面包皮中水溶性晚期糖基化終產(chǎn)物對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞的氧化損傷

賈本盼，袁曉金，范智義，胡 靜，李巨秀*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

面包皮中水溶性晚期糖基化終產(chǎn)物對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞的氧化損傷

賈本盼，袁曉金，范智義，胡 靜，李巨秀*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是食品在熱加工和貯藏過(guò)程中形成的一類化合物，與心血管疾病、糖尿病、腎病等多種慢性病的發(fā)生有重要聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)研究了含有AGEs的面包皮水提取物（bread crust extract，BCE）對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞（human kidney tubular epithelial cells，HKCs）內(nèi)氧化應(yīng)激的影響及細(xì)胞損傷。采用不同質(zhì)量濃度的BCE處理HKCs，并經(jīng)噻唑藍(lán)法確定后續(xù)BCE處理質(zhì)量濃度；通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）及培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平，評(píng)價(jià)BCE對(duì)HKCs胞內(nèi)氧化應(yīng)激平衡及細(xì)胞損傷程度的影響。結(jié)果表明：不同質(zhì)量濃度的BCE處理24 h后，HKCs胞內(nèi)ROS水平隨著BCE質(zhì)量濃度的增大不斷升高，且在8 mg/mL和12 mg/mL時(shí)胞內(nèi)ROS水平達(dá)到最大值；與對(duì)照組相比，胞內(nèi)MDA含量在BCE質(zhì)量濃度為4 mg/mL和8 mg/mL時(shí)極顯著增加（P＜0.01），但BCE質(zhì)量濃度達(dá)12 mg/mL時(shí)，MDA含量卻顯著降低（P＜0.05）。相反，胞內(nèi)總SOD活力卻隨著BCE質(zhì)量濃度的增大而降低，在8 mg/mL和12 mg/mL時(shí)，胞內(nèi)總SOD活力發(fā)生極顯著降低（P＜0.01）。胞外分泌型LDH水平隨著BCE處理質(zhì)量濃度的增大而升高，在BCE質(zhì)量濃度為8 mg/mL和12 mg/mL時(shí)，LDH活力發(fā)生極顯著增加（P＜0.01）。因此，BCE可以通過(guò)提高HKCs胞內(nèi)活性氧水平，引起胞內(nèi)總SOD活力降低，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，改變細(xì)胞膜通透性，使胞外LDH活力升高，導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重受損。

人腎小管上皮細(xì)胞；面包皮水提取物；氧化損傷；脂質(zhì)過(guò)氧化

非酶糖基化反應(yīng)是還原糖如葡萄糖、果糖等與蛋白質(zhì)游離氨基之間發(fā)生的可逆反應(yīng)[1]，生成的Schiff堿經(jīng)過(guò)分子重排形成結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的Amadori產(chǎn)物。Amadori產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)，包括多重脫水、裂解及活性二羰基中間產(chǎn)物的氧化修飾，形成多樣、穩(wěn)定的加合物，即晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs）[2-3]。體內(nèi)AGEs的來(lái)源主要有體內(nèi)生成和膳食攝入兩種途徑，而長(zhǎng)期攝入高AGEs含量的食物是引起體內(nèi)AGEs水平增加的主要原因[4]。

AGEs在體內(nèi)積累會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生一系列與氧化衰老或糖尿病相關(guān)的病理生理學(xué)疾病，如高血糖癥記憶力、肩凝癥、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性腎功能不全和阿爾茨海默綜合征等疾病[5-11]。AGEs與人體氧化應(yīng)激密切相關(guān)[12]，其主要通過(guò)與細(xì)胞表面特異性AGEs受體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的改變，進(jìn)而激活胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。

腎臟是AGEs在體內(nèi)循環(huán)與排泄的重要器官，腎功能損傷直接影響體內(nèi)AGEs水平及相關(guān)并發(fā)癥的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎病的患病率逐年上升，全球發(fā)病率高達(dá)5%～7%[13]，其中西方國(guó)家成年人發(fā)病率為8%～10%[14]。在慢性腎病病人中，患高血糖或高血壓病人占3/4[15]。在許多腎臟疾病最終發(fā)展成為末期腎衰竭過(guò)程中，腎小管間質(zhì)受損程度與病情的發(fā)展趨勢(shì)有著密切聯(lián)系[16]。腎小管上皮細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于高濃度AGEs下可能會(huì)引起腎小管上皮細(xì)胞抗氧化性能損傷，加速腎臟疾病的產(chǎn)生。

