A-Raf-S214C突變體的構(gòu)建、表達(dá)及其對MAPK信號通路的影響

李安毅 楊洋 劉瑩 郭曉汐 郝倩 徐天瑞 安輸

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 云南省高校靶點(diǎn)藥物篩選與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500）

A-Raf-S214C突變體的構(gòu)建、表達(dá)及其對MAPK信號通路的影響

李安毅 楊洋 劉瑩 郭曉汐 郝倩 徐天瑞 安輸

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 云南省高校靶點(diǎn)藥物篩選與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500）

為了觀察A-Raf的突變體A-Raf-S214C對MAPK（mitogen-activated protein kinase，絲裂原活化蛋白激酶）信號通路的影響，并探討其誘發(fā)肺癌和朗格漢斯增生癥的可能分子機(jī)制。通過定點(diǎn)突變構(gòu)建pcDNA5-FRT-TO-A-Raf-S214C突變質(zhì)粒，并利用該質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)A-Raf-S214C突變體的HEK293細(xì)胞系，之后通過檢測下游ERK磷酸化程度，確定該突變體對MAPK信號通路的影響。結(jié)果顯示，通過實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)A-Raf-S214C突變體的細(xì)胞系，在不同濃度的多西環(huán)素誘導(dǎo)下，其表達(dá)量有所不同。與野生型相比，A-Raf-S214C突變體可明顯增強(qiáng)MAPK信號通路中下游信號分子ERK的磷酸化。結(jié)果表明A-Raf-S214C突變體是A-Raf激酶的激活突變體，可以導(dǎo)致MAPK信號通路下游信號分子ERK磷酸化明顯增強(qiáng)。

A-Raf激酶；MAPK信號通路；信號傳導(dǎo)

Raf激 酶（Rapidly accelerated fibrosarcoma） 是逆轉(zhuǎn)錄病毒致癌基因v-Raf的同源蛋白，它調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡等諸多生命過程，Raf-MEK-ERK通路是細(xì)胞信號傳導(dǎo)的一條主干通路，這條通路的調(diào)控失常是細(xì)胞癌變的主要原因之一［1-2］。

Raf激酶家族有3個(gè)成員A-Raf、B-Raf和C-Raf（Raf-1），它們均可被上游信號分子Ras激酶激活（Ras突變和異?；罨c20%的人類癌癥相關(guān)［3］），從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，并通過磷酸化靶蛋白MEK來進(jìn)一步激活ERK。但3個(gè)成員生物學(xué)功能卻各有所不同［4-5］。與 B-Raf和 C-Raf相比，A-Raf的激酶活性最低，僅為 C-Raf的 20%［6］。而且，A-Raf突變在癌癥中的發(fā)現(xiàn)相對較少，目前僅在肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 A-Raf-S214C 突變體［7］。

A-Raf-S214C突變體是A-Raf的第214位氨基酸絲氨酸突變?yōu)榘腚装彼?。通過基因組學(xué)篩查在肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)該突變體，并且它能轉(zhuǎn)化支氣管表皮細(xì)胞，使其發(fā)生癌變［7］。在朗格漢氏增生癥中也發(fā)現(xiàn)該突變［8］。A-Raf（S214C）突變體對MAPK的激活能力幾乎與 B-Raf（V600E）相同［8］。

