• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    水飛薊素對丙烯酰胺誘導人肝癌細胞氧化損傷的保護作用

    2018-01-08 02:47:34趙筱鐸孫紅洋趙洪宇邵美麗
    食品科學 2018年1期
    關鍵詞:薊素水飛丙烯酰胺

    李 亮,趙筱鐸,劉 巍,孫紅洋,趙洪宇,邵美麗,*

    水飛薊素對丙烯酰胺誘導人肝癌細胞氧化損傷的保護作用

    李 亮1,趙筱鐸1,劉 巍2,孫紅洋1,趙洪宇1,邵美麗1,*

    研究水飛薊素對人肝癌細胞系(human hepatocellular liver carcinoma cell line,HepG2)增殖的影響以及對食品加工過程中產(chǎn)生的丙烯酰胺所致肝細胞毒性的預防效果,同時對其保護機制進行探討。通過噻唑藍法檢測水飛薊素對HepG2細胞增殖的影響和對丙烯酰胺誘發(fā)HepG2細胞毒性的保護效果;利用熒光探針法對HepG2細胞內活性氧的變化進行檢測,并運用比色法分別檢測細胞內脂質、蛋白質及DNA的氧化損傷標志物(丙二醛、蛋白羰基和8-羥基脫氧鳥苷)含量;利用酶活力試劑盒檢測細胞內過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力的變化。結果顯示,12~96 μg/mL的水飛薊素對HepG2細胞無毒性;水飛薊素可以抑制丙烯酰胺引起的細胞存活率降低和氧自由基水平升高,減少丙烯酰胺對脂質、蛋白質和DNA的氧化損傷,并提高細胞內抗氧化物酶CAT、SOD和GSH-Px活力。研究證明,水飛薊素能夠緩解丙烯酰胺對肝細胞造成的氧化損傷。

    水飛薊素;丙烯酰胺;人肝癌細胞系

    丙烯酰胺在日常生活中主要應用于工業(yè)領域,對人或動物具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性和致癌性[1-2]。近些年來有研究發(fā)現(xiàn),含淀粉類的食品經(jīng)高溫加工(≥120 ℃)會形成丙烯酰胺[3-5],抑制食品中丙烯酰胺對人類造成的損傷是非常必要的。有實驗證明,丙烯酰胺還具有明顯的肝毒性,這與丙烯酰胺能夠誘導細胞產(chǎn)生過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),從而破壞細胞內的氧化還原平衡,造成細胞損傷或凋亡有著密切聯(lián)系[6-7]。正常情況下,ROS產(chǎn)生于線粒體和免疫系統(tǒng),可以抵抗來自病原菌的侵害。但過量的ROS會對多種生物分子包括蛋白質、脂質和DNA具有損傷作用,引發(fā)多種退行性疾病[8-10]。此外,丙烯酰胺在細胞內會被細胞色素P450轉化成環(huán)氧丙酰胺(glycidamide,GA),GA對細胞內蛋白質、DNA的攻擊和對還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的消耗均比丙烯酰胺強[11-12]。

    植物化學物質能夠有效地保護細胞免受因過量ROS引起的氧化損傷,且因自身具有良好的藥用價值而被廣泛關注[13]。從奶薊草中提取的水飛薊素是一種天然黃酮類混合物,約由50%水飛薊賓、20%水飛薊亭、10%異水飛薊素、5%異水飛薊賓和15%其他有機聚合物構成。水飛薊素作為一種常用的保肝成分,具有強抗炎和抗氧化活性[14-15]。人肝癌細胞瘤細胞系(human hepatocellular liver carcinoma cell line,HepG2)具有增殖快、永生化等特性,且含有大部分肝細胞酶系,例如Ⅰ相和Ⅱ相解毒酶,常被用于作為探究化學物質毒性及細胞保護作用的模型[16-17]。本研究利用丙烯酰胺誘導建立HepG2細胞的氧化損傷模型,探討水飛薊素預防丙烯酰胺肝毒性的初步作用機制,從而為降低食品中丙烯酰胺對人類造成的損害提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    HepG2細胞由哈爾濱商業(yè)大學藥理學院惠贈。

    水飛薊素(純度≥90%) 美國Sigma公司;丙烯酰胺(純度≥99.9%)、噻唑藍(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)(純度>98%) 美國Amresco公司;RPMI-1640完全培養(yǎng)基美國Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青有限公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒、蛋白質羰基含量檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;人8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)檢測試劑盒中國Summus公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    Model-680酶標儀 美國伯樂公司;650-60熒光分光光度計 日本日立公司。

    1.3 方法

    1.3.1 細胞培養(yǎng)和預處理

    HepG2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2,選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞預處理及分組如下:對照組:正常培養(yǎng)的HepG2細胞;氧化應激模型組:8 mmol/L丙烯酰胺干預24 h培養(yǎng)的HepG2細胞;實驗組:分別用12、24、48、96 μg/mL水飛薊素提前干預6 h,再用8 mmol/L丙烯酰胺干預24 h,對應制成實驗組1、2、3、4。

