大孔樹脂-中壓柱層析聯(lián)用分離純化藍(lán)莓花色苷

于澤源，趙劍輝，李興國，徐雅琴，湯 雪，楊 昱,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大孔樹脂-中壓柱層析聯(lián)用分離純化藍(lán)莓花色苷

于澤源1，趙劍輝1，李興國1，徐雅琴2，湯 雪1，楊 昱2,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

以藍(lán)莓果實(shí)為原料，采用大孔樹脂-中壓柱層析聯(lián)用分離純化藍(lán)莓花色苷。分別比較6 種不同類型樹脂對藍(lán)莓花色苷靜態(tài)吸附-解吸效果，優(yōu)化大孔樹脂分離純化藍(lán)莓花色苷的工藝。結(jié)果表明：D101大孔樹脂對藍(lán)莓花色苷的分離效果最佳，對花色苷的吸附屬于多分子層吸附。在柱壓力為1 MPa、溫度25 ℃、上樣液質(zhì)量濃度為0.073 mg/mL、洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、流速5 mL/min條件下，經(jīng)D101大孔樹脂柱分離后，花色苷純度從5.53%增加到75.58%，提高了12.67 倍。采用Sephadex LH-20中壓柱層析對藍(lán)莓花色苷進(jìn)一步分離純化，主要得到1 種花色苷組分，通過高效液相色譜和高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用對藍(lán)莓花色苷進(jìn)行定性和定量分析，確定該組分為矢車菊-3-O-葡萄糖苷，純度達(dá)到90.88%。

藍(lán)莓；中壓柱層析；花色苷；大孔樹脂

藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum L.）為杜鵑花科越橘屬小漿果，廣泛分布于北美、中國東北與俄羅斯[1]。藍(lán)莓果實(shí)營養(yǎng)豐富，是含有花色苷種類最多，花色苷含量最高的小漿果之一[2]。Lee等[3]從美國矮叢藍(lán)莓中鑒定出14 種花色苷；Barnes等[4]從美國南部高叢藍(lán)莓中鑒定出26 種花色苷；而Liu Yixiang等[5]從中國野生藍(lán)莓中鑒定出13 種花色苷。其中，飛燕草素、矢車菊素、牽?；ㄋ?、芍藥素和錦葵素與葡萄糖、半乳糖、蕓香糖、阿拉伯糖等形成的糖苷物是藍(lán)莓果實(shí)中的主要花色苷[2-5]。藍(lán)莓花色苷具有清除自由基[3]、抗菌[1]、抗炎癥[6]、預(yù)防心血管和神經(jīng)退行性疾病、抑制癌細(xì)胞增殖[7]以及改善視力[8]等多種功效，正逐漸引起植物學(xué)家、醫(yī)藥學(xué)家的關(guān)注，成為研究熱點(diǎn)。但是，目前有關(guān)藍(lán)莓花色苷生物活性的研究報(bào)道多采用花色苷的混合提取物，無法對花色苷結(jié)構(gòu)與活性之間的內(nèi)在聯(lián)系進(jìn)行更深入的研究。因此，建立一種能夠獲得大量高純度的單一花色苷的方法將對藍(lán)莓花色苷的構(gòu)效關(guān)系研究具有重要意義。