本研究通過點(diǎn)突變法構(gòu)建了A-Raf-S214C位點(diǎn)突變真核表達(dá)質(zhì)粒，并在Flp-In T-Rex HEK293細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)，構(gòu)建該突變體的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，檢測其在Flp-In T-Rex HEK293細(xì)胞中的表達(dá)水平，以及其對MAPK信號通路的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒 A-Raf cDNA、Flp-In細(xì)胞、pcDNA5/FRET/TO載體由本實(shí)驗(yàn)室保存，感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自TaKaRa公司。引物合成和測序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.1.2 主要試劑盒與抗體 TOYOBO點(diǎn)突變試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司（該試劑盒含 有 KOD-Plus-、DpnI、T4 Polynucleotide Kinase、Ligation high等）；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自Tiangen公司；DMEM培養(yǎng)基、Blasticidin、Zeocin、Hygromycin、轉(zhuǎn)染試劑Lipo-fectamine2000均購自Invitrogen corporation；胎牛血清和Opti-MEM培養(yǎng)基購自北京Solarbio有限公司；Anti-VSV、Anti-GAPDH、Anti-ERK、Anti-p-ERK購 自 Santa Cruz Biotechnology；辣根過氧化物標(biāo)記鼠、羊、兔IgG抗體購自Kirkegaarg & laboratories公司。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf質(zhì)粒的構(gòu)建 首先根據(jù)載體特點(diǎn)及VSV標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)上下游引物（表1）。然后用PCR的方法將VSV標(biāo)簽序列及限制性酶切位點(diǎn)引入A-Raf的cDNA，并用BamH I和Xho I酶對pcDNA5/FRET/TO載體和含有VSV標(biāo)簽和酶切位點(diǎn)的A-Raf cDNA進(jìn)行雙酶切，利用連接酶將擴(kuò)增的VSV-A-Raf基因連接到pcDNA5/FRET/TO載體，從而得到pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf質(zhì)粒（以下簡稱A-Raf質(zhì)粒）。將質(zhì)粒送生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.2.2 設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物 以A-Raf質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物（表1），并送生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 引物列表

1.2.3 pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf-S214C突變體（以下簡稱A-Raf-S214C）的構(gòu)建與鑒定 用TOYOBO點(diǎn)突變試劑盒構(gòu)建突變體質(zhì)粒。第一步，以A-Raf質(zhì)粒為模板，用反向設(shè)計(jì)的兩條引物對質(zhì)粒進(jìn)行完整的PCR。第二步，用Dpn I對模板質(zhì)粒進(jìn)行消化，37℃反應(yīng)1 h。第三步，PCR產(chǎn)物自身環(huán)化：將Dpn I處理后PCR產(chǎn)物、滅菌蒸餾水、Ligation high、T4 Polynucleotide Kinase 以2∶7∶5∶1的體積比進(jìn)行混合，混合物在16℃條件下反應(yīng)1 h，實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的自身環(huán)化。第四步，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒：將自身環(huán)化后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)12 h后，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，篩選陽性克隆，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，用Xho I和BamH I酶進(jìn)行雙酶切，并測序驗(yàn)證定點(diǎn)突變是否成功。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Flp-In T-Rex HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素、3 μg/mL Blasticidin、100μg/mL 的Zeocin的DMEM維持培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2和80%濕度。待細(xì)胞生長至密度為70%-80%時(shí)（T25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)），將構(gòu)建成功的pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf-S214C質(zhì)粒（以下簡稱A-Raf-S214C質(zhì)粒）和pOG44質(zhì)粒按1∶9的比例共轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。具體步驟：將質(zhì)粒DNA（0.3 μg）與 pOG44（2.7 μg）混合物溶入 500 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基中，并將6 μL脂質(zhì)體Lipo-fectamine2000也溶入500 μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，將二者混合均勻，靜置15-20 min。在靜置期間，將T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸出，用1 mL 1×PBS洗滌3次，并加入2.5 mL Opti-MEM培養(yǎng)基，并放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。待靜置結(jié)束后，輕輕將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合物均勻混合，加入T25培養(yǎng)瓶中，混勻后放回37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后，將Opti-MEM培養(yǎng)基更換為正常維持培養(yǎng)基5 mL，繼續(xù)培養(yǎng)。第2天，將轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒的Flp-In T-Rex HEK293細(xì)胞傳代至T125培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。第3天，將T125培養(yǎng)瓶中的維持培養(yǎng)基更換成含200 μg/mL Hygromycin 的篩選培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。之后每3-5 d更換一次篩選培養(yǎng)基，直至有單克隆細(xì)胞出現(xiàn)。然后將單克隆細(xì)胞用胰酶消化，轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶，并更換為維持培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 免疫印記分析 將A-Raf 野生型和A-Raf-S214C穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系鋪6孔板，用濃度為0、1、5、10、100和1 000 ng/mL六個(gè)濃度梯度的Doxycycline（Dox）誘導(dǎo)VSV-A-Raf和VSV-A-Raf-S214C的表達(dá)，誘導(dǎo)24 h后裂解細(xì)胞，收集蛋白樣品，并進(jìn)行BCA定量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉、孵育一抗、1×TBST洗膜、孵育二抗、1×TBST洗膜、顯影，用凝膠成像系統(tǒng)軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。根據(jù)VSV的表達(dá)水平，可確定誘導(dǎo)劑的最佳濃度。再次將A-Raf野生型和A-Raf-S214C穩(wěn)定細(xì)胞系鋪6孔板，用之前檢測得到的Dox最佳誘導(dǎo)濃度分別誘導(dǎo)細(xì)胞0、12、18和24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行Western blot檢測，方法同前，可確定Dox最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.6 A-Raf-S214C突變體活性檢測 將A-Raf野生型和A-Raf-S214C突變體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系分別鋪6孔板，每種細(xì)胞分成3組。待細(xì)胞生長至密度為70%-80%時(shí)，用最佳Dox誘導(dǎo)濃度分別誘導(dǎo)A-Raf野生型和A-Raf-S214C突變體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞。誘導(dǎo)12 h后，第1組細(xì)胞不做任何處理，將第2組和第3組細(xì)胞更換為無血清培養(yǎng)基，并繼續(xù)用Dox誘導(dǎo)。再過12 h后，將第2組細(xì)胞用200 μL胎牛血清刺激5 min（加入血清后，培養(yǎng)基中血清終濃度為10%），其余兩組不作處理。然后進(jìn)行細(xì)胞收樣，用Western blot檢測ERK的磷酸化水平，Western blot方法同前。1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPASS21.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性差異水平定位P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf質(zhì)粒的鑒定