    1.3.2 MTT法測定細胞存活率

    取對數(shù)生長期HepG2細胞按1×104個/孔的密度接種于96 孔細胞板中,37 ℃、5% CO2條件過夜培養(yǎng)后,分別向每孔中加入0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L丙烯酰胺干預24 h,每組設置3 個平行。再向各孔中加入20 μL MTT,37 ℃避光孵育4 h,棄去每孔中培養(yǎng)液,加入150 μL 二甲基亞砜,避光振蕩10 min,于570 nm波長處測定各組OD值,并按式(1)計算各組細胞存活率。

    式中:OD1為加入各濃度丙烯酰胺的細胞培養(yǎng)液OD值;OD2為未加入丙烯酰胺的細胞培養(yǎng)液OD值。

    取對數(shù)生長期HepG2細胞按1×104個/孔的密度接種于96 孔細胞板中,37 ℃、5% CO2條件過夜培養(yǎng)后,分別向每孔中加入0、12、24、48、96 μg/mL水飛薊素干預24 h,按照上述MTT法依次進行測定,每組設置3 個平行。并按式(2)計算各組細胞存活率。

    式中:OD3為加入各質量濃度水飛薊素的細胞培養(yǎng)液OD值;OD4為未加入水飛薊素的細胞培養(yǎng)液OD值。

    再利用上述MTT法依次對1.3.1節(jié)中對照組、模型組和實驗組進行測定,并按照式(3)計算各組細胞存活率。

    1.3.3 氧化指標水平的測定

    1.3.3.1 ROS相對水平測定

    取對數(shù)生長期HepG2細胞,按實驗需求給予不同因素處理,分別制成對照組、模型組、實驗組1~4。棄掉細胞培養(yǎng)液,每孔加入2 mL 10 μmol/L的熒光探針2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA),37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min。無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次后,收集細胞,用熒光分光光度計檢測,激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為525 nm。按式(4)計算ROS相對水平。

    1.3.3.2 氧化損傷標志物含量測定

    MDA、蛋白羰基和8-OHdG分別是細胞內脂質、蛋白質和DNA氧化損傷的標志物[18-20]。將對照組、模型組、實驗組1~4的培養(yǎng)液1 000 r/min離心10 min,收集細胞,預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌3 次,加入細胞裂解液對細胞進行裂解,2 500 r/min離心10 min收集細胞上清液。用BCA蛋白質量濃度檢測試劑盒測定細胞上清液蛋白質量濃度,然后分別按照MDA、蛋白羥基和8-OHdG檢測試劑盒上的方法測定MDA、蛋白羥基和8-OHdG含量,結果分別用nmol/mg pro、nmol/mg pro和μg/mg pro表示。

    1.3.4 CAT、SOD和GSH-Px活力的測定

    取對照組、模型組、實驗組1~4培養(yǎng)液,1 000 r/min離心10 min收集細胞,預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌3 次,加入細胞裂解液,冰浴條件下對細胞進行裂解后,2 500 r/min離心10 min收集細胞上清液。BCA蛋白質量濃度檢測試劑盒測定上清液蛋白質量濃度,并按照CAT、SOD和GSH-Px檢測試劑盒上的方法測定CAT、SOD和GSH-Px活力,用U/mg pro表示。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

    實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行分析,結果用 ±s表示。并對實驗結果進行t檢驗,P<0.05表示差異顯著。

    2 結果與分析

    2.1 丙烯酰胺對HepG2細胞的毒性作用

    圖1 丙烯酰胺對HepG2細胞的毒性作用Fig. 1 Cytotoxic effect of acrylamide on HepG2 cells

    MTT法檢測丙烯酰胺對HepG2細胞的毒性作用結果如圖1所示。HepG2細胞的存活率隨著丙烯酰胺濃度的增加而逐漸減少,并通過Graphpad Prism軟件計算丙烯酰胺作用24 h的半數(shù)致死劑量(half maximal inhibitory concentration,IC50)為(8.04±0.37) mmol/L,故本實驗選用8 mmol/L作為后續(xù)探究中丙烯酰胺的給藥濃度。

    2.2 水飛薊素對HepG2細胞增殖的影響

    利用MTT法檢測水飛薊素對HepG2細胞增殖的影響,結果如圖2所示。HepG2細胞在不同質量濃度(12、24、48、96 μg/mL)的水飛薊素作用下,細胞存活率與無水飛薊素干預正常條件培養(yǎng)的HepG2細胞相比無顯著差異。說明水飛薊素對HepG2細胞增殖沒有影響,為后續(xù)探究水飛薊素對丙烯酰胺誘導HepG2細胞毒性的抑制作用提供了保障。

    圖2 水飛薊素對HepG2細胞增殖的影響Fig. 2 Effect of silymarin on the proliferation of HepG2 cells

    2.3 水飛薊素對丙烯酰胺所致HepG2細胞毒性的影響

    圖3 水飛薊素對丙烯酰胺誘導HepG2細胞毒性的影響Fig. 3 Effect of silymarin on acrylamide-induced cytotoxicity in HepG2 cells

