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    表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過NF-κB通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化

    2018-01-08 02:47:23王樂鋒張妍淞湯小芳張賢益廖金珠王富龍李文娟
    食品科學(xué) 2018年1期
    關(guān)鍵詞:抗炎極化腹腔

    吳 瓊,王樂鋒,張妍淞,湯小芳,張賢益,李 露,舒 瑤,黃 成,廖金珠,王富龍,李文娟,*

    (1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006;2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

    表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過NF-κB通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化

    吳 瓊1,王樂鋒1,張妍淞2,湯小芳2,張賢益2,李 露2,舒 瑤2,黃 成2,廖金珠2,王富龍2,李文娟2,*

    (1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006;2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

    目的:研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate,EGCG)的抗炎作用及其對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。方法:原代培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,通過對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行不同的處理,將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS,1 μg/mL)組、EGCG(25 μmol/L)組和EGCG+LPS(25 μmol/L+1 μg/mL)組;流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬活性、活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量和細(xì)胞凋亡情況,噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;Griess法測(cè)定NO的含量;酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)含量,Western blot檢測(cè)Toll-樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)p65蛋白表達(dá)量。結(jié)果:EGCG和/或LPS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖和凋亡無顯著影響;與LPS組相比,EGCG可以極顯著抑制LPS刺激腹腔巨噬細(xì)胞中ROS、NO、TNF-α、IL-1β增加(P<0.01),提示EGCG可抑制巨噬細(xì)胞向M1表型極化,具有抗炎作用;與LPS組相比,EGCG+LPS組中巨噬細(xì)胞TLR4和細(xì)胞核蛋白中NF-κB p65表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。結(jié)論:EGCG對(duì)LPS致炎的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞具有抗炎作用,其作用機(jī)制可能與其阻斷TLR4受體介導(dǎo)的NF-κB通路活化,抑制巨噬細(xì)胞向M1表型極化有關(guān)。

    表沒食子兒茶素沒食子酸酯;抗炎作用;細(xì)胞表型;NF-κB通路;巨噬細(xì)胞極化

    炎癥是機(jī)體重要的免疫學(xué)反應(yīng):一方面炎癥反應(yīng)是宿主防御的主要過程,是人體健康必不可少的生理反應(yīng);另一方面炎癥反應(yīng)持久、異??梢鸲喾N疾病,包括促進(jìn)腫瘤的形成[1-3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate,EGCG)是從茶葉中提取的多酚類物質(zhì),是茶葉的主要活性成分,實(shí)驗(yàn)證實(shí)EGCG能緩解巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng),具有抗炎作用[4-5]。Seong等[6]通過一次性大劑量注射脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)建立小鼠炎癥模型,證實(shí)EGCG可通過下調(diào)Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)發(fā)揮抗炎作用。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞,在炎癥反應(yīng)中起著舉足輕重的作用。在炎癥反應(yīng)的進(jìn)程中,巨噬細(xì)胞極化表現(xiàn)出不同的細(xì)胞表型,從而發(fā)揮不同的免疫功能。根據(jù)細(xì)胞極化方式的不同,可將巨噬細(xì)胞表型分為M1型和M2型[7-8]。生理?xiàng)l件下,巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)是連續(xù)的,M1和M2型巨噬細(xì)胞是這一系列連續(xù)狀態(tài)的兩個(gè)極端,分別發(fā)揮不同的促炎和抗炎作用[9-10]。近年來,巨噬細(xì)胞極化在抗炎作用研究中越來越受到關(guān)注,但在EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞極化調(diào)控的研究頗少,尤其在信號(hào)通路機(jī)制研究中鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬在前期的研究基礎(chǔ)上,原代培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞,通過LPS刺激巨噬細(xì)胞模擬炎癥模型,檢測(cè)EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性功能(M1型炎癥相關(guān)參數(shù),包括小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、NO、活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量和吞噬活性)及細(xì)胞表面受體TLR4和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路的影響,研究EGCG的抗炎作用,繼而確定EGCG對(duì)的巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用,為研究EGCG抗炎分子機(jī)制提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物、材料與試劑