將構(gòu)建的A-Raf質(zhì)粒用瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果（圖1）顯示，pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf質(zhì)粒在相應(yīng)位置具有清晰的條帶，大小正確。質(zhì)粒測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中基因序列完全一致，說明構(gòu)建的A-Raf質(zhì)粒符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳測定pcDNA5-FRT-TO-A-Raf質(zhì)粒的大小

2.2 pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf-S214C突變體質(zhì)粒構(gòu)建

通過反向PCR法對A-Raf進(jìn)行點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn I酶切及產(chǎn)物自身環(huán)化后，將環(huán)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)染至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，其中12個(gè)代表性單克隆菌落的菌落PCR電泳結(jié)果如圖2-A所示。通過菌液PCR篩選陽性克隆，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，將其中前8個(gè)菌落的質(zhì)粒分別進(jìn)行Xho I和BamH I雙酶切鑒定它們是否含有相應(yīng)大小的插入片段，酶切的電泳結(jié)果如圖2-B所示。經(jīng)序列比對，發(fā)現(xiàn)A-Raf序列第641位堿基C突變?yōu)镚，即編碼214位氨基酸的絲氨酸（TCC）突變?yōu)榘腚装彼幔═GC），即可確定點(diǎn)突變成功。測序結(jié)果如圖3所示。

圖2 瓊脂糖凝膠驗(yàn)證A-Raf-S214C菌落PCR產(chǎn)物（A）及pcDNA5-FRT-TO-A-Raf-S214C質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證（B）