    如圖3所示,對照組細胞存活率顯著高于模型組(P<0.05),說明丙烯酰胺對HepG2細胞增殖具有抑制作用。而實驗組1~4的細胞存活率相比模型組顯著增加(P<0.05),說明水飛薊素能顯著緩解HepG2細胞受丙烯酰胺引發(fā)的細胞毒性,且與質量濃度呈正相關。

    2.4 水飛薊素對丙烯酰胺誘導損傷的HepG2細胞氧化指標的影響

    2.4.1 ROS相對水平

    細胞內過量ROS的產(chǎn)生能使細胞發(fā)生氧化應激現(xiàn)象,從而對細胞造成氧化損傷,所以細胞內ROS水平能直接反映細胞氧化損傷的程度[21]。運用熒光探針DCFH-DA法,對各組HepG2細胞中ROS相對水平進行測定,結果如圖4所示。實驗組1~4和對照組的ROS相對水平均顯著低于模型組(P<0.05)。結合MTT法的結果可知,丙烯酰胺能通過誘發(fā)大量ROS的生成,對HepG2細胞造成損傷,而水飛薊素則通過降低細胞中ROS的水平對HepG2細胞起到保護的效果,且與質量濃度呈正相關。

    圖4 水飛薊素對丙烯酰胺誘導HepG2細胞內ROS相對水平的影響Fig. 4 Effects of silymarin on relative ROS level in acrylamide-induced HepG2 cells

    2.4.2 MDA、蛋白羰基鍵和8-OHdG的含量

    圖5 水飛薊素對丙烯酰胺誘導HepG2細胞內MDA(A)、蛋白羰基(B)、8-OHdG(C)含量的影響Fig. 5 Effect of silymarin on the contents of MDA (A), protein carbonyl (B)and 8-OHdG (C) in acrylamide-induced HepG2 cells

    MDA是細胞內脂質的氧化損傷標志物,由細胞膜上的脂質與ROS發(fā)生的過氧化反應生成,能破壞甚至摧毀細胞膜[22]。MDA能和硫代巴比妥酸反應生成紅色物質,利用這一性質對HepG2細胞內的MDA含量進行測定。如圖5A所示,模型組的MDA含量顯著高于對照組(P<0.05),這與丙烯酰胺能誘發(fā)細胞產(chǎn)生大量ROS密切相關;而實驗組隨著水飛薊素質量濃度的增加逐漸減少實驗組HepG2細胞內的MDA含量,這一結果與前面細胞內ROS相對水平測定的結果相符。由此說明,水飛薊素能夠減少丙烯酰胺對HepG2細胞內脂質的氧化損傷。

    蛋白羰基是ROS或活性氮氧化蛋白的產(chǎn)物,通常用來衡量蛋白質的氧化損傷程度[23]。運用2,4-二硝基苯肼比色法對HepG2細胞內的蛋白羰基含量進行檢測。如圖5B所示,所有實驗組和對照組的蛋白羰基含量顯著低于模型組(P<0.05)。表明水飛薊素能夠抑制丙烯酰胺對HepG2細胞內蛋白質的氧化損傷,且與水飛薊素的質量濃度呈正相關。

    8-OHdG是ROS誘發(fā)細胞內DNA羥基化形成的,具有修復鳥嘌呤氧化損傷的功能,被公認為一個合適的鑒定DNA氧化損傷標志物[24]。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測HepG2細胞內8-OHdG含量,由圖5C可知,除實驗組1外其他組別的8-OHdG含量均顯著低于模型組(P<0.05)。結果證明,水飛薊素能夠抑制丙烯酰胺對HepG2細胞內DNA的氧化損傷,且呈劑量依賴性。

    綜上所述,水飛薊素對丙烯酰胺造成HepG2細胞內脂質、蛋白質和DNA的氧化損傷均能起到保護作用,且與水飛薊素質量濃度呈正相關。

    2.5 水飛薊素對丙烯酰胺誘導損傷的HepG2細胞抗氧化能力的影響

    圖6 水飛薊素對丙烯酰胺誘導HepG2細胞內CAT、SOD和GSH-Px活力的影響Fig. 6 Effect of silymarin on the activities of CAT, SOD and GSH-Px in acrylamide-induced HepG2 cells

    CAT、SOD和GSH-Px是細胞內3 種重要的抗氧化物酶,常被用于機體抗氧化損傷作用方面的研究。CAT能促使細胞中有害的H2O2轉化為無毒的氧和水[25];SOD是一種金屬酶,是機體內抵抗ROS損傷的第一道防御關卡,可以使有毒的超氧化自由基降解為氧和過氧化物[26];GSH-Px在體內能通過GSH來調控ROS以及消除有機過氧化物[27],而GSH是一種內源性巰基化合物,對維護細胞的氧化還原平衡和氨基酸平衡、調控細胞基因及胞內信號的轉導起到重要作用,與多種蛋白的結構、功能和穩(wěn)定性相關[28]。有研究發(fā)現(xiàn),丙烯酰胺在體內的代謝也與GSH密切相關,丙烯酰胺在體內一部分被氧化成GA,GA和丙烯酰胺都能在谷胱甘肽-S-轉移酶的作用下,結合GSH形成GSH-丙烯酰胺復合物,最后降解為硫醇尿酸[29]。對HepG2細胞內抗氧化物酶CAT、SOD和GSH-Px活力的測定結果由圖6可知,實驗組1~4和對照組的CAT活力均顯著高于模型組(P<0.05),而除實驗組1外其余組別的SOD和GSH-Px活力顯著大于模型組(P<0.05)。說明水飛薊素能通過提高胞內CAT、SOD和GSH-Px的活力來保護HepG2細胞抵抗丙烯酰胺誘導的損傷作用,且與水飛薊素的質量濃度呈正相關性,水飛薊素的這一功能可能與細胞內的一種核轉錄因子Nrf2相關[30]。

