片球菌素pedA基因的原核表達(dá)、純化及生物信息學(xué)分析

黃宇良 汪立平， 陸克文 邵會(huì)娟 王正全

（1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3. 上海邦成生物工程有限公司，上海 201506）

片球菌素pedA基因的原核表達(dá)、純化及生物信息學(xué)分析

黃宇良1汪立平1，2陸克文3邵會(huì)娟3王正全2

（1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3. 上海邦成生物工程有限公司，上海 201506）

旨在構(gòu)建片球菌素PA-1結(jié)構(gòu)基因pedA的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌體系中實(shí)現(xiàn)PA-1的外源表達(dá)，運(yùn)用生物信息學(xué)手段分析重組蛋白的理化性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)。以戊糖片球菌C-2-1的DNA為模板，擴(kuò)增pedA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pET28a（+）原核表達(dá)載體，構(gòu)建pET28a-pedA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中；30℃，以1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)5 h；采用Ni-NTA樹脂親和層析純化重組蛋白，檢測(cè)純化后重組蛋白的抑菌活性；利用生物信息學(xué)手段探究重組蛋白的理化性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)信息。結(jié)果顯示，pET28a-pedA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，帶有His標(biāo)簽的PA-1重組片球菌素在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，利用Ni-NTA親和層析獲得純化的重組蛋白，Tricine-SDS-PAGE電泳分析表明純化后的重組蛋白分子量約為7.8 kD，與理論值相符。瓊脂擴(kuò)散法抑菌活性實(shí)驗(yàn)抑菌圈效果明顯，表明純化的重組片球菌素具有抑菌活性。生物信息學(xué)方法對(duì)比分析其蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，獲得的重組蛋白含有信號(hào)肽，α螺旋占23.53%，疏水性提高，可能促進(jìn)了重組蛋白的可溶性表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了片球菌素PA-1的原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，該表達(dá)可能與其含有信號(hào)肽及信號(hào)肽疏水性有關(guān)，純化后的重組蛋白抑菌活性明顯。

pedA基因；片球菌素PA-1；原核表達(dá)；抑菌活性；生物信息學(xué)

近年來(lái)食品安全事件頻發(fā)，其中由微生物引起的食品腐敗和食源性疾病占很大一部分比例，化學(xué)防腐劑的添加可有效抑制食品中的腐敗微生物，但防腐劑的濫用又造成了新的食品安全問(wèn)題，因此尋找安全無(wú)毒副作用的天然食品防腐劑顯得尤為重要。乳酸菌細(xì)菌素是由乳酸菌通過(guò)核糖體合成機(jī)制，在代謝過(guò)程產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的前體多肽或多肽，通常乳酸菌對(duì)其自身所產(chǎn)細(xì)菌素具有免疫性［1-2］。因細(xì)菌素對(duì)人體無(wú)危害，可被胃腸道內(nèi)蛋白酶降解消化，具有作為食品生物防腐劑的潛在應(yīng)用價(jià)值［3-4］。乳酸菌細(xì)菌素可分為4大類：第一類被稱為羊毛硫細(xì)菌素，是一類小分子的修飾肽；第二類是小分子熱穩(wěn)定肽，其代表為乳酸鏈球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素Nisin，已在包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家獲得許可并在食品工業(yè)中推廣應(yīng)用［5］；第三類是被稱為溶菌素的大分子熱不穩(wěn)定蛋白；第四類是復(fù)合型的大分子復(fù)合物。其中第二類細(xì)菌素又可分為3個(gè)亞類，其中的IIa類是類片球菌細(xì)菌素，主要由戊糖片球菌、乳酸片球菌、小片球菌產(chǎn)生。這類細(xì)菌素相比于Nisin 在pH6.0 時(shí)就有90% 以上的活性喪失的特點(diǎn)，其性質(zhì)更穩(wěn)定［6］，抑菌譜較廣，對(duì)單增李斯特菌的抑制作用尤為明顯［7-8］，在食品防腐保鮮領(lǐng)域中具有更廣泛的應(yīng)用前景。

