏好性修改后，合成其全基因序列。將phlD及pET28a分別用Nde I和BamH I雙酶切，連接得到重組質(zhì)粒pET28a-phlD（圖1-A），測(cè)序確認(rèn)。

以E. coli DH5α全基因組DNA為模板，擴(kuò)增marA（GenBank ID ：947613）、accA（GenBank ID ：944895）、accBC（GenBank ID ：947758，GenBank ID：947761） 和 accD（GenBank ID：946796）。 將marA插入pACYCDuet-1得到重組質(zhì)粒pA-marA（Nco I和BamH I，圖1-B）。以pA-marA質(zhì)粒為PCR模板，克隆連接有T7啟動(dòng)子的marA，并插入pET28a-phlD質(zhì)粒，得到pET28a-phlDmarA重組質(zhì)粒（Sal I和Xho I，圖1-C）。將accA和accD分別插入pACYCDuet-1質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pA-accA（Nco I和BamH I）和pA-accD（Nco I和BamH I）；以 pA-accD為模板克隆T7accD片段，并插入pA-accA得到重組質(zhì)粒pA-accAD（Sal I和Hind III）；最后將 accBC插入 pA-accAD質(zhì)粒的得到重組質(zhì)粒pA-accADBC（Nde I和Xho I，圖1-D）。用T7引物與基因特異引物組合法進(jìn)行重組子的PCR篩選，并測(cè)序確認(rèn)。

1.2.3 分析方法 HPLC法定量檢測(cè)發(fā)酵液中間苯三酚的含量具體條件參見(jiàn)《歐洲藥典》8.7版，流動(dòng)相A為1.36 g/L的磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調(diào)pH至3.0；流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫；色譜柱為C18反相柱Thermo SCIENTIFIC syncronis Dim（mm）250*4.6，粒徑5 μm。流速為1.0 mL/min柱溫 30℃，進(jìn)樣量 20 μL，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng) 265 nm。間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間約為8.9 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：C=0.296 5S+32.1（C代表間苯三酚濃度，單位：mg/L；S代表峰面積）相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

H-NMR分析確認(rèn)發(fā)酵液中間苯三酚結(jié)構(gòu)，核磁共振譜采用DMX20型核共振儀（Bruker公司）測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 phlD、marA、accA、accD和accBC基因的克隆及pET28a-phlDmarA和pA-accADBC表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建

PCR克 隆 獲 得 phlD、marA、accA、accD和accBC基因的CDS區(qū)序列，結(jié)果見(jiàn)圖2，經(jīng)測(cè)序分析，其大小分別為1 050 bp、384 bp、960 bp、915 bp和1 830 bp，與GenBank所登記序列大小一致。

圖1 原核表達(dá)phlD、marA和 ACCase 的重組質(zhì)粒圖譜

重 組 質(zhì) 粒 pET28a-phlD、pET28a-phlDmarA、pA-accAD和pA-accADBC的質(zhì)粒酶切圖譜見(jiàn)圖3，經(jīng)BGI測(cè)序，確認(rèn)重組質(zhì)粒包含完整插入基因序列且無(wú)突變。

圖2 phlD的全合成以及marA、accA、accD和accBC克隆瓊脂糖凝膠電泳

2.2 BL21（DE3）胞內(nèi)間苯三酚合成途徑的構(gòu)建

圖3 重組質(zhì)粒pET28a-phlD、pET28a-phlDmarA、pA-accAD和pA-accADBC的酶切鑒定圖譜

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-phlD轉(zhuǎn)入BL21（DE3）細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白分析，成功檢測(cè)到phlD蛋白（圖4-A）。取40 h發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取后進(jìn)行TLC及HPLC分析，在TLC分析中樣品斑與陽(yáng)性對(duì)照一致；在HPLC分析中樣品出峰時(shí)間（8.9 min）及光譜峰與標(biāo)準(zhǔn)品均一致。使用葡萄糖-TB培養(yǎng)基發(fā)酵，經(jīng)HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，間苯三酚產(chǎn)量達(dá)到520 mg/L（使用LB培養(yǎng)基產(chǎn)量?jī)H為350 mg/L，TB培養(yǎng)基改善了發(fā)酵液的pH環(huán)境）。發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取濃縮后用DMSO溶解進(jìn)行1HNMR檢測(cè)，確認(rèn)了間苯三酚的存在，如圖5。間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)品1H NMR（400 MHz，DMSO）：δ8.95（s，3H），5.65（s，3H）；間苯三酚樣品1H NMR（400 MHz，DMSO）：δ8.95（s，3H），5.66（s，3H）。