植物提取物中活性成分的初步富集與純化是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟?；钚猿煞殖Ｒ?guī)的分離方法一般是通過液-液萃取[9]或者制備型高效液相色譜分離[10]，但是，前者分離效果較差且得到的產(chǎn)品質(zhì)量少，而后者成本較高并難以推廣[11]。大孔樹脂是一類新型的非離子型高分子吸附分離介質(zhì)，具有高穩(wěn)定性和特殊的選擇性，操作條件溫和、富集效果明顯、成本低廉、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[12-13]，已被廣泛應(yīng)用于花色苷[13]、多糖[14]、多酚[15]等活性成分的分離純化研究中。近年來，國內(nèi)外一些研究者也將大孔吸附樹脂應(yīng)用于藍(lán)莓花色苷的分離純化[16-17]，但是僅靠大孔樹脂分離純化成分復(fù)雜的藍(lán)莓花色苷，無法得到令人滿意的高純度組分，這也成為限制藍(lán)莓花色苷廣泛應(yīng)用的一個(gè)亟待解決的問題。因此，本研究在系統(tǒng)分析了6 種大孔樹脂對藍(lán)莓花色苷分離效果的基礎(chǔ)上，采用中壓柱層析法，將D101大孔樹脂與Sephadex LH-20中壓柱層析聯(lián)用，對藍(lán)莓花色苷進(jìn)行分離與純化，并對得到的花色苷單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。本研究將為工業(yè)化生產(chǎn)高純度藍(lán)莓花色苷和藍(lán)莓花色苷構(gòu)效關(guān)系研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果實(shí)采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站，挑選出無病蟲害、無機(jī)械損傷、成熟度一致的藍(lán)莓‘美登’果實(shí)，清洗瀝干后速凍，并于-20 ℃冰箱中凍藏。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 美國諾威公司；Sephadex LH-20 瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；D4020、DA201、D3520、D101、HPD-100、AB-8型大孔樹脂 天津市大鈞科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì)、T6新悅可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HL-2恒流泵、BS-100A自動部分收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、HPLC-質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；中壓制備色層析儀 上海市同田有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓花色苷的提取

稱取一定質(zhì)量藍(lán)莓果漿，用pH 2.0、95%乙醇溶液按液料比10∶1（V/m）配制成藍(lán)莓果漿溶液。在常溫條件下，功率510 W超聲30 min。然后真空抽濾（0.45 μm濾膜），濾渣在相同條件下提取2 次，合并濾液。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮（溫度＜50 ℃）除去乙醇，濃縮物用乙酸乙酯萃取，除去脂溶性物質(zhì)，萃取后剩余物減壓濃縮，得到紅色黏稠的藍(lán)莓花色苷粗提液，凍干，得到藍(lán)莓花色苷粗提物凍干粉，備用。

1.3.2 花色苷質(zhì)量濃度及純度的測定

準(zhǔn)確稱取0.005 0 g的花色苷粉末，配制成1 g/L的花色苷溶液，采用pH值示差法測定花色苷含量[18]。按照公式（1）、（2）計(jì)算藍(lán)莓花色苷質(zhì)量濃度和純度[19]。

式中：ρ為花色苷質(zhì)量濃度/（g/L）；P為純度/%；A為pH 1.0的樣品稀釋液吸光度；A’為pH 4.5的樣品稀釋液吸光度；f為稀釋倍數(shù)；449.2為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量；V為花色苷提取液體積/L；26 900為矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；1為比色皿光程/cm；m為花色苷的質(zhì)量/g。

1.3.3 大孔樹脂初步純化藍(lán)莓花色苷

1.3.3.1 樹脂靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)如下：準(zhǔn)確稱取經(jīng)過預(yù)處理[20]后的6 種大孔樹脂各1.000 g（相當(dāng)于干樹脂0.356 4 g）置于100 mL具塞三角瓶中，精密加入藍(lán)莓花色苷粗提液50.00 mL（終質(zhì)量濃度0.054 9 mg/mL），25 ℃條件下，100 r/min振蕩24 h，測定濾液中剩余花色苷質(zhì)量濃度，按照公式（3）、（4）計(jì)算靜態(tài)吸附量與吸附率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以下實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)相同。

靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)如下：向已吸附飽和的6 種樹脂中分別精密加入50.00 mL 60%乙醇溶液，25 ℃條件下，100 r/min振蕩解吸24 h，測定解吸液中花色苷質(zhì)量濃度，按照公式（5）計(jì)算解吸率。

式中：qe為吸附量/（mg/g）；E和D分別為吸附率/%和解吸率/%；V0為上樣體積/mL；m為干樹脂質(zhì)量/g；ρ0為花色苷粗提液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρe和ρd分別為吸附和解吸平衡時(shí)花色苷溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Vd為解吸平衡時(shí)花色苷溶液體積/mL。