    ALB/c小鼠雌雄不限(生產(chǎn)許可證:SCXK(湘)2013-0004),7~8 周齡,體質(zhì)量(22±2)g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,飼養(yǎng)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)科部(使用許可證:SCXK(贛)2015-0001)。

    DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Thermo公司;EGCG、噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)、胎牛血清、LPS 美國(guó)Sigma公司;2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2’,7’-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA) 美國(guó)Molecular Probes公司;細(xì)胞凋亡試劑盒 美國(guó)BD公司;線粒體琥珀酸脫氫酶試劑盒 南京建成生物工程研究所;BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑、NO試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所;細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司;兔單克隆NF-κB抗體 美國(guó)Cell Signaling公司;小鼠單克隆TLR4抗體 美國(guó)Abcam公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Varioskan Flash E33全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Electron公司;TDL-5-A大容量低速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;SHP-150生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀美國(guó)Becton Dickinson公司;MS 3 basic旋渦混勻器德國(guó)IKA公司。

    1.3 方法

    1.3.1 原代培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞

    [11]原代培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。頸椎脫臼處死小鼠,碘伏浸泡5 min,醫(yī)用酒精脫碘3 min,置于彎盤中,腹腔注射磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),腹部輕揉2 min,收集腹腔液置于離心管中,1 000×g離心8 min,收集細(xì)胞沉淀并重懸,臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞大于95%,用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度,分別接種于96 孔培養(yǎng)板和6 孔培養(yǎng)板中,置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后,差速貼壁去除未貼壁細(xì)胞,最后收集得到純化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

    1.3.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥模型的建立與分組

    將原代培養(yǎng)腹腔巨細(xì)胞隨機(jī)分為4 組,每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組:腹腔巨噬細(xì)胞中給予相同體積的培養(yǎng)基;LPS組:腹腔巨噬細(xì)胞中給予1 μg/mL LPS刺激24 h;EGCG+LPS組:結(jié)合文獻(xiàn)[12-13],EGCG劑量選擇25 μmol/L預(yù)處理腹腔巨噬細(xì)胞24 h后,加入1 μg/mL LPS刺激24 h,全程給予EGCG;EGCG組:25 μmol/L EGCG預(yù)處理腹腔巨噬細(xì)胞48 h。

    1.3.3 細(xì)胞增殖情況的測(cè)定

    將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(1.5×104個(gè)/孔)180 μL接種于96 孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,每孔加入20 μL MTT(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,輕輕傾凈96 孔培養(yǎng)板中微孔內(nèi)的液體,然后每孔加入150 μL二甲基亞砜,終止反應(yīng),用振蕩儀振蕩10 min后,待MTT的紫色還原產(chǎn)物完全溶解。最后應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A),細(xì)胞增殖情況以A表示,A越大代表其增殖越多。

    1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

    收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,將細(xì)胞懸液(約2×106個(gè)/mL)于3 000 r/min離心10 min,PBS洗2 次,500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞,加入Annexin-V和PI各5 μL,避光反應(yīng)5 min后,立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞染色情況(一般不超過1 h),早期凋亡細(xì)胞為Annexin(+)/P1(-),壞死或凋亡晚期的繼發(fā)壞死細(xì)胞為Annexin(+)/P1(+),正常活細(xì)胞為Annexin(-)/P(-)。同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為裸細(xì)胞,用于設(shè)定流式檢測(cè)條件。

    1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量

    收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,將細(xì)胞懸液(約2×106個(gè)/mL)于3 000 r/min離心10 min,PBS洗2次,將配好的DCFHDA溶液(20 μmol/L)0.5 mL重懸細(xì)胞,37 ℃孵育20 min,3 000 r/min離心3 min,棄上清液,PBS洗2 次,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度,以DCF的熒光強(qiáng)度來表示細(xì)胞內(nèi)ROS的含量,熒光強(qiáng)度越強(qiáng)表明ROS含量越高。