2.3 免疫印記檢測A-Raf-S214C突變體在Flp-In T-Rex HEK293細(xì)胞表達(dá)情況

用 濃 度 為 0、1、5、10、100和 1 000 ng/mL Doxycycline分別處理穩(wěn)定表達(dá)A-Raf及其突變體A-Raf-S214C的兩個(gè)細(xì)胞系，處理24 h后，用抗VSV標(biāo)簽蛋白抗體檢測A-Raf及其突變體A-Raf-S214C的表達(dá)情況，免疫印記結(jié)果（圖4-A）顯示，100 ng/mL Dox是A-Raf及其突變體A-Raf-S214C的最佳誘導(dǎo)濃度。用該最佳濃度，再次分別誘導(dǎo)兩個(gè)細(xì)胞系0、12、18和24 h，結(jié)果（圖4-B）顯示誘導(dǎo)24 h后，A-Raf和A-Raf-S214C的表達(dá)量可達(dá)最大。本實(shí)驗(yàn)說明，用100 ng/mL Dox處理細(xì)胞24 h是誘導(dǎo)A-Raf和A-Raf-S214C表達(dá)的最佳條件。

圖3 A-Raf-S214C突變體測序

2.4 A-Raf-S214C突變體對MAPK信號通路的影響

將A-Raf 野生型和A-Raf-S214C穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系分別分為正常培養(yǎng)誘導(dǎo)組、饑餓組和饑餓后加血清刺激組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，之后用Western blot檢測ERK的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)饑餓組中的A-Raf-S214C突變體細(xì)胞的ERK磷酸化水平明顯高于A-Raf野生型細(xì)胞（圖5-A）。重復(fù)3次該實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，饑餓處理組A-Raf野生型和A-Raf-S214C突變體的ERK磷酸化水平，差異顯著（**P＜0.01），結(jié)果如圖5-B所示。該結(jié)果初步證明A-Raf-S214C突變體是A-Raf的激活突變體，與A-Raf相比，A-Raf-S214C對MAPK信號通路下游信號分子ERK的磷酸化能力更強(qiáng)。

3 討論

Ras-Raf-MEK-ERK通路是細(xì)胞信號傳導(dǎo)的一條主干通路，它調(diào)控著細(xì)胞的生長、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡等諸多生命過程［9］。在這條通路中，Raf激酶作為關(guān)鍵組分之一發(fā)揮著重要作用［6］。

Raf激酶是逆轉(zhuǎn)錄病毒致癌基因v-Raf的同源蛋白，Raf激酶家族有3個(gè)成員A-Raf、B-Raf 和C-Raf（Raf-1），3個(gè)成員結(jié)構(gòu)相似（由調(diào)節(jié)區(qū)和激酶活性區(qū)兩部分組成），大小接近（A-Raf：606個(gè)氨基酸；B-Raf：806個(gè)氨基酸；C-Raf：648個(gè)氨基酸），都可以被Raf激酶的結(jié)合蛋白Ras激活，之后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，并通過磷酸化靶蛋白MEK進(jìn)一步激活ERK。但3個(gè)成員生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制卻各不相同［10］。其中對B-Raf和C-Raf的研究最為深入，它們是Ras-Raf-MEK-ERK信號通路上的主要致癌蛋白也是激活MEK的主要蛋白［10］。研究表明Ras-Raf-MEK-MAPK信號通路中的組分過表達(dá)或發(fā)生激活突變，與超過30%的人類腫瘤相關(guān)［11］。其中Raf激酶的突變是導(dǎo)致細(xì)胞癌變的主要原因之一，如B-Raf突變與57%的神經(jīng)系統(tǒng)癌變、39%的皮膚癌和38%胸腺癌相關(guān)［12］；C-Raf突變與超過90%的小細(xì)胞肺癌相關(guān)［13］。因此，調(diào)控Raf激酶也就成為了治療癌癥的最主要手段之一［13-14］。

圖4 不同多西環(huán)素濃度（A）；及在100 ng/mL多西環(huán)素誘導(dǎo)的條件下，不同誘導(dǎo)時(shí)間（B）對VSV-A-Raf野生型和VSV-A-Raf-S214C突變體表達(dá)的影響