根據(jù)吸附量、吸附率及解吸率，初步篩選大孔樹脂。

1.3.3.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸動力學(xué)測定

將初步篩選出的HPD-100、DA201、D101樹脂，進(jìn)行花色苷的靜態(tài)吸附和解吸動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，方法同1.3.3.1節(jié)。在吸附和解吸過程中，前1 h每隔20 min取0.5 mL，1 h后每隔0.5 h取0.5 mL溶液測定花色苷含量，直到平衡。分別以吸附量和解吸量為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制吸附和解吸動力學(xué)曲線，確定純化花色苷的最佳大孔樹脂。

1.3.3.3 吸附等溫線的測定

在25、30、35 ℃的恒溫水浴振蕩器中，向裝有1.000 g的D101大孔吸附樹脂（相當(dāng)于干樹脂0.356 4 g）的100 mL具塞三角瓶中分別加入不同質(zhì)量濃度（0.026、0.044、0.065、0.073、0.085、0.109 mg/mL）的花色苷提取液50.00 mL，100 r/min振蕩吸附4.5 h，測定濾液中剩余花色苷質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附量，考察它們與Langmuir方程（公式（6））和Freundlich方程（公式（7））的符合情況。Langmuir和Freundlich方程經(jīng)常被用來描述吸附劑與溶質(zhì)之間的吸附行為。

式中：qe為吸附量/（mg/g）；ρe為吸附平衡時(shí)花色苷質(zhì)量濃度/（mg/mL）；qm為最大吸附量/（mg/g）；aL為吸附和解吸速率常數(shù)之比；KF為Freundlich常數(shù)，用于衡量吸附量大??；1/n為吸附動力學(xué)經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。

1.3.3.4 中壓-D101樹脂柱對藍(lán)莓花色苷的分離純化

將經(jīng)過預(yù)處理的D 1 0 1大孔樹脂置于中壓柱（32 mm×150 mm）內(nèi)，柱體積120.5 mL，花色苷溶液質(zhì)量濃度為0.073 mg/mL，上樣量為10 mL，分別選用不同體積分?jǐn)?shù)（20%、40%、60%、80%）乙醇溶液和不同流速（3、5、7、9 mL/min）進(jìn)行洗脫，柱壓為1.0 MPa，收集洗脫液，測定花色苷含量，計(jì)算回收率，確定最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)和最佳洗脫劑流速。

1.3.4 中壓Sephadex LH-20柱層析對藍(lán)莓花色苷的分離純化

將D101大孔樹脂純化后的花色苷溶液進(jìn)一步采用Sephadex LH-20中壓柱層析（29 mm×250 mm）分離，柱體積165.0 mL，柱壓為1.0 MPa，花色苷溶液質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，上樣量為10 mL，然后用體積分?jǐn)?shù)為20%、35%、50%的甲醇梯度洗脫，流速1.0 mL/min，每3 mL收集一管，合并相同組分，濃縮和凍干后，得到藍(lán)莓花色苷主要組分Ⅰ。利用HPLC對藍(lán)莓花色苷組分Ⅰ進(jìn)行定性和定量分析。

1.3.5 藍(lán)莓花色苷HPLC法定性和定量分析

HPLC條件：1100 C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測器：G1314A紫外檢測器；檢測波長：520 nm；柱溫：室溫；流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（30∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鹽酸溶液，配制成1 mg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，分別進(jìn)樣0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 μL，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。

樣品分析：用1%鹽酸溶液，配制成0.1 mg/mL的樣品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣量5 μL，測定花色苷組分Ⅰ含量，計(jì)算純度。