    3 結 論

    本實驗探究水飛薊素在保護肝細胞抵抗丙烯酰胺誘導的氧化損傷方面的功能。研究發(fā)現(xiàn)水飛薊素能通過降低細胞內ROS的水平,改善抗氧化物酶CAT、SOD和GSH-Px的活力,對丙烯酰胺造成HepG2細胞內脂質、蛋白質和DNA的氧化損傷起到抑制效果,且與水飛薊素劑量呈正相關性。MTT法測定結果顯示經(jīng)不同質量濃度水飛薊素處理的HepG2細胞的存活率與正常培養(yǎng)細胞無統(tǒng)計學意義上的差異,這說明水飛薊素對HepG2細胞增殖沒有影響。本研究證實水飛薊素能預防丙烯酰胺的肝毒性,并對其作用機制進行了初步探究,為降低食品中丙烯酰胺對機體造成損傷的風險提供了一條途徑。

    [1] XU Y, CUI B, RAN R, et al. Risk assessment, formation, and mitigation of dietary acrylamide: current status and future prospects[J].Food and Chemical Toxicology, 2014, 69: 1-12. DOI:10.1016/j.fct.2014.03.037.

    [2] ZHAO M, WANG F S, HU X S, et al. Effect of acrylamide-induced neurotoxicity in a primary astrocytes/microglial co-culture model[J].Toxicology in Vitro, 2017, 39: 119-125. DOI:10.1016/j.tiv.2016.11.007.

    [3] PEDRESCHI F, MARIOTTI M S, GRANBY K. Current issues in dietary acrylamide: formation, mitigation and risk assessment[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2014, 94(1): 9-20.DOI:10.1002/jsfa.6349.

    [4] RIBOLDI B P, VINHAS á M, MOREIRA J D. Risks of dietary acrylamide exposure: a systematic review[J]. Food Chemistry, 2014,157(15): 310-322. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.02.046.

    [5] MOTTRAM D S, WEDZICHA B L, DODSON A T. Acrylamide is formed in the Maillard reaction[J]. Nature, 2002, 419: 448-449.DOI:10.1038/419448a.

    [6] CHEN W, SU H M, XU Y, et al. Protective effect of wild raspberry (Rubus hirsutus Thunb.) extract against acrylamide-induced oxidative damage is potentiated after simulated gastrointestinal digestion[J]. Food Chemistry,2016, 196(1): 943-952. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.10.024.

    [7] SHAN X Y, LI Y, MENG X, et al. Curcumin and (-)-epigallocatechin-3-gallate attenuate acrylamide-induced proliferation in HepG2 cells[J].Food and Chemical Toxicology, 2014, 66: 194-202. DOI:10.1016/j.fct.2014.01.046.

    [8] MURPHY M P. How mitochondria produce reactive oxygen species[J].Biochemical Journal, 2009, 417(1): 1-13. DOI:10.1042/BJ20081386.

    [9] FENG X J, YU W, ZHOU F F, et al. A novel small molecule compound diaporine inhibits breast cancer cell promoting ROS generation[J]. Biomedicine and Pharmacotherapy, 2016, 83: 1038-1047. DOI:10.1016/j.biopha.2016.08.029.

    [10] LI S, CHEN G W, ZHANG C, et al. Research progress of natural antioxidants in foods for the treatment of diseases[J]. Food Science and Human Wellness, 2014, 3(3/4): 110-116. DOI:10.1016/j.fshw.2014.11.002.

    [11] NAN M, HU J X, CHURCHWELLl M I, et al. Genotoxic effects of acrylamide and glycidamide in mouse lymphoma cells[J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46(2): 628-636. DOI:10.1016/j.fct.2007.09.093.

    [12] LIU Z G, SONG G, ZOU C, et al. Acrylamide induces mitochondrial dysfunction and apoptosis in BV-2 microglial cells[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2015, 84: 42-53. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2015.03.013.

    [13] OROIAN M, ESCRICHE I. Antioxidants: characterization, natural sources, extraction and analysis[J]. Food Research International, 2015,74: 10-36. DOI:10.1016/j.foodres.2015.04.018.

    [14] ZHOLOBENKO A, MODRIANSKY M. Silymarin and its constituents in cardiac preconditioning[J]. Fitoterapia, 2014, 97: 122-132.DOI:10.1016/j.f i tote.2014.05.016.