類片球菌素中的片球菌素PA-1是目前繼Nisin之后第二個(gè)被用于商業(yè)開(kāi)發(fā)的細(xì)菌素［9］，其相關(guān)基因是大小為9.4 kb的質(zhì)粒pSRQ11，由4個(gè)基因簇構(gòu)成一個(gè)操縱子，分別為pedA，pedB，pedC，pedD基因，pedA基因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)基因，編碼62個(gè)氨基酸的PA-1前體，其成熟且有活性的片球菌素是由第19-62個(gè)氨基酸組成的44個(gè)氨基酸殘基和2個(gè)二硫鍵組成。其余3個(gè)基因分別為免疫基因、分泌基因、加工基因，它們不涉及片球菌素的產(chǎn)生［10］。天然菌株片球菌素的表達(dá)量低，不易純化，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，化學(xué)合成法雖然能夠生產(chǎn)足夠量的細(xì)菌素，但成本高、活性不穩(wěn)定［11］。采用基因工程技術(shù)將片球菌素基因克隆到細(xì)菌等宿主內(nèi)進(jìn)行異源高效表達(dá)是近年來(lái)細(xì)菌素領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。如Moon等［12］在E.coli內(nèi)成功表達(dá)了無(wú)活性的His-tag-倉(cāng)鼠二氫葉酸還原酶-乳酸片球菌素PA-1，純化后的融合蛋白經(jīng)酶切后恢復(fù)抑菌活性；劉珊娜［11］和陳信全等［13］分別在E. coli BL21（DE3）和E. coli Rosetta（DE3）內(nèi)實(shí)現(xiàn)了片球菌素PA-1的異源融合表達(dá)；韓燁等［14］也成功實(shí)現(xiàn)了乳酸片球菌素pedA基因在E.coli體內(nèi)的表達(dá)。以真菌為宿主異源表達(dá)細(xì)菌素近來(lái)也有報(bào)道，van Reenen等［15］利用釀酒酵母表達(dá) Plantaricin 423，其工程菌表現(xiàn)出了抑菌活性；Beaulieu等［16］在畢赤酵母中也實(shí)現(xiàn)了無(wú)生物活性的片球菌素的高效表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)室前期從內(nèi)蒙古干酪中篩選出一株戊糖片球菌C-2-1菌株，經(jīng)證實(shí)該菌株能產(chǎn)生片球菌素［6］。本研究以此戊糖片球菌C-2-1菌株的總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增片球菌素PA-1成熟肽的結(jié)構(gòu)基因pedA，構(gòu)建pET28a-pedA重組質(zhì)粒，在E.coli細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組片球菌素PA-1，利用李斯特氏菌抑菌活性檢驗(yàn)純化后獲得的重組片球菌素PA-1，運(yùn)用生物信息學(xué)工具分析了重組蛋白的理化特性和結(jié)構(gòu)信息，以期為片球菌素PA-1的體外高效表達(dá)和后期在食品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 戊糖片球菌C-2-1（Pediococcus pentosaceus C-2-1）由本實(shí)驗(yàn)室自行分離獲得，表達(dá)載體 pET-28a（+）、大腸桿菌 Top10、BL21（DE3）、指示菌單增李斯特菌（L. monocytogenes ATCC19114）均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、Ni-NTA Agarose、卡那霉素、Tris、異丙基 -β-D-硫代半乳糖甘（IPTG）、X-Gal、瓊脂糖、溶菌酶等均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；DNA marker、蛋白marker購(gòu)自中科瑞泰生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自O(shè)XOID公司，氯化鈉、甘油、吐溫-80等購(gòu)自國(guó)藥。LB液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10.0、酵母粉 5.0、氯化鈉 10.0，121℃滅菌15 min，用于大腸桿菌的培養(yǎng)；MRS培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20.0，蛋白胨 10.0，酵母粉 10.0，牛肉膏 5.0，磷酸氫二鉀2.0，檸檬酸銨 2.0，無(wú)水乙酸鈉 5.0，七水硫酸鎂 0.58，水合硫酸錳 0.25，吐溫-80 1.0，pH 6.2-6.6，121℃滅菌15 min，用于戊糖片球菌C-2-1的培養(yǎng)；TSBYE液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 17.0，大豆蛋白胨3.0，酵母粉 6.0，氯化鈉 5.0，磷酸氫二鉀 2.5，葡萄糖 2.5，調(diào)pH 7.3±0.1，121℃滅菌15 min。TSBYE固體培養(yǎng)基（g/L）：配方同上，加入瓊脂粉1.0%。用于指示菌單增李斯特菌的培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中上傳的可產(chǎn)片球菌素細(xì)菌的基因進(jìn)行對(duì)比，找到編碼片球菌素PA-1的pedA結(jié)構(gòu)基因的全序列（GenBank登錄號(hào)：AY083244.3），設(shè)計(jì)正向引物pedA-F：5'-CATGCCATGGAAAAAATTGAAAAATTAACTGAA AAAGAA-3'（劃線部分為Nco I酶切位點(diǎn)，前面為保護(hù)堿基和啟動(dòng)子）。反向引物pedA-R：5'-CCCAA GCTTCTAGTGATGATGGTGATGATGGCATTTATGA TTACCTTGATGTCCA-3'（劃線部分為Hind III酶切位點(diǎn)，前面為保護(hù)堿基，后面加有His標(biāo)簽），由生工生物工程（上海）有限公司合成。以戊糖片球菌C-2-1總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 S，55℃退火30 S，72℃延伸45 S，循環(huán)30 次；72℃后延伸10 min。PCR 產(chǎn)物以1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，切下凝膠上目的條帶后，用DNA 回收試劑盒回收純化。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-pedA的構(gòu)建 將回收的PCR 產(chǎn)物和pET-28a（+）質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Nco I和Hind III雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，利用T4 DNA 連接酶將雙酶切后的pedA 基因和pET-28a（+）質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素抗性的LB 平板中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑出單克隆接種LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒用Nco I和Hind III雙酶切鑒定，鑒定正確后送至上海生工公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2.3 重組球菌素PA-1的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a-pedA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取單菌落于含卡那霉素（終濃度50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600nm=0.6），加入終濃度1 mmol/L IPTG，30℃振蕩培養(yǎng)5 h，4℃離心收集細(xì)胞并洗滌后，加入細(xì)胞裂解液（終濃度為50 mg/mL）和溶菌酶（終濃度為1 mg/mL）。冰浴超聲裂解細(xì)胞，高速離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳分析，檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)形式，收集上清和沉淀保存?zhèn)溆谩?.2.4 重組球菌素PA-1蛋白的純化 取1 000 μL的Ni-NTA His-Bind樹脂混合液加入空純化柱中，用蒸餾水重懸珠子，待水從純化柱下方流出后，用 Binding buffer（NaH2PO450 mmol/L，NaCl 500 mmol/L，咪唑10 mmol/L，最終調(diào)pH 為8.0）重懸，重復(fù)2 次，備用；將離心得到的細(xì)胞破碎上清加入含有瓊脂糖珠子的純化柱中，4℃在旋轉(zhuǎn)儀上與珠子孵育2 h后，將上清從純化柱下方流出；用Wash buffer（NaH2PO450mmol/L，NaCl 500 mmol/L，咪唑20 mmol/L，最終調(diào)pH 為8.0）洗滌樹脂，重復(fù)3 次；漂洗完畢后用Elution buffer（NaH2PO450 mmol/L，NaCl 500 mmol/L，咪唑 250 mmol/L，最終調(diào) pH 為 8.0）洗脫蛋白，每200 μL 洗脫1 次，重復(fù)2 次，分別取5 μL洗脫液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE膠分析。