圖5 免疫印跡檢測VSV-A-Raf野生型細(xì)胞和VSV-A-Raf-S214C突變體細(xì)胞的ERK磷酸化水平

與B-Raf和C-Raf相比，A-Raf具有較低的激酶活性，其最大活性僅為C-Raf的20%［15］，而且當(dāng)前在腫瘤中發(fā)現(xiàn)A-Raf發(fā)生基因突變的報(bào)道較少。因此，人們對A-Raf激酶的關(guān)注較少，作為Raf激酶家族中重要一員，對其生物學(xué)功能仍不是非常清楚。這同時(shí)也給我們一種啟示，為什么在進(jìn)化過程中會(huì)形成一個(gè)較差的MEK激酶A-Raf，而與之同源的B-Raf和C-Raf會(huì)具有非常強(qiáng)的激酶活性？因此，這些問題驅(qū)使我們對A-Raf及其激活突變體進(jìn)行研究。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型A-Raf相比，其突變體A-Raf-S214C可明顯增強(qiáng)下游信號分子ERK的磷酸化程度，該突變體是A-Raf激酶的構(gòu)建性激活突變體，可引起MAPK信號通路下游信號分子ERK異?；罨?。而異?；罨腅RK可通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)合成、代謝、細(xì)胞存活［16］、細(xì)胞遷移和入侵等使正常細(xì)胞獲得許多腫瘤細(xì)胞的特征［17］。也有報(bào)道稱，A-Raf激酶在細(xì)胞凋亡［18］、腫瘤形成［19］、拮抗 Raf激酶抑制劑［20］等過程中扮演重要角色。因此，進(jìn)一步了解A-Raf-S214C突變體的具體激活機(jī)制有助于幫助我們了解A-Raf的致癌機(jī)制，為人們尋找治療癌癥的方法提供了新的思路。

4 結(jié)論

利用點(diǎn)突變的方法，成功構(gòu)建了A-Raf-S214C突變體質(zhì)粒。并且成功構(gòu)建了在Flp-In T-Rex HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的A-Raf野生型和A-Raf-S214C突變體細(xì)胞系。在不同濃度的多西環(huán)素誘導(dǎo)下，A-Raf野生型細(xì)胞與A-Raf-S214C突變體細(xì)胞的表達(dá)量有所不同，二者均在100 ng/mL的多西環(huán)素誘導(dǎo)24 h的條件下，表達(dá)水平達(dá)最大值。與野生型相比，A-Raf-S214C突變體可明顯增強(qiáng)MAPK信號通路中下游信號分子ERK的磷酸化水平，即A-Raf-S214C突變體是A-Raf激酶的激活突變體。

［1］Kolch W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6（11）：827-837.

［2］Matallanas D, Birtwistle M, Romano D, et al. Raf family kinases：old dogs have learned new tricks［J］. Genes Cancer, 2011, 2（3）：232-260.

［3］Montagut C, Settleman J. Targeting the Raf-MEK-ERK pathway in cancer therapy［J］. Cancer Lett, 2009, 283（2）：125-134.

［4］Leicht DT, Balan V, Kaplun A, et al. Raf kinases：function,regulation and role in human cancer［J］. Biochim Biophys Acta,2007, 1773（8）：1196-1212.

［5］Osborne JK, Zaganjor E, Cobb MH. Signal control through Raf：in sickness and in health［J］. Cell Res, 2012, 22（1）：14-22.

［6］An S, Yang Y, Ward R, et al. A-Raf：A new star of the family of raf kinases［J］. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2015, 50（6）:520-530.

［7］Imielinski M, Gredulich H, Kaplan B. Oncogenic and sorafenibsensitive A-Raf mutations in lung adenocarcinoma［J］. J Clin Invest, 2014, 124（4）：1582-1586.

［8］Nelson DS, Quispel W, Badalian-Very G, et al. Somatic activating A-Raf mutations in Langerhans cell histiocytosis［J］. Blood, 2014,123（20）：3152-3155.

［9］Olson JM, Hallahan AR. P38MAPK kinase：a convergence pointin cancer therapy［J］. Trends Mol Med, 2004, 10（3）：125-129.

［10］Osbome JK, Zaganjor E, Cobb HM. Signal control through Raf：in sickness and in health［J］. Cell Res, 2012, 22（1）：14-22.