    [15] HSIANG C, LIN L J, KAO S T, et al. Glycyrrhizin, silymarin, and ursodeoxycholic acid regulate a common hepatoprotective pathway in HepG2 cells[J]. Phytomedicine, 2015, 22(7/8): 768-777. DOI:10.1016/j.phymed.2015.05.053.

    [16] BAEZA G, SARRIá B, MATEOS R, et al. Dihydrocaffeic acid,a major microbial metabolite of chlorogenic acids, shows similar protective effect than a yerba mate phenolic extract against oxidative stress in HepG2 cells[J]. Food Research International, 2016, 87: 25-33.DOI:10.1016/j.foodres.2016.06.011.

    [17] YAN F J, DAI G H, ZHENG X D. Mulberry anthocyanin extract ameliorates insulin resistance by regulating PI3K/AKT pathway in HepG2 cells and db/db mice[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2016, 36: 68-80. DOI:10.1016/j.jnutbio.2016.07.004.

    [18] YONNY M E, GARCíA E, JOSéI A L, et al. Measurement of malondialdehyde as oxidative stress biomarker in goat plasma by HPLC-DAD[J]. Microchemical Journal, 2016, 129: 281-285.DOI:10.1016/j.microc.2016.07.010.

    [19] KEDZIERSKA M, OLAS B, WACHOWICZ B, et al. Relationship between thiol, tyrosine and carbonyl formation as biomarkes of oxidative stress and changes of hemostatic function of plasma form breast cancer patients before surgery[J]. Clinical Biochemistry, 2012,45(3): 231-236. DOI:10.1016/j.clinbiochem.2011.12.002.

    [20] SETYANINGSIH Y, HUSODO A H, ASTUTI I. Detection of urinary 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) levels as biomarker of oxidative DNA damage among home industry workers exposed to chromium[J].Procedia Environmental Sciences, 2015, 23: 290-296. DOI:10.1016/j.proenv.2015.01.043.

    [21] LEPETSOS P, PAPAVASSILIOU A G. ROS/oxidative stress signaling in osteoarthritis[J]. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease, 2016, 1862(4): 576-591. DOI:10.1016/j.bbadis.2016.01.003.

    [22] BUSH C J, BINDER C J. Malondialdehyde epitopes as mediators of sterile inflammation[J]. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular and Cell Biology of Lipids, 2016, 1862(4): 398-406. DOI:10.1016/j.bbalip.2016.06.016.

    [23] WU J Z, LUO X T, JING S Q, et al. Tow-dimensional gel electrophoretic detection of portein carbonyls derivatized with biotinhydrazide[J]. Journal of Chromatography B, 2016, 1019(15): 128-131.DOI:10.1016/j.jchromb.2015.11.003.

    [24] MARTINS G V, MARQUES A C, FORTUNATO E, et al. 8-Hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) biomarker detection down to picoMolar level on a plastic antibody film[J]. Biosensors and Bioelectronics,2016, 86(15): 225-234. DOI:10.1016/j.bios.2016.06.052.

    [25] ZHANG X Y, LI Y H, WANG J X, et al. Identification and characteristic analysis of the catalase gene from Locusta migratoria[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2016, 132: 125-131. DOI:10.1016/j.pestbp.2016.03.010.

    [26] JAIKUA W, KUEAKHAI P, CHAITHIRAYANON K, et al.Cytosolic superoxide dismutase can provide protection against Fasciocla gigantica[J]. Acta Tropica, 2016, 162: 75-82. DOI:10.1016/j.actatropica.2016.06.020.

    [27] LIU G D, SHENG Z, WANG Y F, et al. Glutathione peroxidase 1 expression, malondialdehyde levels and histological alterations in the liver of Acrossochellus fasciatus exposed to cadmium chloride[J].Gene, 2016, 2(10): 210-218. DOI:10.1016/j.gene.2015.12.034.

    [28] ZHAO L Z, ZHAO L, MIAO Y Q, et al. Selective eletrochemical determination of glutathione from the leakage of intracellular GSH contents in HeLa cells following doxorubicin-induced cell apoptosis[J].Electrochimica Acta, 2016, 206(10): 86-98. DOI:10.1016/j.electacta.2016.04.117.

    [29] LUO Y S, LONG T Y, SHEN L C, et al. Synthesis, characterization and analysis of the acrylamide- and glycidamide-glutathione conjugates[J]. Chemic-Biological Interactions, 2015, 237(25): 38-46.DOI:10.1016/j.cbi.2015.05.002.

    [30] ZHANG H J, WANG J, LIU Y L, et al. Wheat bran feruloyl oligosaccharides ameliorate AAPH-induced oxidative stress in HepG2 cell via Nrf2 signalling[J]. Journal of Functional Foods, 2016, 25: 333-340. DOI:10.1016/j.jff.2016.06.012.