1.3.6 藍(lán)莓花色苷組分Ⅰ的結(jié)構(gòu)測定

HPLC- MS法對藍(lán)莓花色苷組分Ⅰ的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

HPLC條件：流動相：3%甲酸水溶液-水-甲醇（3∶47∶50，V/V）梯度洗脫；流速：0.8 mL/min；檢測波長：520 nm；進(jìn)樣量：5 μL。MS條件：電噴霧離子源；正離子掃描模式；掃描范圍m/z 200～1 000；干燥氣溫度350 ℃；霧化氣為氮?dú)?，流?0 L/min；檢測電壓為3.5 kV；毛細(xì)管電壓3 500 V；毛細(xì)管溫度250 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件處理，均以 ±s表示，利用方差分析（analysis of variance，ANOVA）進(jìn)行顯著性分析，其中P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂對花色苷的初步純化結(jié)果

2.1.1 大孔樹脂初步篩選

不同類型的大孔樹脂對藍(lán)莓花色苷靜態(tài)吸附及解吸能力的比較見表1。HPD-100和D101樹脂對于花色苷的吸附率及吸附量均高于其他4 種樹脂。一方面是由于HPD-100和D101是非極性樹脂，與弱極性的花色苷化學(xué)性質(zhì)相似，因此更易與花色苷結(jié)合[21]。另一方面可能是由于樹脂比表面積增加，表面張力隨之增加，有利于樹脂對花色苷的吸附[22]。此外，DA201大孔樹脂的解吸率最高（74.99%），而吸附花色苷能力最強(qiáng)的HPD-100樹脂的解吸率為71.76%，這是由于吸附能力強(qiáng)的樹脂在一定條件下，洗脫較為困難，使解吸能力下降。研究表明樹脂平均孔徑的大小也會對洗脫產(chǎn)生影響，大孔徑的樹脂有利于溶質(zhì)通過樹脂顆粒[23]，這也可能是DA201解吸率較大的原因。綜合考慮吸附和解吸兩個(gè)因素，初步篩選出吸附量大、解吸率高的HPD-100、D101和DA201 3 種大孔樹脂進(jìn)行下一步研究。

表1 大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸能力的比較Table 1 Comparison of adsorption and desorption properties of macroporous resins

2.1.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸動力學(xué)

圖1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附（a）和解吸（b）動力學(xué)曲線Fig. 1 Adsorption kinetics curves (a) and desorption kinetics curves (b)of macroporous resins

HPD-100、D101、DA201 3 種大孔樹脂對藍(lán)莓花色苷的靜態(tài)吸附與解吸動力學(xué)測定結(jié)果見圖1。3 種樹脂對藍(lán)莓花色苷的吸附行為均為快速平衡型。在0～50 min時(shí)間范圍內(nèi)，3 種樹脂對藍(lán)莓花色苷的吸附量增加較為迅速。隨著時(shí)間的延長，樹脂對花色苷的吸附逐漸達(dá)到飽和，在270 min達(dá)到平衡，此時(shí)HPD-100、D101與DA201樹脂對花色苷的吸附量分別為6.203、6.084 mg/g和5.461 mg/g。選擇吸附量較大的HPD-100和D101進(jìn)行靜態(tài)解吸動力學(xué)研究。

由圖1b可以看出，在0～90 min階段，HPD-100和D101樹脂解吸均較為迅速，90 min之后解吸逐漸達(dá)到平衡。HPD-100與D101吸附樹脂分別在150 min和120 min達(dá)到解吸平衡，此時(shí)的解吸量分別為4.406 mg/g和4.686 mg/g。由于D101樹脂解吸平衡時(shí)間較短且最大解吸量相對較大，因此確定D101大孔樹脂為純化藍(lán)莓花色苷的最佳樹脂。

2.1.3 D101大孔樹脂吸附等溫線

圖2 D101樹脂在不同溫度下的吸附等溫線Fig. 2 Adsorption isotherms of D101 resin at different temperatures