    1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬活性

    收集腹腔巨噬細(xì)胞,將細(xì)胞懸液(約2×106個(gè)/mL)于3 000 r/min離心10 min,PBS洗2 次,加入熒光標(biāo)記FITC-Dextran(5 mg/mL)2 μL,細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。3 000 r/min離心3 min,PBS洗滌細(xì)胞2 次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)FITC-Dextran的熒光強(qiáng)度,以此反映細(xì)胞的吞噬功能,熒光強(qiáng)度越強(qiáng)表明其吞噬活性越高。

    1.3.7 NO含量的測(cè)定

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按組分別收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液,根據(jù)Griess法測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣本中NO含量,具體操作方法參照NO試劑盒說明書。

    1.3.8 細(xì)胞因子含量的測(cè)定

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按組分別收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液,根據(jù)試劑盒說明書,采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)含量。最后采用多功能酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),A292nm為縱坐標(biāo))計(jì)算出實(shí)驗(yàn)樣本中細(xì)胞因子含量。

    1.3.9 TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)量的測(cè)定

    將2.5 mL小鼠腹腔巨噬細(xì)胞接種到6 孔培養(yǎng)板中(2×106個(gè)/孔)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,PBS沖洗兩遍,加入細(xì)胞裂解液,采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白。收集細(xì)胞蛋白,BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度,等量蛋白上樣,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)(50 V電壓,30 min;100 V電壓,55 min),半干轉(zhuǎn)PVDF膜,封閉2 h、一抗過夜、HRP標(biāo)記二抗2 h。ECL化學(xué)發(fā)光顯色反應(yīng),應(yīng)用全能型凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 ±s表示,采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn),P<0.05為差異有顯著性意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響

    表1 EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of EGCG and/or LPS on the proliferation of mouse peritoneal macrophages

    如表1顯示,巨噬細(xì)胞經(jīng)EGCG預(yù)處理后,EGCG組與對(duì)照組相比無顯著差異。與對(duì)照組相比,LPS組和EGCG+LPS組中腹腔巨噬細(xì)胞有輕微的增殖,但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均無顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果提示,本實(shí)驗(yàn)中EGCG(25 μmol/L)、LPS(1 μg/mL)、EGCG+LPS對(duì)巨噬細(xì)胞增殖無明顯影響。

    2.2 EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞凋亡率的影響

    圖1 EGCG和/或LPS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡的影響Fig. 1 Effect of EGCG and/or LPS on apoptosis in mouse peritoneal macrophages

    細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的正常生理現(xiàn)象,巨噬細(xì)胞凋亡具有自身的特點(diǎn),既可調(diào)控自身的細(xì)胞功能,又可介導(dǎo)非己細(xì)胞的細(xì)胞凋亡[14]。由圖1可知,在EGCG、LPS、EGCG+LPS給予巨噬細(xì)胞處理后,實(shí)驗(yàn)組中腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比,均處于一個(gè)較低的水平,各組之間無顯著性差異(P>0.05)。說明本實(shí)驗(yàn)中EGCG和/或LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的正常凋亡無明顯影響。

    2.3 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬的影響

    巨噬細(xì)胞通過熒光探針FITC-Dextran標(biāo)記后,上樣于流式細(xì)胞儀,檢測(cè)Dextran的熒光強(qiáng)度。Dextran的熒光強(qiáng)度可反應(yīng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性,熒光強(qiáng)度越強(qiáng),巨噬細(xì)胞吞噬活性越高。吞噬結(jié)果如圖2所示,在LPS(1 μg/mL)的作用下,與對(duì)照組相比,腹腔巨噬細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度從40.58±8.53升高到215.80±38.28,腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能極顯著增加(P<0.01)。在EGCG(25 μmol/L)預(yù)處理后加入LPS(1 μg/mL)刺激,與LPS(1 μg/mL)組相比,腹腔巨噬細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度從215.80±38.28下降到90.16±13.32,差異極顯著(P<0.01),即EGCG能顯著抑制LPS(1 μg/mL)激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

    圖2 EGCG對(duì)LPS處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬的影響Fig. 2 Effect of EGCG on phagocytosis of mouse peritoneal macrophages

    2.4 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ROS含量的影響

    圖3 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ROS含量的影響Fig. 3 Effect of EGCG on the generation of ROS in mouse peritoneal macrophages