    Protective Effect of Silymarin on Acrylamide-Induced Oxidative Damage in HepG2 Cells

    LI Liang1, ZHAO Xiaoduo1, LIU Wei2, SUN Hongyang1, ZHAO Hongyu1, SHAO Meili1,*
    (1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2. Tongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Tongjiang 156400, China)

    This study was designed to study the effect of silymarin on the proliferation of human hepatocellular liver carcinoma cell line (HepG2) and its preventive effect on the hepatotoxicity caused by acrylamide produced during food processing and to discuss the underlying mechanism. The effect of silymarin on the proliferation of HepG2 cells and its protective effect on acrylamide-induced cytotoxicity in HepG2 cells were evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. By use of fl uorescence probe 2,7-dichlorodi-hydrof l uorescein diacetate (DCFHDA) method, the change in intracellular reactive oxygen species (ROS) of HepG2 cells was detected, and the markers of oxidative damage to lipid, protein and DNA (malondialdehyde, protein carbonyl and 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine) were colorimetrically detected. The activities of the intracellular antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were measured with commercial kits. Our data revealed that the silymarin at 12–96 μg/mL had no cytotoxic effect on HepG2 cells and could increase cell viability and the enzyme activities of CAT,SOD and GSH-Px, reducing intracellular ROS levels and oxidative damage induced by acrylamide to lipid, protein and DNA in HepG2 cells. Therefore, silymarin can protect hepatic cells from oxidative damage caused by food-derived acrylamide.

    silymarin; acrylamide; HepG2

    10.7506/spkx1002-6630-201801036

    TS201.6

    A

    1002-6630(2018)01-0238-05

    李亮, 趙筱鐸, 劉巍, 等. 水飛薊素在丙烯酰胺誘導人肝癌細胞氧化損傷中的保護作用[J]. 食品科學, 2018, 39(1):238-242.

    10.7506/spkx1002-6630-201801036. http://www.spkx.net.cn

    LI Liang, ZHAO Xiaoduo, LIU Wei, et al. Protective effect of silymarin on acrylamide-induced oxidative damage in HepG2 cells[J]. Food Science, 2018, 39(1): 238-242. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801036.http://www.spkx.net.cn

    2016-10-12

    黑龍江省自然科學基金面上項目(C201303);黑龍江省教育廳自然科學基金項目(12541045)

    李亮(1990—),男,碩士研究生,研究方向為食品安全。E-mail:1066250905@qq.com

    *通信作者簡介:邵美麗(1974—),女,教授,博士,研究方向為食品安全。E-mail:shml0915@163.com

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.同江出入境檢驗檢疫局,黑龍江 同江 156400)