不同溫度下D101大孔樹脂對藍(lán)莓花色苷的吸附等溫線如圖2所示。結(jié)果表明，D101樹脂對于藍(lán)莓花色苷的吸附能力隨花色苷起始質(zhì)量濃度的增加而增大，并在花色苷的起始質(zhì)量濃度為0.073 mg/mL時(shí)基本達(dá)到飽和。這一結(jié)果為后續(xù)中壓柱層析分離純化花色苷粗提物提供合適的上樣質(zhì)量濃度。此外，由圖2可以看出，在任何平衡質(zhì)量濃度下，D101大孔樹脂對花色苷的吸附量均隨著溫度的升高而逐漸減小，這可能是由于大孔樹脂吸附主要是物理吸附，且吸附過程是一個(gè)放熱過程，所以較高的溫度會抑制花色苷與樹脂表面活性位點(diǎn)的結(jié)合[24]。因此，確定D101大孔樹脂對花色苷的最佳吸附溫度為25 ℃。

表2 Langmuir方程和Freundlich方程回歸參數(shù)Table 2 Regression parameters of Langmuir and Freundlich isothermal equations

Langmuir方程和Freundlich方程常被用于揭示樹脂的線性擬合，以及描述樹脂之間如何相互作用。Langmuir方程曲線通常描述單分子層吸附，相鄰吸附分子之間均勻分布且無相互作用，而Freundlich方程曲線為經(jīng)驗(yàn)公式，通常被用于描述在一定溶質(zhì)濃度范圍內(nèi)的多分子層吸附[25]。Langmuir和Freundlich方程參數(shù)列于表2。Langmuir方程和Freundlich方程的決定系數(shù)（R2）均較高，其中Langmuir方程的R2小于Freundlich的，證明該吸附過程為多分子層吸附。并且25 ℃時(shí)Freundlich方程中的1/n值小于1，表明D101樹脂與藍(lán)莓花色苷之間容易發(fā)生吸附[26]。

2.1.4 動態(tài)解吸洗脫劑體積分?jǐn)?shù)和洗脫流速的選擇

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)（a）和洗脫流速（b）對花色苷回收率的影響Fig. 3 Effect of ethanol concentration (a) and elution fl ow rate (b) on the recovery rate of anthocyanins

不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇及洗脫流速對藍(lán)莓花色苷回收率的影響見圖3。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，花色苷回收率也隨之增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，花色苷回收率達(dá)到95.91%。考慮到若繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，過多的雜質(zhì)可能會溶出，影響花色苷的純度，所以本實(shí)驗(yàn)選擇體積分?jǐn)?shù)80%乙醇作為洗脫劑。由圖3b可以看出，隨著洗脫劑洗脫流速的增加，花色苷回收率明顯降低，可能是流速過快，洗脫劑不能與被吸附的花色苷充分作用而將其從樹脂上洗脫下來。當(dāng)洗脫流速分別為3 mL/min和5 mL/min時(shí)，花色苷的回收率相差不大，綜合考慮純化效率及生產(chǎn)效率，本實(shí)驗(yàn)選擇5 mL/min為洗脫流速，此時(shí)藍(lán)莓花色苷的回收率達(dá)到95.91%。

2.2 花色苷組分及含量

經(jīng)D101大孔樹脂在最佳條件下分離純化后，藍(lán)莓花色苷純度從5.53%增加到75.58%，提高了12.67倍，樣品進(jìn)一步經(jīng)Sephadex LH-20中壓柱層析純化后得到藍(lán)莓花色苷的主要組分Ⅰ。矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品與組分Ⅰ的HPLC譜圖見圖4。

圖4 矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（a）和花色苷組分Ⅰ（b）的HPLC譜圖Fig. 4 HPLC chromatograms of standard cyanidin-3-O-glucoside (a)and anthocyanin fraction Ⅰ (b)

由圖4可以看出，藍(lán)莓花色苷組分Ⅰ的保留時(shí)間為10.392 min，矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為10.074 min，標(biāo)準(zhǔn)品與樣品保留時(shí)間近似，所以初步判定組分Ⅰ為矢車菊-3-O-葡萄糖苷。利用HPLC分析，得到標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y＝3 794.1X+0.579 2（R2＝0.999 3），線性范圍為0.1～1.0 μg，根據(jù)回歸方程計(jì)算得到Sephadex LH-20純化后得到的花色苷組分Ⅰ的純度為90.88%。

2.3 花色苷的結(jié)構(gòu)