    由圖3可知,1 μg/mL LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能使細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著上升,與對(duì)照組相比有明顯差異(P<0.01)。對(duì)照組熒光強(qiáng)度為8.79±1.41,LPS(1 μg/mL)的刺激后明顯升高到106.98±17.27。在EGCG(25 μmol/L)預(yù)處理后加入LPS(1 μg/mL)刺激,與LPS組相比,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯降低(P<0.01),DCF熒光強(qiáng)度為10.68±2.59。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EGCG能極顯著降低LPS刺激活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS。

    2.5 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NO、細(xì)胞因子含量的影響

    表2 EGCG對(duì)LPS處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NO 、IL-1β和TNF-α含量的影響Table 2 Effect of EGCG on the production of NO, IL-1βand TNF-α in mouse peritoneal macrophages

    由表2可以看出,對(duì)照組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放的NO含量很少;LPS(1 μg/mL)刺激24 h能促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO,與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P<0.01);若先用EGCG(25 μmol/L)預(yù)處理24 h,再加入LPS刺激24 h,則NO的產(chǎn)生量受到明顯抑制,與LPS組相比具有極顯著差異(P<0.01)。

    實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞中釋放細(xì)胞因子TNF-α、1L-1β的量,結(jié)果如表2所示,與對(duì)照組相比,在LPS 組中,TNF-α由(513.53±68.97)ng/mL升高到(3 150.13±319.82)ng/mL,有極顯著差異(P<0.01);IL-1β含量由(38.62±14.48)pg/mL升高到(292.77±58.14)pg/mL,有極顯著差異(P<0.01),故LPS(1 μg/mL)能顯著地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、1L-1β。在EGCG(25 μmol/L)預(yù)處理后加入LPS(1 μg/mL)刺激,與LPS組相比,TNF-α由(3 150.13±319.82)ng/mL下降到(1 874.93±122.75) ng/mL,有極顯著差異(P<0.01);IL-1β由(292.77±58.14)pg/mL下降到(225.58±34.07)pg/mL,有顯著差異(P<0.01)。故EGCG能抑制經(jīng)LPS激活巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β的水平。

    2.6 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TLR4表達(dá)的影響

    免疫的發(fā)生及其調(diào)控涉及復(fù)雜的免疫識(shí)別機(jī)制,依賴于種系編碼的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)。TLR4是巨噬細(xì)胞表面重要PRRs,可識(shí)別并結(jié)合EGCG,觸發(fā)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)控免疫基因表達(dá),執(zhí)行免疫調(diào)控功能。此外,LPS是巨噬細(xì)胞TLR4中的主要配體,可與TLR4結(jié)合[15-16]。由圖4的Western blot結(jié)果可知,在腹腔巨噬細(xì)胞未接受任何處理的對(duì)照組中,TLR4蛋白表達(dá)在一個(gè)較低的水平;與對(duì)照組相比,LPS組中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TLR4的表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)。與LPS組相比,EGCG+LPS組中TLR4的蛋白表達(dá)極顯著下降(P<0.01)。與此同時(shí)EGCG單獨(dú)處理巨噬細(xì)胞后,與對(duì)照組比較,巨噬細(xì)胞中TLR4的表達(dá)無明顯變化。這些結(jié)果表明EGCG的抗炎作用與細(xì)胞表面受體對(duì)TLR4的調(diào)節(jié)有關(guān)。

    圖4 EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of EGCG on the expression of TLR4 in LPS-stimulated macrophages

    2.7 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NF-κB p65表達(dá)的影響

    圖5 EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of EGCG on the expression of NF-κB p65 in LPS-stimulated macrophages

    NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在巨噬細(xì)胞的炎癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的信號(hào)級(jí)聯(lián)作用。LPS與TLR4結(jié)合后,激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)炎癥因子的釋放,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[17]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,與對(duì)照組相比,LPS組中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞核蛋白中NF-κB p65表達(dá)量顯著增加;LPS處理巨噬細(xì)胞前,加入EGCG預(yù)處理24 h,極顯著降低LPS介導(dǎo)的NF-κB p65蛋白表達(dá)的上調(diào)(P<0.01)。與此同時(shí)EGCG單獨(dú)處理巨噬細(xì)胞后,與對(duì)照組比較,巨噬細(xì)胞中NF-κB p65蛋白的表達(dá)無顯著變化。這說明EGCG抑制LPS介導(dǎo)的炎癥,與可通過抑制NF-κB通路的激活有關(guān)。