1.2.5 戊糖片球菌素PA-1的活性檢測(cè) 以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)表達(dá)片球菌素的活性。取50 μL第二次洗脫液樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，注入接種有新鮮過(guò)夜單核細(xì)胞增生李斯特菌菌液（37℃條件下培養(yǎng)16 h）的TSB固體平板上的瓊脂孔（約3 mm）中，對(duì)照組瓊脂孔加入洗脫重組蛋白時(shí)使用的相同洗脫液。在超凈工作臺(tái)上靜止1 h后，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，觀察抑菌圈。

1.2.6 片球菌素PA-1的生物信息學(xué)分析 氨基酸序列利用NCBI網(wǎng)站提供的BLAST工具進(jìn)行預(yù)測(cè)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/），BioEdit工具進(jìn)行氨基酸序列對(duì)比，用ProtParam蛋白在線分析工具和https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_seccons.html網(wǎng)站二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具等對(duì)兩種蛋白的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)組成等生物信息學(xué)信息進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 pedA基因的擴(kuò)增

以戊糖片球菌C-2-1菌株的總DNA為模板，pedA-F和pedA-R為正反向引物，進(jìn)行pedA基因PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖1所示，在220 bp 左右有明顯條帶，與預(yù)期片段大小相符，目的基因擴(kuò)增成功。

圖 1 pedA基因的PCR擴(kuò)增

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-pedA的構(gòu)建與鑒定

將雙酶切后的pedA 基因和pET-28a（+）質(zhì)粒進(jìn)行T4 連接酶連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。如圖2 所示，將重組質(zhì)粒pET28a-pedA用Nco I和Hind III雙酶切后，獲得一條220 bp 左右的條帶，此條帶大小與預(yù)期值相符。將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明連入pET28a質(zhì)粒中的pedA 基因與GenBank中的pedA 基因堿基序列（GenBank登錄號(hào)：AY083244.3）完全一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒pET28a-pedA 構(gòu)建成功。