［11］Fernandez-Medarde A, Santos E. Ras in cancer and developmental diseases［J］. Genes Cancer, 2011, 2（3）：344-358.

［12］Santarpia L, Lippman SM, El-Naggar AK. Targeting the MAPKRAS-RAF signaling pathway in cancer therapy［J］. Expert Opin Ther Targets, 2012, 16（1）：103-119.

［13］Beeram M, Patnaik A, Rowinsky EK. Raf：a strategic target for therapeutic development against cancer［J］. J Clin Oncol, 2005,23（27）：6771-6779.

［14］Kim DH, Sim T. Novel small molecule Raf kinase inhibitors for targeted cancer therapeutics［J］. Arch Pharm Res, 2012, 35（4）：605-615.

［15］Martin-Liberal J, Larkin J. New RAF kinase inhibitors in cancer therapy［J］. Expert Opin Pharmacother, 2014, 15（9）：1235-1245.

［16］鄒平, 何濤, 陳顥, 等. 細(xì)胞衰老過程中JNK、p38和Akt的活性變化［J］. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2006, 22（7）：571-574.

［17］Scheid MP, Schubert KM, Duronio V. Regulation of bad phosphorylation and association with Bcl-x（L）by the MAPK/ERK kinase［J］. J Biol Chem, 1999, 274（43）：31108-31113.

［18］Rauch J, Moran-Jones K, Albrecht V, et al. c-Myc regulates RNA splicing of the A-Raf kinase and its activation of the ERK pathway［J］. Cancer Res, 2011, 71（13）：4664-4674.

［19］Imielinski M, Greulich H, Kaplan B, et al. Oncogenic and sorafenib-sensitive ARAF mutations in lung adenocarcinoma［J］.J Clin Invest, 2014, 124（4）：1582-1586.

［20］Mooz J, Oberoi-Khanuja TK, Harms GS, et al. Dimerization of the kinase ARAF promotes MAPK pathway activation and cell migration［J］. Sci Signal, 2014, 7（337）：ra73.

Construction and Expression of Mutant A-Raf-S214C and Studies on Its Role in MAPK Signaling Pathway

LI An-yi YANG Yang LIU Ying GUO Xiao-xi HAO Qian XU Tian-rui AN Shu
（University Based Provincial Key Laboratory of Screening and Utilization of Targeted Drugs，F(xiàn)aculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500）

This study is to observe the influence of A-Raf mutant A-Raf-S214C on MAPK（mitogen-activated protein kinase）signal pathway and to explore the molecular mechanism of lung cancer and Langerhans cell histiocytosis caused by A-Raf-S214C. The pcDNA5-FRT-TO-A-Raf-S214C plasmid was constructed through point mutation，and then it was used to establish HEK293 cell lines stably expressing A-Raf-S214C. Further，the influence of A-Raf-S214C on MAPK signaling pathway was determined by detecting the level of ERK phosphorylation. Results showed that HEK293 cell line with stable expression of A-Raf-S214C was successfully constructed，and A-Raf-S214C expression levels increased under induction with increasing concentrations of doxycycline. In comparison with wild type A-Raf，mutant A-Raf-S214C significantly enhanced the phosphorylation level of ERK . Conclusively，A-Raf-S214C mutant is an activating mutant of A-Raf kinase，resulting in significantly increased phosphorylation level of ERK，a downstream signaling molecule in MAPK pathway.

A-Raf kinase；MAPK signaling pathway；signal transduction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0445

2017-05-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81460253，U1302225），云南省人才培養(yǎng)項(xiàng)目（KK23201426014）

李安毅，女，碩士研究生，研究方向：細(xì)胞信號傳導(dǎo)；E-mail：82291898@qq.com

安輸，男，博士，副教授，研究方向：細(xì)胞信號傳導(dǎo)；E-mail：aslxj@mail.ustc.edu.cn徐天瑞，男，博士，教授，研究方向：細(xì)胞信號傳導(dǎo)；E-mail：xtrgfq@hotmail.com

（責(zé)任編輯 李楠）