圖5 矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（a）和花色苷組分Ⅰ（b）的MS譜圖Fig. 5 Mass spectra of standard cyanidin-3-O-glucoside (a) and anthocyanin fraction I (b)

矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品與花色苷組分Ⅰ的質(zhì)譜圖見圖5。在正離子模式下，花色苷組分Ⅰ的分子離子峰為449.1與矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品分子離子峰449.0一致，并且樣品與標(biāo)準(zhǔn)品中分別含有離子碎片m/z 340.4和m/z 340.3，是由矢車菊-3-O-葡萄糖苷（m/z 449.0）失去一分子鄰苯二酚（Δ m/z 109）所形成的。參考相關(guān)文獻(xiàn)[27-29]中的數(shù)據(jù)資料，并結(jié)合HPLC的保留時(shí)間結(jié)果可以推斷，藍(lán)莓花色苷組分Ⅰ是矢車菊-3-O-葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)如圖6所示。

圖6 矢車菊-3-O-葡萄糖苷結(jié)構(gòu)Fig. 6 Chemical structure of cyanidin-3-O-glucoside

3 結(jié) 論

研究表明D101大孔樹脂是最適于分離純化藍(lán)莓花色苷的樹脂。不同溫度下，花色苷在D101樹脂上的吸附行為均可以用Langmuir和Freundlich方程很好地?cái)M合，并且D101樹脂在25 ℃時(shí)對花色苷的分離純化效果最好。大孔樹脂中壓柱層析法最佳工藝條件為：25 ℃、上樣液質(zhì)量濃度0.073 mg/mL、洗脫劑為80%乙醇、流速5 mL/min。藍(lán)莓花色苷粗提物經(jīng)大孔樹脂與Sephadex LH-20中壓柱層析聯(lián)用分離純化后，得到矢車菊-3-O-葡萄糖苷，純度為90.88%。因此，中壓柱層析聯(lián)用可以有效分離純化藍(lán)莓花色苷，本研究結(jié)果可以為藍(lán)莓及其他小漿果花色苷工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

[1] PERTUZATTI P B, BARCIA M T, REBELLO L P G, et al.Antimicrobial activity and differentiation of anthocyanin profiles of rabbiteye and highbush blueberries using HPLC-DAD-ESI-MSnand multivariate analysis[J]. Journal of Functional Foods, 2016, 26:506-516. DOI:10.1016/j.jff.2016.07.026.

[2] ZHAO L Y, CHEN J, WANG Z Q, et al. Direct acylation of cyanidin-3-glucoside with lauric acidin blueberry and its stability analysis[J].International Journal of Food Properties, 2016, 19(1): 1-12. DOI:10.10 80/10942912.2015.1016577.

[3] LEE S G, VANCE T M, NAM T G, et al. Contribution of anthocyanin composition to total antioxidant capacity of berries[J]. Plant Foods for Human Nutrition, 2015, 70: 427-432. DOI:10.1007/s11130-015-0514-5.

[4] BARNES J S, NGUYEN H P, SHEN S, et al. General method for extraction of blueberry anthocyanins and identification using high performance liquid chromatography-electrospray ionization-ion traptime of flight-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A,2009, 1216(23): 4728-4735. DOI:10.1016/j.chroma.2009.04.032.

[5] LIU Yixiang, SONG Xue, HAN Yong, et al. Identification of anthocyanin components of wild Chinese blueberries and amelioration of light-induced retinal damage in pigmented rabbit using whole berries[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(1):356-363. DOI:10.1021/jf103852s.

[6] FU Y, ZHOU X Z, CHEN S G, et al. Chemical composition and antioxidant activity of Chinese wild raspberry (Rubus hirsutus Thunb.)[J].LWT-Food Science and Technology, 2015, 60: 1262-1268.DOI:10.1016/j.lwt.2014.09.002.

[7] HE B, ZHANG L L, YUE X Y, et al. Optimization of ultrasoundassisted extraction of phenolic compounds and anthocyanins from blueberry (Vaccinium ashei) wine pomace[J]. Food Chemistry, 2016,204: 70-76. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.02.094.