    3 討 論

    巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,具有很強(qiáng)的可塑性,在炎癥反應(yīng)和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。M1型巨噬細(xì)胞主要通過分泌TNF-α、1L-1β和NO等,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[18-19]。LPS炎癥模型是最常見的炎癥模型,其誘炎機(jī)理為L(zhǎng)PS與細(xì)胞表面的CD14結(jié)合,然后再結(jié)合TLR4復(fù)合物,激活腫瘤壞死受體相關(guān)因子6,進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活激酶1,然后使NF-κB抑制性蛋白(NF-kappa B inhibitor,IκB)激酶磷酸化,導(dǎo)致IκB降解,使NF-κB信號(hào)通路激活,促進(jìn)炎癥因子釋放,同時(shí)啟動(dòng)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶轉(zhuǎn)錄,釋放NO,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化[20-21]。本實(shí)驗(yàn)通過原代培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,應(yīng)用LPS刺激巨噬細(xì)胞建立炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)P?。通過檢測(cè)不同組別中巨噬細(xì)胞的NO、TNF-α、IL-1β含量及NF-κB p65蛋白表達(dá)量來說明EGCG對(duì)LPS致炎的巨噬細(xì)胞的抗炎作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,LPS組中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、1L-1β和NO水平增加,NF-κB p65蛋白表達(dá)量增加,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M1型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,與LPS組相比,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)EGCG預(yù)處理后,TNF-α、1L-1β、NO的水平顯著下降。表明EGCG可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化。

    研究證實(shí),當(dāng)巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞被激活后,細(xì)胞內(nèi)的各種氧化酶的表達(dá)水平增加,釋放大量的ROS來清除壞死的細(xì)胞。持久且異常的炎癥過程中ROS可以在細(xì)胞間充當(dāng)?shù)诙攀梗軌蛲ㄟ^趨化因子的表達(dá),增加炎性細(xì)胞黏附,是炎癥反應(yīng)表現(xiàn)出級(jí)聯(lián)效應(yīng),機(jī)體原有的抗氧化-氧化平衡被打破,生成過量的ROS作用于生物大分子造成細(xì)胞和組織損傷[22-23]。LPS作為一個(gè)革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分,是免疫反應(yīng)中的促炎刺激物,在進(jìn)入細(xì)胞后能在增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能力和ROS的生成。本實(shí)驗(yàn)中,LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能使細(xì)胞吞噬能力和ROS的水平與對(duì)照組相比顯著上升。EGCG可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化的同時(shí)也抑制了巨噬細(xì)胞的吞噬活性和ROS的生成。

    NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子,化學(xué)本質(zhì)是由多肽亞單位組成的蛋白質(zhì)家族,包括NF-κB2(p52)、p65(RelA)、NF-κB1(p50)、cRel、RelB 5 個(gè)成員,存在于真核生物中[24-26]。5 個(gè)家族成員的共同點(diǎn)是氨基末端有由近300 個(gè)氨基酸組成的保守區(qū)域(Rel同源區(qū),RHD)。RHD里的功能區(qū)能夠通過二聚化、與DNA結(jié)合等方式,調(diào)控靶基因的表達(dá)。抑制狀態(tài)的NF-κB滯留在細(xì)胞質(zhì)中。在哺乳動(dòng)物中,IκB家族有8 個(gè)成員IκBa、IκBy、IκBP、BcL-3、IκBe、IicB-R、pl00、pl05[27-28]。NF-κB信號(hào)通路的激活有兩條途徑——經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。其中經(jīng)典途徑指的是NF-κB信號(hào)通路被大量的細(xì)胞因子等迅速激活,這種激活主要依賴由IκB激酶(IκB kinase,IKK)誘導(dǎo)的IκB的降解。當(dāng)IKK激活后,可以使IκB特定位點(diǎn)發(fā)生降解,進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路。當(dāng)NF-κB被激活后,NF-κB能和STAT1信號(hào)通路等共同作用,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化,然后促進(jìn)促炎因子的釋放,出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[29-30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGCG可通過抑制NF-κB信號(hào)通路的活化抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥。炎癥的發(fā)生及其調(diào)控涉及復(fù)雜的免疫識(shí)別機(jī)制,依賴于種系編碼的PRRs。TLR受體家族是生物致炎因素的主要受體,主要表達(dá)在固有免疫細(xì)胞表面,能與各種細(xì)菌或病毒的分解產(chǎn)物結(jié)合。TLR4是LPS的主要受體,LPS配體與TLR4受體結(jié)合后,可通過激活NF-κB促進(jìn)細(xì)胞因子等的釋放,從而發(fā)生炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS組中NF-κB信號(hào)通路活化的同時(shí),TLR4的蛋白表達(dá)量增加。EGCG預(yù)處理后,可顯著抑制LPS介導(dǎo)TLR4蛋白的增加和NF-κB信號(hào)通路的活化。