AGEs可以改善食品色澤和風(fēng)味，廣泛存在于面包等烘焙食品中。Ruhs等[3]通過(guò)對(duì)面包皮進(jìn)行熱水浸提得到面包皮水提取物（bread crust extract，BCE），并通過(guò)斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BCE中含有精氨酸-嘧啶、羧甲基賴氨酸、3-羥基-4-羥甲基-1-（5-氨基-5-羥基戊基）-吡啶和其他非特異性結(jié)構(gòu)的AGEs；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BCE可引起心肌成纖維細(xì)胞胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，核轉(zhuǎn)錄因子κB、p42/44和p38等信號(hào)通路激活及下游炎癥因子的表達(dá)。目前，對(duì)膳食AGEs與人類慢性病的關(guān)系研究較少，尤其在膳食中可溶性AGEs對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞（human kidney tubular epithelial cells，HKCs）的損傷及降低HKCs抗氧化能力的研究還缺乏系統(tǒng)研究報(bào)道。

本研究通過(guò)B C E作用于H K C s，利用噻唑藍(lán)（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT）法分析BCE處理質(zhì)量濃度對(duì)HKCs活力的影響，通過(guò)檢測(cè)HKCs胞內(nèi)ROS水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及上清液中乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活力的改變，進(jìn)一步探究BCE對(duì)HKCs的損傷機(jī)理，為研究膳食性AGEs與人體健康之間的聯(lián)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HKCs購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)；面包購(gòu)自楊凌當(dāng)?shù)孛姘俊?/p>

DMEM/F12培養(yǎng)基 美國(guó)Hyclone公司；MTT、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國(guó)Sigma公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒 西安赫特生物科技有限公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；MDA試劑盒、總SOD試劑盒、LDH試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；YT-CJ-2N型超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心；XDS-1B倒置生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；Victor X3型多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)PE公司；PharmaSpec UV-1700紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；CS110-4冷凍干燥機(jī) 丹麥LaboGene公司；RE201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鞏義市予華儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 面包皮的提取

將面包皮經(jīng)室溫通風(fēng)干燥后，粉碎機(jī)粉碎。BCE的提取方法參照文獻(xiàn)[17]并略作修改。準(zhǔn)確稱取250 g面包皮粉末，加入300 mL氯仿，置于搖床中，室溫振蕩1 h，漏斗過(guò)濾棄濾液，重復(fù)操作3 次。剩余固體室溫通風(fēng)干燥后，加400 mL蒸餾水，50 ℃水浴提取3 h，重復(fù)提取2 次。合并提取液，8 000 r/min、4 ℃離心20 min，0.45 μm濾膜過(guò)濾，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到固態(tài)BCE，密封存于-80 ℃待用。

1.3.2 面包皮及BCE中熒光性AGEs的測(cè)定

面包皮和BCE中熒光性AGEs的檢測(cè)參照Morales等[18]的方法，略加修改。稱取100 mg面包皮粉末于10 mL離心管中，加入1.2 mg/mL的鏈霉素蛋白酶E溶液3 mL（鏈霉素蛋白酶E溶于含5 mg/mL十二烷基硫酸鈉和1.47 mg/mL CaCl2的Tris-HCl中，pH 7.5）。漩渦振蕩后，于40 ℃搖床中振蕩消化36 h，冷卻后于4 ℃、4 500×g離心10 min。取上清液，0.45 μm濾膜過(guò)濾后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）適當(dāng)稀釋后用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)347 nm、發(fā)射波長(zhǎng)415 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，以AU/mg表示。

1.3.3 MTT法檢測(cè)BCE對(duì)HKCs活力的影響

37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HKCs，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM/F12。待細(xì)胞融合至80%左右，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代，參照Mosmann[19]的方法進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液（約105個(gè)/mL），接種于96 孔板中，每孔200 μL，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)液，加無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入無(wú)血清培養(yǎng)基配制的4、8、12、16、20、25 mg/mL的BCE 200 μL，對(duì)照組以200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基替代。每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2 次，每孔再加入150 μL MTT工作液，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄孵育液，加150 μL DMSO，緩慢振蕩10 min，酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。以150 μL DMSO為空白組調(diào)零。細(xì)胞活力根據(jù)以下公式計(jì)算。

1.3.4 BCE對(duì)HKCs內(nèi)ROS水平的影響

根據(jù)Konrad等[20]的方法，對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行檢測(cè)。其中，細(xì)胞內(nèi)ROS水平與胞內(nèi)熒光強(qiáng)度成正比例關(guān)系。HKCs接種于12 孔板中，待細(xì)胞融合至90%左右，無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后，用無(wú)血清培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度的BCE（0、4、8、12 mg/mL）處理細(xì)胞24 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，加無(wú)血清培養(yǎng)基配制的10 μmol/L DCFH-DA熒光探針1 mL，37 ℃避光孵育20 min。棄探針培養(yǎng)液，無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌，用熒光酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)535 nm處檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，表示胞內(nèi)ROS水平。