[8] MAGDALENA Z, ANNA M. Microwave-assisted drying of blueberry(Vaccinium corymbosum L.) fruits: drying kinetics, polyphenols,anthocyanins, antioxidant capacity, colour and texture[J]. Food Chemistry, 2016, 212: 671-680. DOI:10.1016/j.foofchem.2016.06.003.

[9] BYAMUKAMA R, KIREMIRE B T, ANDERSEN O M, et al.Anthocyanins from fruits of Rubus pinnatus and Rubusrigidus[J].Journal of Food Composition and Analysis, 2005, 18(6): 599-605.DOI:10.1016/j.jfca.2004.04.007.

[10] ANOCOS B, GONZALEZ E, CANO M P. Differentiation of raspberry varieties according to anthocyanin composition[J]. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung, 1999, 208(1): 33-38.

[11] CAO S Q, PAN S Y, YAO X L, et al. Isolation and purification of anthocyanins from blood oranges by columnchromatography[J].Agricultural Sciences in China, 2010, 9(2): 207-215. DOI:10.1016/S1671-2927(09)60085-7.

[12] CHEN Y, ZHANG W J, ZHAO T, et al. Absorption properties of macroporous absorbent resins for separation of anthocyanins from mulberry[J]. Food Chemistry, 2016, 194: 712-722. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.08.084.

[13] YANG Y, YUAN X H, XU Y Q, et al. Purif i cation of anthocyanins from extracts of red raspberry using macroporous resin[J].International Journal of Food Properties, 2015, 18(5): 1046-1058.DOI:10.1080/10942912.2013.862632.

[14] XU Y Q, LIU G J, YU Z Y, et al. Purification, characterization and antiglycation activity of a novel polysaccharide from black currant[J]. Food Chemistry, 2016, 199: 694-701. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.12.078.

[15] XI L S, MU T H, SUN H N. Preparative purif i cation of polyphenols from sweet potato (Ipomoea batatas L.) leaves by AB-8 macroporous resins[J]. Food Chemistry, 2015, 172: 166-174. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.09.039.

[16] ZHENG X Z, ZHANG Z G, JIN C J, et al. Purification characteristics and parameters optimization of anthocyanin extracted from blueberry[J]. International Journal of Agricultural and Biological Engineering, 2015, 8(2): 135-144. DOI:10.3965/j.ijabe.20150802.1407.

[17] 鄭紅巖, 于華忠, 劉建蘭, 等. 大孔吸附樹脂對藍(lán)莓花色苷的分離工藝[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2014, 34(4): 59-65. DOI:10.3969/j.issn.0253-2417.2014.04.010.

[18] FIGUEIREDO P, ELHABIRI M, SAITO N, et al. Anthocyanin intramolecular interactions. a new mathematical approach to account for the remarkable colorant properties of the pigments extracted from Matthiola incana[J]. Journal of the American Chemical Society, 1996,118(20): 4788-4793.

[19] 趙晟鋅, 徐雅琴, 李興國. 大孔吸附樹脂純化黑穗醋栗花色苷研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 41(8): 115-120.

[20] CHEN Y Y, ZHANG D J. Adsorption kinetics, isotherm and thermodynamics studies of flavones from Vaccinium Bracteatum Thunb leaves on NKA-2 resin[J]. Chemical Engineering Journal, 2014,254: 579-585. DOI:10.1016/j.cej.2014.05.120.

[21] ZHAO Z Y, DONG L L, WU Y L, et al. Preliminary separation and purification of rutin and quercetin from Euonymus alatus (Thunb.)Siebold extracts by macroporous resins[J]. Food and Bioproducts Processing, 2011, 89(4): 266-272. DOI:10.1016/j.fbp.2010.11.001.

[22] 楊昱, 徐雅琴, 于澤源. 樹莓葉片黃酮成分分離純化研究[J]. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào), 2011, 25(6): 948-954.