圖2 陽(yáng)性重組子雙酶切鑒定

2.3 重組球菌素PA-1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET28a-pedA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，加入IPTG后降低培養(yǎng)溫度誘導(dǎo)表達(dá)，震蕩培養(yǎng)5 h后，4℃離心收集細(xì)胞并洗滌，加入裂解液和溶菌酶。冰浴超聲裂解細(xì)胞，離心后取上清和沉淀進(jìn)行電泳分析，檢測(cè)重組蛋白表達(dá)形式，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，誘導(dǎo)后的上清和沉淀中在7.8 kD附近有一條明顯的條帶，與理論值相符。而未轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET28a-pedA的大腸桿菌BL21（DE3）野生菌株在7.8 kD附近無(wú)明顯條帶。表明重組球菌素PA-1蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)成功，且以可溶性蛋白形式存在。

2.4 重組片球菌素PA-1蛋白的純化

將收集的超聲裂解上清液與Ni-NTA 瓊脂糖鎳柱孵育，帶有His 標(biāo)簽的重組球菌素PA-1蛋白會(huì)與鎳柱特異性結(jié)合，經(jīng)過(guò)3次漂洗和2次洗脫后，成功獲得純化的重組球菌素PA-1蛋白（圖4）。收集對(duì)應(yīng)洗脫液保存，進(jìn)行活性檢測(cè)。

2.5 片球菌素PA-1的活性檢測(cè)

以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為指示菌，利用瓊脂擴(kuò)散法鑒定表達(dá)重組片球菌素PA-1的活性。結(jié)果如圖5所示，純化后的重組片球菌素PA-1抑菌圈明顯，而僅含洗脫液的空白對(duì)照沒(méi)有抑菌圈，證明戊糖片球菌素pedA結(jié)構(gòu)基因在大腸桿菌體內(nèi)成功表達(dá)出了有活性的PA-1細(xì)菌素。

圖3 重組片球菌素PA-1蛋白的Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)

圖4 重組片球菌素PA-1蛋白的純化

2.6 片球菌素PA-1的生物信息學(xué)分析

鑒于本實(shí)驗(yàn)得到的重組蛋白為胞內(nèi)可溶性表達(dá)，而已報(bào)道的僅表達(dá)成熟且有活性的由44個(gè)氨基酸組成（GenBank登錄號(hào)為BAE79270）的PA-1細(xì)菌素前體蛋白，大部分為包涵體不可溶表達(dá)。運(yùn)用生物信息學(xué)工具分析預(yù)測(cè)本實(shí)驗(yàn)得到的重組片球菌素PA-1氨基酸序列和 BAE79270 PA-1細(xì)菌素兩種蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征等內(nèi)容，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)重組蛋白在大腸桿菌體內(nèi)可溶性表達(dá)的可能原因。

2.6.1 片球菌素PA-1的理化性質(zhì)分析 本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)的重組片球菌素PA-1氨基酸序列為：MKKI EKLTEKEMANIIGGKYYGNGVTCGKHSCSVDWGKAT TCIINNGAMAWATGGHQGNHKCHHHHHH，由68個(gè)氨基酸（其中含劃線部分6個(gè)組氨酸組成的His標(biāo)簽）組成。登錄號(hào)為BAE79270的PA-1細(xì)菌素由44個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列為：KYYGNGVTC GKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC。BioEdit分析發(fā)現(xiàn)兩者之差別在于本研究多了氨基酸序列MKKIEKLTEKEMANIIGG，其他序列相同。

圖5 重組片球菌素的抑菌活性驗(yàn)證

用ProtParam蛋白在線分析工具分析BAE79270的PA-1細(xì)菌素氨基酸序列，結(jié)果表明，其分子式為C196H297N61O60S5，分子量為4 628.19，理論pI（等電點(diǎn)）值為8.85，同時(shí)含有1個(gè)負(fù)電荷氨基酸（Asp +Glu）和4個(gè)正電荷氨基酸（Arg + Lys），脂肪系數(shù)為40.00，總平均親水值（GRAVY）為-0.716，不穩(wěn)定性系數(shù)為-0.48。用相同方法分析本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)的重組片球菌素PA-1氨基酸序列，結(jié)果表明，其分子式為C319H489N101O94S7，分子量為7 467.43，理論pI值為8.42，含有5個(gè)負(fù)電荷氨基酸（Asp + Glu）和7個(gè)正電荷氨基酸（Arg + Lys），脂肪系數(shù)為50.29，總平均親水值為-0.716，不穩(wěn)定性系數(shù)為23.65，屬于穩(wěn)定型細(xì)菌素。兩種蛋白的氨基酸組成見(jiàn)表1。