    猜你喜歡
    薊素水飛丙烯酰胺
    加拿大擬批準水飛薊素作為食品補充成分
    電位滴定法測定聚丙烯酰胺中氯化物
    云南化工(2021年11期)2022-01-12 06:06:18
    水飛薊油的提取及應用
    基于Web of Science的水飛薊素研究文獻計量分析
    水飛薊素固體分散體的制備及5種成分的溶出度
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:19:55
    水飛薊素腸溶聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒的制備及體外釋藥研究Δ
    中國藥房(2016年34期)2016-12-22 09:54:08
    水飛薊賓處方前研究
    食品中丙烯酰胺的測定及其含量控制方法
    低分子量丙烯酰胺對深部調驅采出液脫水的影響
    鐵(Ⅲ)配合物催化雙氧水氧化降解聚丙烯酰胺
    亚洲无线在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲精品456在线播放app | 黄片wwwwww| 久久精品影院6| 日韩欧美免费精品| 午夜精品在线福利| 高清在线国产一区| 亚洲色图av天堂| 深夜a级毛片| 精品久久久久久久久av| 成人av在线播放网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产精品99久久久久久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 露出奶头的视频| 久久九九热精品免费| 99久国产av精品| 看黄色毛片网站| 我的老师免费观看完整版| 久久久成人免费电影| av视频在线观看入口| 亚洲欧美激情综合另类| 尾随美女入室| 亚洲美女黄片视频| 日本免费a在线| 精品一区二区三区视频在线| 久久久精品大字幕| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 午夜影院日韩av| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 看片在线看免费视频| 身体一侧抽搐| 色哟哟·www| 亚洲最大成人手机在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| av.在线天堂| 亚洲综合色惰| 色精品久久人妻99蜜桃| 男女那种视频在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 欧美黑人欧美精品刺激| 成人av在线播放网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 国产一区二区在线观看日韩| 日本 欧美在线| 91精品国产九色| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲人成网站在线播| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久午夜欧美精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 99热6这里只有精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 色综合站精品国产| 久久久久性生活片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产乱人视频| 色在线成人网| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产亚洲91精品色在线| 欧美精品国产亚洲| 中文字幕熟女人妻在线| 久久6这里有精品| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 国产精品亚洲美女久久久| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久久久久九九精品二区国产| 一级a爱片免费观看的视频| 97超视频在线观看视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久99热6这里只有精品| 日韩欧美国产在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 一级黄色大片毛片| 国产亚洲91精品色在线| 人妻少妇偷人精品九色| 91在线观看av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一区二区三区视频了| 国产男人的电影天堂91| 熟女人妻精品中文字幕| 特级一级黄色大片| 五月伊人婷婷丁香| 桃红色精品国产亚洲av| 免费在线观看日本一区| 午夜影院日韩av| 两个人视频免费观看高清| 亚洲av不卡在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 婷婷六月久久综合丁香| av女优亚洲男人天堂| 国产精品野战在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 一个人免费在线观看电影| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 免费无遮挡裸体视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩欧美精品v在线| 69av精品久久久久久| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品不卡国产一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| 国产成人av教育| 亚洲成av人片在线播放无| 2021天堂中文幕一二区在线观| 露出奶头的视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久久久久中文| 日韩精品青青久久久久久| 久久久久久大精品| 一进一出抽搐动态| 色5月婷婷丁香| 欧美日本亚洲视频在线播放| av视频在线观看入口| 国产精品久久电影中文字幕| 精品福利观看| 国产精品人妻久久久影院| 久久久色成人| 尾随美女入室| 日韩精品有码人妻一区| 春色校园在线视频观看| 波多野结衣巨乳人妻| 此物有八面人人有两片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产淫片久久久久久久久| 免费看日本二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美日韩精品成人综合77777| 日本 av在线| 国产三级在线视频| 久久这里只有精品中国| 亚洲av美国av| 中文字幕熟女人妻在线| 免费观看的影片在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美最黄视频在线播放免费| 天天一区二区日本电影三级| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日韩精品有码人妻一区| 露出奶头的视频| www.www免费av| 中出人妻视频一区二区| 免费观看精品视频网站| 亚洲av五月六月丁香网| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲在线自拍视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲在线自拍视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品久久久久久成人av| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩精品中文字幕看吧| 99在线人妻在线中文字幕| 国产美女午夜福利| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久久久久久精品吃奶| 九色国产91popny在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美黑人巨大hd| 99热精品在线国产| 久久亚洲精品不卡| 免费观看的影片在线观看| 国产精品人妻久久久久久| eeuss影院久久| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲无线观看免费| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲人成网站在线播| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 欧美激情在线99| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜精品在线福利| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产三级在线视频| 97超视频在线观看视频| 欧美日韩黄片免| 久久国产乱子免费精品| 日韩欧美三级三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲图色成人| 免费观看精品视频网站| 欧美激情在线99| 精品久久久久久久末码| 亚洲人成伊人成综合网2020| 免费在线观看日本一区| 国产免费一级a男人的天堂| 88av欧美| 久久国内精品自在自线图片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 人妻少妇偷人精品九色| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 悠悠久久av| a级毛片免费高清观看在线播放| 午夜爱爱视频在线播放| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久久久久大精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 午夜免费激情av| 特级一级黄色大片| 露出奶头的视频| 日韩欧美国产在线观看| 在线观看一区二区三区| 国产视频内射| 不卡一级毛片| av视频在线观看入口| 国产精品野战在线观看| 亚州av有码| 女人被狂操c到高潮| 欧美最新免费一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久久大精品| 久久这里只有精品中国| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 韩国av在线不卡| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩一本色道免费dvd| 变态另类丝袜制服| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久午夜欧美精品| 校园人妻丝袜中文字幕| 日本三级黄在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久久久久大精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 看免费成人av毛片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 性色avwww在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 成人av在线播放网站| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 男人舔奶头视频| 男女边吃奶边做爰视频| 热99re8久久精品国产| 特级一级黄色大片| www.