[23] TIOMTHY J B, AMANDEEP K S, LI Z, et al. Adsorption/desorption characteristics and separation of anthocyanins and polyphenols from blueberries using macroporous adsorbent resins[J].Journal of Food Engineering, 2014, 128: 167-173. DOI:10.1016/j.foodeng.2013.12.029.

[24] WU Y F, ZHANG L, MAO J W, et al. Kinetic and thermodynamic studies of sulforaphane adsorption on macroporous resin[J].Journal of Chromatography B, 2016, 1028: 231-236. DOI:10.1016/j.jchromb.2016.06.035.

[25] YANG C J, LI D X, WAN C X. Combination of HSCCC and Sephadex LH-20 methods an approach to isolation and purif i cation of the main individual theaf l avins from black tea[J]. Journal of Chromatography B,2008, 861: 140-144. DOI:10.1016/j.jchromb.2007.11.022.

[26] YANG Q Y, ZHAO M M, LIN L Z. Adsorption and desorption characteristics of adlay bran free phenolics on macroporous resins[J]. Food Chemistry, 2016, 194: 900-907. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.08.070.

[27] BOCHI V C, GODOY H T, GIUSTI M M. Anthocyanin and other phenolic compounds in Ceylon gooseberry (Dovyalis hebecarpa)fruits[J]. Food Chemistry, 2015, 176: 234-243. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.12.041.

[28] 胡濟(jì)美, 籍保平, 周峰, 等. 大興安嶺篤斯越橘花色苷成分鑒定研究[J].食品科學(xué), 2009, 30(10): 239-241.

[29] LI D N, MENG X J, LI B. Prof i ling of anthocyanins from blueberries produced in China using HPLC-DAD-MS and exploratory analysis by principal component analysis[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2016, 47: 1-7. DOI:10.1016/j.jfca.2015.09.005.

Isolation and Purif i cation of Anthocyanin from Blueberry by Sequential Medium Pressure Column Chromatography on Macroporous Resin and Sephadex LH-20

YU Zeyuan1, ZHAO Jianhui1, LI Xingguo1, XU Yaqin2, TANG Xue1, YANG Yu2,*
(1. College of Horticulture and Landscape Architecture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2. College of Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In this study, the anthocyanins of blueberry were isolated and purif i ed by sequential medium pressure column chromatography using macroporous resin and Sephadex LH-20. The static adsorption and desorption of blueberry anthocyanins on six different types of resins was compared, and the separation process of anthocyanins by macroporous resin adsorption chromatography was optimized. The results showed that D101 resin gave the best separation eff i ciency and its adsorption behavior obeyed a multi-molecular layer adsorption. Under the following conditions: column pressure 1 MPa,temperature 25 ℃, anthocyanins concentration 0.073 mg/mL, and elution with 80% ethanol at a fl ow rate of 5 mL/min,the purity of anthocyanins increased by 13.67 folds from 5.53% to 75.58%. A purif i ed anthocyanin fraction was obtained by subsequent Sephadex LH-20 column chromatography, which was identified as cyanidin-3-O-glucoside using highperformance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry (HPLC-ESI-MS) with a purity of 90.88%.

blueberry; medium pressure column chromatography; anthocyanins; macroporous resin

10.7506/spkx1002-6630-201801018

TS201.1

A

1002-6630（2018）01-0118-06

于澤源, 趙劍輝, 李興國, 等. 大孔樹脂-中壓柱層析聯(lián)用分離純化藍(lán)莓花色苷[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(1): 118-123.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801018. http://www.spkx.net.cn

YU Zeyuan, ZHAO Jianhui, LI Xingguo, et al. Isolation and purification of anthocyanin from blueberry by sequential medium pressure column chromatography on macroporous resin and sephadex LH-20[J]. Food Science, 2018, 39(1):118-123. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801018. http://www.spkx.net.cn

2016-10-11

黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（C2016015）

于澤源（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取及活性。E-mail：yzy@neau.edu.cn

*通信作者簡介：楊昱（1977—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取及活性。E-mail：yangyu_002@163.com