    總之,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGCG具有抗炎作用,EGCG預(yù)處理LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,可抑制小鼠巨噬細(xì)胞中M1型相關(guān)炎癥參數(shù)的增加;提示EGCG的抗炎作用可通過競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合TLR4受體阻斷NF-κB通路,繼而抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化。

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    EGCG Inhibits LPS-Caused Polarization of Macrophages into M1 Phenotype via the NF-κB Pathway

    WU Qiong1, WANG Lefeng1, ZHANG Yansong2, TANG Xiaofang2, ZHANG Xianyi2, LI Lu2, SHU Yao2, HUANG Cheng2,LIAO Jinzhu2, WANG Fulong2, LI Wenjuan2,*
    (1. The Second Aff i liated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China;2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

    Objective: The aim of this study was to explore the anti-inf l ammatory effect of (-)-epigallocatechin gallate (EGCG)and its effects on macrophage polarization. Methods: Primary cultures of mouse peritoneal macrophages were divided into 4 groups: control, 1 μg/mL lipopolysaccharides (LPS), 25 μmol/L EGCG, and 25 μmol/L EGCG + 1 μg/mL LPS groups. Flow cytometry analysis was used to determine phagocytosis, reactive oxygen species (ROS) and apoptosis. Cell proliferation was monitored by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) assay. NO generation was analyzed by Griess method. The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of Toll-like receptor 4 (TLR4) and NF-κB p65 proteins was detected by using Western blot analysis. Results: EGCG and/or LPS were no signif i cant effect on cell proliferation or apoptosis in mouse peritoneal macrophages. Compared with the LPS group, EGCG could significantly inhibit the LPS-induced increasing in ROS, NO, TNF-α and IL-1β in peritoneal macrophages (P < 0.01), thereby consequently suppress the polarization of macrophages into M1 phenotype and consequently exerting anti-inf l ammatory effects. Compared with the LPS group, the expression of TLR4 protein in macrophages and the expression of nuclear transcription factor-κB(NF-κB) p65 in nucleus were signif i cantly decreased in the EGCG + LPS group (P < 0.01). Conclusion: EGCG could inhibit LPS-induced inf l ammatory responses in mouse peritoneal macrophages, and the underlying mechanism may be related to the blocking of the polarization of macrophages into M1 phenotype via the TLR4-mediated NF-κB pathway.

    (-)-epigallocatechin gallate; anti-inf l ammatory effects; cell phenotype; NF-κB pathway; macrophage polarization

    2016-10-27

    國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(31560460);江西省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20151512041185);“三區(qū)”人才支持計(jì)劃科技特派人員專項(xiàng)(0210208651)

    吳瓊(1984—),女,主管技師,碩士,研究方向?yàn)槊庖邔W(xué)相關(guān)性。E-mail:66077223@qq.com

    *通信作者簡(jiǎn)介:李文娟(1982—),女,副教授,博士,研究方向?yàn)槭称钒踩c營(yíng)養(yǎng)。E-mail:wenjuanli@ncu.edu.cn

    10.7506/spkx1002-6630-201801022

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