2.6.2 片球菌素PA-1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具對(duì)片球菌素PA-1進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。各參數(shù)設(shè)置為：視窗寬度為17，相似度閾值為8，狀態(tài)數(shù)目為4。經(jīng)分析：登錄號(hào)為BAE79270的PA-1細(xì)菌素的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6）中，無(wú)α螺旋結(jié)構(gòu)；延伸鏈占40.91%，有18個(gè)氨基酸殘基參與；β轉(zhuǎn)角占13.64%，有6個(gè)氨基酸殘基參與；無(wú)規(guī)則卷曲占45.45%，共有20個(gè)氨基酸殘基參與。

本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)的重組片球菌素PA-1的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖7）中，α螺旋占23.53%，有16個(gè)氨基酸殘基參與；延伸鏈占20.97%，有13個(gè)氨基酸殘基參與；β轉(zhuǎn)角占12.90%，有8個(gè)氨基酸殘基參與，無(wú)規(guī)則卷曲占40.32%，共有25個(gè)氨基酸殘基參與。

對(duì)比預(yù)測(cè)結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)重組片球菌素PA-1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有23.53%的α螺旋結(jié)構(gòu)，而由44個(gè)氨基酸組成的成熟且有活性的PA-1細(xì)菌素的二級(jí)結(jié)構(gòu)中不含有α螺旋結(jié)構(gòu)。

表1 兩種不同片球菌素PA-1的氨基酸組成

圖6 BAE79270片球菌素PA-1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖7 本實(shí)驗(yàn)片球菌素PA-1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

采用基因工程技術(shù)來(lái)提高片球菌素的效價(jià)是可行的，但還存在一定問(wèn)題。已報(bào)道的片球菌素PA-1在大腸桿菌中的表達(dá)形式多為細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)，產(chǎn)物通常存在于包涵體中，包涵體溶解、變性、復(fù)性等過(guò)程復(fù)雜，導(dǎo)致表達(dá)效率降低［17］。劉珊娜等［11］在E. coli BL21（DE3）內(nèi)實(shí)現(xiàn)了Trx-PA-1的融合表達(dá)，重組片球菌素以包涵體的形式存在，限制了PA-1進(jìn)一步應(yīng)用。此外，引入分子伴侶或運(yùn)用融合表達(dá)的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)PA-1的可溶性表達(dá)，也是學(xué)者常用的一種細(xì)菌素異源表達(dá)的方法，但獲得的重組蛋白要經(jīng)過(guò)腸激酶酶切去除標(biāo)簽蛋白后才能恢復(fù)活性。陳信全等［13］利用GST系統(tǒng)，通過(guò)在GST和PA-1蛋白間引入His標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)了融合蛋白的可溶性表達(dá)，重組PA-1經(jīng)過(guò)腸激酶去除標(biāo)簽蛋白后活性才得以恢復(fù)，制約了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。本研究構(gòu)建了pET28a-pedA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、Ni-NTA柱純化、Tricine-SDS-PAGE電泳分析后［18］，獲得了分子量在7.8 kD左右的可溶性重組蛋白，與ProtParam蛋白分析工具的分子量預(yù)測(cè)值相符。經(jīng)單增李斯特菌抑菌檢測(cè)顯示，重組片球菌素具有明顯的抑菌活性。本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)的可溶性重組片球菌素PA-1，未加入融合蛋白或分子伴侶，使重組片球菌素的提取和純化更加簡(jiǎn)便，為片球菌素PA-1在食品防腐保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了很好的基礎(chǔ)。