色视频.com| 日韩高清综合在线| 午夜久久久久精精品| 免费观看在线日韩| 深夜精品福利| 最后的刺客免费高清国语| 九九爱精品视频在线观看| 精品福利观看| 国产不卡一卡二| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产单亲对白刺激| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 十八禁网站免费在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 麻豆一二三区av精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品一及| 最后的刺客免费高清国语| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日韩国内少妇激情av| 无遮挡黄片免费观看| 免费看美女性在线毛片视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产探花在线观看一区二区| 12—13女人毛片做爰片一| 深夜精品福利| 国产精华一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 黄色日韩在线| 国产一区二区在线观看日韩| 嫩草影院新地址| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲,欧美,日韩| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲七黄色美女视频| 日韩欧美在线二视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| av中文乱码字幕在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 午夜爱爱视频在线播放| 色综合婷婷激情| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 搡老熟女国产l中国老女人| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久久久久久午夜电影| 精品人妻熟女av久视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 国内精品美女久久久久久| 国产精品无大码| 国产黄a三级三级三级人| 欧美zozozo另类| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 熟女人妻精品中文字幕| 真人做人爱边吃奶动态| 国产三级中文精品| 日韩强制内射视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 中国美白少妇内射xxxbb| 村上凉子中文字幕在线| 欧美一区二区亚洲| 免费看日本二区| 少妇高潮的动态图| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 午夜老司机福利剧场| 十八禁国产超污无遮挡网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 天堂√8在线中文| 51国产日韩欧美| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲精品成人久久久久久| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美极品一区二区三区四区| 国产乱人伦免费视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲av成人精品一区久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久精品欧美日韩精品| x7x7x7水蜜桃| 久久久久免费精品人妻一区二区| av国产免费在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 九九爱精品视频在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 九色成人免费人妻av| 国产人妻一区二区三区在| 国产一区二区三区视频了| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 美女高潮的动态| 亚洲最大成人中文| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 性色avwww在线观看| 国内精品久久久久精免费| 亚洲 国产 在线| 国产高清有码在线观看视频| av在线老鸭窝| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 成人av在线播放网站| av福利片在线观看| 欧美性感艳星| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 久久6这里有精品| 国产伦在线观看视频一区| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲三级黄色毛片| 日韩欧美三级三区| 国产单亲对白刺激| 精品不卡国产一区二区三区| 变态另类丝袜制服| 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| av黄色大香蕉| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 18+在线观看网站| 99久久中文字幕三级久久日本| 最新在线观看一区二区三区| 不卡一级毛片| 69av精品久久久久久| 中文字幕av在线有码专区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美在线一区亚洲| 国产激情偷乱视频一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 99热6这里只有精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 91在线精品国自产拍蜜月| 看黄色毛片网站| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成人a区在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 99久久精品一区二区三区| 成年女人永久免费观看视频| 国产成人一区二区在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩在线高清观看一区二区三区 | 精品国内亚洲2022精品成人| 成人特级av手机在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 一个人免费在线观看电影| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产高清视频在线观看网站| 中亚洲国语对白在线视频| 俺也久久电影网| 在线观看舔阴道视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 一级av片app| 欧美区成人在线视频| 嫩草影院精品99| 国产综合懂色| 日韩精品青青久久久久久| 男人的好看免费观看在线视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品久久久久久久电影| 91在线精品国自产拍蜜月| 日韩欧美在线乱码| 国产男人的电影天堂91| 午夜福利成人在线免费观看| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产免费av片在线观看野外av| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲国产精品合色在线| 久久久久国内视频| 日韩人妻高清精品专区| 久久久国产成人精品二区| 亚洲美女视频黄频| 99热这里只有是精品50| 亚洲无线在线观看| 色综合色国产| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品国产高清国产av| 国产精品久久视频播放| 国内精品美女久久久久久| 国内精品久久久久久久电影| 精华霜和精华液先用哪个| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲av成人av| 欧美+日韩+精品| 最近最新免费中文字幕在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 色视频www国产| 亚洲美女视频黄频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品女同一区二区软件 | 午夜精品久久久久久毛片777| 国产av在哪里看| 校园春色视频在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 国产成人一区二区在线| 最后的刺客免费高清国语| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲欧美激情综合另类| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日韩大尺度精品在线看网址| 俄罗斯特黄特色一大片| 国语自产精品视频在线第100页| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲自拍偷在线| 久久精品国产亚洲av天美| 深夜精品福利| 91狼人影院| 一区二区三区免费毛片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品伦人一区二区| 久久精品国产清高在天天线| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本-黄色视频高清免费观看| 很黄的视频免费| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 天天一区二区日本电影三级| 毛片女人毛片| 日韩欧美精品v在线| 国产在视频线在精品| 久久久久久久午夜电影| 免费无遮挡裸体视频| av女优亚洲男人天堂| 成人三级黄色视频| 观看免费一级毛片| 久久久精品欧美日韩精品| 黄色日韩在线| 午夜激情福利司机影院| 日韩精品有码人妻一区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩欧美免费精品| 久久香蕉精品热| 国产中年淑女户外野战色| 少妇丰满av| 国产精品电影一区二区三区| 成人午夜高清在线视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 丰满的人妻完整版| 在线播放无遮挡| 欧美黑人巨大hd| ponron亚洲| 特大巨黑吊av在线直播| 精品午夜福利在线看| 亚洲无线观看免费| 男插女下体视频免费在线播放| 国产三级中文精品| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品日韩av在线免费观看| 伦理电影大哥的女人| 久9热在线精品视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品一区二区三区av网在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费在线观看影片大全网站| 色av中文字幕| 少妇的逼好多水| 黄色一级大片看看| 午夜精品久久久久久毛片777| 午夜福利欧美成人| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品久久久久久av不卡| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲不卡免费看| 91久久精品国产一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| bbb黄色大片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久亚洲真实| 国产乱人视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 露出奶头的视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产成年人精品一区二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 在现免费观看毛片| 日韩中字成人| 波多野结衣巨乳人妻| 一边摸一边抽搐一进一小说| 2021天堂中文幕一二区在线观| 男女那种视频在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲不卡免费看| 日韩强制内射视频| 一区二区三区激情视频| 特大巨黑吊av在线直播| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 99热这里只有是精品在线观看| 97超视频在线观看视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲成人久久爱视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜精品在线福利| 午夜a级毛片| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 韩国av在线不卡| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美+日韩+精品| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 韩国av一区二区三区四区| 禁无遮挡网站| 一级a爱片免费观看的视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成人三级黄色视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩欧美精品免费久久| 午夜福利18| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲精品一区av在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 夜夜爽天天搞| av天堂在线播放| 日韩大尺度精品在线看网址| 色精品久久人妻99蜜桃| 少妇人妻一区二区三区视频| 看片在线看免费视频| 亚洲欧美清纯卡通| 一a级毛片在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产成人aa在线观看| 亚洲综合色惰| 亚洲国产精品合色在线| 在线看三级毛片| 九色成人免费人妻av|