圖4 SDS-PAGE蛋白分析

圖5 1H-NMR鑒定

2.3 超表達(dá)marA及ACCase對(duì)提高間苯三酚產(chǎn)量及積累速度的影響

將pET28a-phlDmarA和pA-accADBC兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）細(xì)胞，超表達(dá)蛋白（箭頭標(biāo)注）的分子量依次與AccC、PhlD、AccA、AccD（與AccA亞基分子量相近合并為一條帶）、AccB和MarA的理論大小一致，見(jiàn)圖4-B。

使用2.5%葡萄糖碳源TB培養(yǎng)基分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵對(duì)比實(shí)驗(yàn)（圖6，n=3），IPTG誘導(dǎo)后8、16、24、32、40和48 h取樣，HPLC檢測(cè)間苯三酚積累量（圖6）。數(shù)據(jù)顯示間苯三酚積累峰值在40 h左右出現(xiàn)，之后濃度逐漸降低。同時(shí)超表達(dá)phlD和marA的最高產(chǎn)量（1 060 mg/L）是僅超表達(dá)phlD最高產(chǎn)量（450 mg/L）的2.35倍，經(jīng)T檢驗(yàn)分析具有極顯著差異（P＜0.01）；同時(shí)超表達(dá)phlD、marA和ACCase的最高產(chǎn)量（2 120 mg/L）是僅超表達(dá)phlD最高產(chǎn)量的4.71倍，經(jīng)T檢驗(yàn)分析具有極顯著差異（P＜0.01）；是同時(shí)超表達(dá)phlD和marA的最高產(chǎn)量的2倍，經(jīng)t檢驗(yàn)分析具有極顯著差異（P＜0.01）。在前24 h間苯三酚呈線性累積，24 h之后生產(chǎn)效率逐漸下降。超表達(dá)marA及marA&ACCase明顯提高了間苯三酚的積累速度和積累峰值，尤其是marA&ACCase的超表達(dá)使前24 h的積累速度大幅提高，說(shuō)明marA可以有效提高細(xì)菌對(duì)間苯三酚的抵抗能力以及ACCase的表達(dá)使胞內(nèi)丙二酰輔酶A的供應(yīng)量有一定水平的增加。

圖6 marA及ACCase對(duì)間苯三酚積累速度的影響（每組3個(gè)重復(fù)）

2.4 葡萄糖、甘油和丙酮酸鈉不同碳源及Ca2+/Mg2+對(duì)間苯三酚產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基1、2和3分別為每升M9改良培養(yǎng)基中添加25 g葡萄糖、甘油或丙酮酸鈉。培養(yǎng)基1、2和3中分別加入2 mmol/L Mg2+和0.1 mmol/L Ca2+成為鈣鎂培養(yǎng)基。分別使用以上培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，HPLC檢測(cè)間苯三酚積累量，如圖7。使用葡萄糖碳源的工程菌產(chǎn)量達(dá)到490 mg/L，是使用甘油碳源產(chǎn)量（275 mg/L）的1.8倍，經(jīng)t檢驗(yàn)分析具有極顯著差異（P＜0.01）；是使用丙酮酸鈉碳源產(chǎn)量（205 mg/L）的2.4倍，經(jīng)t檢驗(yàn)分析具有極顯著差異（P＜0.01）。鈣鎂離子對(duì)間苯三酚的積累沒(méi)有影響。

圖7 葡萄糖、甘油和丙酮酸鈉不同碳源及Ca2+/Mg2+對(duì)間苯三酚產(chǎn)量的影響

3 討論

影響間苯三酚產(chǎn)量的主要原因在前言中已提及：間苯三酚的抑菌性及phlD直接底物的缺乏。在BL21（DE3）細(xì)胞中超表達(dá)marA基因和ACCase，部分解決了前言中提及的這兩個(gè)問(wèn)題，使間苯三酚的產(chǎn)量得到大幅提升，最高產(chǎn)量達(dá)到約2 120 mg/L，是同類研究中搖瓶發(fā)酵的最高產(chǎn)量。發(fā)酵后期間苯三酚濃度的降低與間苯三酚本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定有關(guān)［19］。進(jìn)一步降低發(fā)酵溫度，可提高間苯三酚的穩(wěn)定性，從而提高間苯三酚的積累峰值。但是溫度的降低也會(huì)提高生產(chǎn)成本，拉長(zhǎng)發(fā)酵周期，平衡考慮或不可取。