Marugg等［10］證實(shí)pedA基因編碼PA-1片球菌素62個(gè)氨基酸的PA-1前體，第19-62個(gè)氨基酸為具有活性的片球菌素前體，前18個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，與劉珊娜［11］包涵體表達(dá)的片球菌素PA-1相比，本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)的重組片球菌素PA-1含有此信號(hào)肽序列。研究表明分泌蛋白的N端都攜帶有引導(dǎo)其跨越細(xì)胞膜的信號(hào)肽，它對(duì)于分泌蛋白的分泌效率起主導(dǎo)作用［19］，利用信號(hào)肽來(lái)引導(dǎo)外源蛋白定位分泌到細(xì)胞特定區(qū)間，提高可溶性，可避免因包涵體復(fù)性帶來(lái)的困難［20］。因此，本實(shí)驗(yàn)獲得的重組片球菌素PA-1含信號(hào)肽可能是導(dǎo)致其可溶性表達(dá)的原因。進(jìn)一步比較兩種PA-1的理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)，未含信號(hào)肽的BAE79270的PA-1細(xì)菌素沒(méi)有α螺旋結(jié)構(gòu)，含有信號(hào)肽的片球菌素PA-1的α螺旋結(jié)構(gòu)占23.53%，重組蛋白疏水性提高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，信號(hào)肽分泌加工能力隨疏水性增加而提高，前體蛋白可以不依賴分子伴侶或其他輔助因子仍能較好的分泌［21］。楊運(yùn)桂等［22］證實(shí)信號(hào)肽疏水性能提高促進(jìn)青霉素G ?；阜置?。因此，本實(shí)驗(yàn)獲得的重組PA-1蛋白含有的疏水核心信號(hào)肽可能促進(jìn)了重組蛋白的分泌，從而獲得了較穩(wěn)定的重組蛋白，使提取和純化更為簡(jiǎn)單。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了片球菌素PA-1結(jié)構(gòu)基因pedA的原核表達(dá)載體，純化得到了可溶性表達(dá)并具有抑菌活性的重組片球菌素PA-1。運(yùn)用生物信息學(xué)手段，進(jìn)一步分析了重組片球菌素PA-1可溶性表達(dá)的原因可能為含有信號(hào)肽的PA-1的重組蛋白疏水性提高，促進(jìn)了重組蛋白的分泌。

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Prokaryotic Expression，Purification and Bioinformatics Analysis of Pediocin pedA Gene

HUANG Yu-liang1WANG Li-ping1，2LU Ke-wen3SHAO Hui-juan3WANG Zheng-quan2
（1. College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Engineering Research Center of Food Thermal-processing Technology，Shanghai 201306 ；2. College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation，Shanghai 201306 ；3. Shanghai Bangcheng Biotechnology Co. Ltd.，Shanghai 201506）

The aim of this study is to construct a prokaryotic expression vector for pedA gene of pediocin PA-1 to realize the exogenous expression of PA-1，and to analyze the physicochemical properties and molecular structure of recombinant protein by bioinformatics. The pedA gene was amplified by DNA of Pediococcus pentosaceus C-2-1 as template，and the PCR product was cloned into prokaryotic expression vector pET28a（+）. The recombinant plasmid pET28a-pedA was thus constructed and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）competent cells. Next，the transformant was induced to express protein by IPTG（1 mmol/L）at 30℃ for 5 h. Then，the recombinant protein was purified by Ni-NTA resin affinity chromatography，and the antibacterial activity of the recombinant protein was detected. Finally，the physicochemical properties and molecular structure of recombinant protein was explored by bioinformatics method. The results showed that the recombinant plasmid pET28a-pedA was successfully constructed，and recombinant pediocin of PA-1 with His-tag was expressed in E. coli. The molecular size of the purified recombinant protein by Ni-NTA affinity chromatography was determined to be about 7.8 kD via Tricine-SDS-PAGE，whichwas consistent with the theoretical value. Agar diffusion method demonstrated that antibacterial colony was remarkable，indicating that the purified recombinant pediocin had antibacterial activity. Comparative analysis of the protein structure and characteristics by bioinformatics method showed that the recombinant protein contained the signal peptide and consisted of 23.53% alpha helix，meaning that its hydrophobicity increased，thus which might enhance the soluble expression of the recombinant protein. Conclusively，in this experiment，the prokaryotic expression vector of pediocin PA-1 was successfully constructed，and the recombinant protein was at soluble expression in E. coli. The soluble expression may be related to signal peptide and the hydrophobicity of the signal peptide，and the antibacterial activity of the purified recombinant protein was significant.

pedA gene；pediocin PA-1；prokaryotic expression；antibacterial activity；bioinformatics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0373

2017-05-09

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31401486），上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)工程中心建設(shè)項(xiàng)目（11DZ2280300）

黃宇良，男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)；E-mail：791313564@qq.com

汪立平，女，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)；E-mail：lpwang@shou.edu.cn

（責(zé)任編輯 狄艷紅）