MarA的超表達(dá)雖然緩解了間苯三酚對(duì)工程菌的抑制作用，但是間苯三酚的積累卻進(jìn)一步降低了發(fā)酵液的pH值，形成了新的矛盾。我們通過(guò)使用改良TB培養(yǎng)基來(lái)緩解了pH的矛盾，使間苯三酚產(chǎn)量進(jìn)一步提升，且積累速度大幅提升。ACCase的超表達(dá)雖然提高了胞內(nèi)丙二酰輔酶A的濃度，使間苯三酚產(chǎn)量有了較大的提升，但是大量的蛋白超表達(dá)以及間苯三酚生物合成對(duì)胞內(nèi)碳資源的爭(zhēng)奪，抑制了工程菌的生長(zhǎng)，使工程菌的最終OD值降低，制約了間苯三酚的生物合成，降低了培養(yǎng)基的利用率，增加了成本。

細(xì)胞中乙酰輔酶A主要來(lái)源于丙酮酸氧化脫羧［20］，在培養(yǎng)基中添加丙酮酸鹽以期提高胞內(nèi)乙酰輔酶A的含量，進(jìn)而增加ACCsae酶的底物濃度，達(dá)到提高丙二酰輔酶A濃度的目的。但是，通過(guò)與葡萄糖、甘油對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)效果不理想。可能是因?yàn)榧?xì)胞膜上缺少相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而帶負(fù)電的丙酮酸根很難直接穿過(guò)細(xì)胞膜被細(xì)胞直接吸收。雖然葡萄糖要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的糖酵解途徑在胞內(nèi)才能生成丙酮酸，但是大腸埃希菌細(xì)胞膜上具有成熟的吸收葡萄糖的磷酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)［21］，有極高的吸收效率。所以最終還是葡萄糖對(duì)間苯三酚的積累更加有利。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)在BL21（DE3）菌株中異源表達(dá)來(lái)自熒光假單胞菌的phlD基因，成功構(gòu)建間苯三酚的胞內(nèi)生物合成途徑；同時(shí)超表達(dá)了來(lái)自E.coli DH5α菌株的marA和ACCase基因，提高了工程菌對(duì)間苯三酚的抵抗能力，提高了胞內(nèi)合成間苯三酚的直接底物丙二酰輔酶A的含量。

不同碳源及培養(yǎng)基中離子環(huán)境對(duì)間苯三酚產(chǎn)量的影響：葡萄糖為最佳發(fā)酵碳源，且鈣鎂離子對(duì)間苯三酚的產(chǎn)量沒(méi)有影響。本研究使間苯三酚的產(chǎn)量得到大幅的提升，達(dá)到2 120 mg/L的水平，為目前搖瓶發(fā)酵的最高產(chǎn)量。

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Genetic Engineering for Production of Phloroglucinol

CUI Xin1YAN Zhen-xin2SONG Wei-guo1，2LIN Wen-han2Peter PROKSCH1，2
（1. School of Chemical Engineering and Environmental，Weifang University of Science and Technology，Weifang 262700 ；2. Shouguang Fukang Pharmaceutical Co. Ltd.，R&D.，Weifang 262700）

This work is to further improve the efficiency of phloroglucinol biosynthesis，and to investigate the molecular mechanism of phloroglucinol biosynthesis and more efficient fermentation conditions and media components. We cloned the phlD gene from Pseudomonas fluorescens and reconstructed the intracellular synthesis pathway of phloroglucinol in the BL21（DE3）. At the same time the multi-drug resistant regulator（marA）and acetyl-coA carboxylase（ACCase）were also super-expressed in the BL21（DE3），and the effects of different carbon sources and medium ion environment on the phloroglucinol accumulation were analyzed. The results showed that intracellular synthesis pathway of phloroglucinol was successfully established，and the yield reached 450 mg/L. The marA gene increased the resistance of engineering strain to phloroglucinol and thus phloroglucinol yield increased to 1060 mg/L. The ACCase improved the content of the intracellular malonyl-CoA，and increased the phloroglucinol yield up to 2120 mg/L. Compared to glycerin and sodium pyruvate，glucose was the most suitable for the phloroglucinol biosynthesis，and the phloroglucinol yield with glucose was 1.8 times and 2.4 times of that with glycerol and pyruvate，respectively. Calcium and magnesium ions in medium had no impact on the phloroglucinol synthesis. Conclusively，the superexpression of the marA and ACCase genes can greatly increase the efficiency of phloroglucinol biosynthesis，and the medium using glucose as carbon source and without no calcium and magnesium is the optimal for phloroglucinol biosynthesis.

phloroglucinol；MarA；ACCase；PhlD

2017-06-30

海洋生物醫(yī)藥間苯三酚等制劑國(guó)際化發(fā)展能力建設(shè)項(xiàng)目［魯財(cái)建指2014（No.18）］

崔鑫，男，本科，研究方向：小分子化學(xué)藥物的生物合成；E-mail：731130528@qq.com

宋偉國(guó)，男，博士，研究員，研究方向：生物醫(yī)藥；E-mail：songwg@139.com

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0542

（責(zé)任編輯 李楠）