1.3.5 BCE對(duì)HKCs內(nèi)MDA含量及總SOD活力的影響

通過(guò)檢測(cè)MDA含量來(lái)評(píng)估細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平和細(xì)胞膜受損程度，檢測(cè)總SOD活力來(lái)評(píng)估胞內(nèi)抗氧化酶系活力。細(xì)胞接種于6孔板中，按照1.3.3節(jié)方法處理細(xì)胞，待水提物處理24 h后，棄培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS洗2 次，每孔加300 μL含有苯甲基磺酰氟（1 mmol/L）的RIPA裂解液，充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取裂解上清液（細(xì)胞蛋白提取過(guò)程均在冰上進(jìn)行），采用試劑盒測(cè)定胞內(nèi)總蛋白含量、MDA含量和總SOD活力。

1.3.6 BCE對(duì)HKCs培養(yǎng)上清液中LDH活力的影響

細(xì)胞培養(yǎng)和BCE處理均按照1.3.4節(jié)方法進(jìn)行。待不同質(zhì)量濃度BCE處理24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并用試劑盒測(cè)定LDH活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)以 ±s表示。利用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析，并通過(guò)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 面包皮和BCE中AGEs熒光強(qiáng)度

BCE組中AGEs熒光強(qiáng)度（2 072 AU/mg）與面包皮中AGEs總熒光強(qiáng)度（2 907 AU/mg）相比極顯著下降（P＜0.01）。但BCE組的熒光強(qiáng)度依然達(dá)到2 000 AU/mg以上，說(shuō)明BCE中還含有較多熒光性物質(zhì)。

AGEs是多種分子結(jié)構(gòu)不同物質(zhì)的總稱，具有交聯(lián)及產(chǎn)生熒光的特性[21]。但羧甲基賴氨酸、羧乙基賴氨酸和吡咯素等AGEs無(wú)熒光性[22]，因此熒光性只能反映部分AGEs的含量[23]。Delgadoandrade等[24]對(duì)西方谷物早餐食品中熒光性美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)總熒光性美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量是游離熒光性美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的10 倍左右。本實(shí)驗(yàn)中，面包皮中總熒光性AGEs含量只達(dá)到BCE中的1.4 倍左右，經(jīng)水提取后主要為水溶性游離態(tài)AGEs。所以，高含量的AGEs可能是BCE引起細(xì)胞損傷的主要原因。

2.2 BCE對(duì)HKCs活力的影響

圖1 BCE對(duì)HKCs活力的影響Fig. 1 Effect of BCE on the viability of HKCs

如圖1所示，與對(duì)照組相比，BCE對(duì)HKCs活力的抑制在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。在BCE質(zhì)量濃度為0～8 mg/mL時(shí)，HKCs活力雖有所抑制但均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。12 mg/mL BCE處理組對(duì)細(xì)胞活力的抑制與對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0.05）。因此在不顯著影響細(xì)胞活力的前提下，選取4、8、12 mg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Ruhs等[3]研究發(fā)現(xiàn)用BCE處理鼠心肌成纖維細(xì)胞時(shí)，30 mg/mL BCE并沒(méi)有對(duì)心肌成纖維細(xì)胞活力產(chǎn)生顯著性抑制，甚至在低質(zhì)量濃度下還提高了細(xì)胞活力。而本實(shí)驗(yàn)中，BCE對(duì)HKCs活力產(chǎn)生了顯著的抑制作用，并隨著BCE質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。

2.3 BCE對(duì)HKCs胞內(nèi)ROS水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)ROS在細(xì)胞吞噬作用過(guò)程中對(duì)抵御抗原具有重要作用，但過(guò)量ROS能引起機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)及核酸的氧化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25]。

圖2 BCE對(duì)上清液HKCs胞內(nèi)ROS水平的影響Fig. 2 Effect of BCE on ROS levels in HKCs

由圖2可知，與對(duì)照組相比，BCE處理后HKCs內(nèi)ROS水平隨著BCE質(zhì)量濃度的增加而升高。4 mg/mL BCE處理組時(shí)，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。而8、12 mg/mL BCE處理組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），但兩處理組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

Tsukagoshi等[26]發(fā)現(xiàn)，高水平的ROS會(huì)損傷細(xì)胞，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞正常生理功能紊亂。本實(shí)驗(yàn)中8 mg/mL BCE可能引起細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系活性受損，降低了對(duì)胞內(nèi)ROS的清除能力，導(dǎo)致胞內(nèi)ROS水平達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，當(dāng)BCE質(zhì)量濃度達(dá)12 mg/mL時(shí)，胞內(nèi)ROS水平不再發(fā)生顯著性增加（P＞0.05）。Mohd等[27]認(rèn)為ROS作為糖化產(chǎn)物處理細(xì)胞后的中間產(chǎn)物，參與了細(xì)胞毒性作用，且這種毒性可能是由蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜相互聚合或通過(guò)其他機(jī)制產(chǎn)生。

2.4 BCE對(duì)HKCs內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，被認(rèn)為是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的標(biāo)志物[7]。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)體發(fā)生嚴(yán)重的過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，進(jìn)而損傷細(xì)胞膜[28]。因此，可通過(guò)測(cè)定胞內(nèi)MDA含量變化來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度[29]，進(jìn)而間接地反映膜系統(tǒng)受損程度[30]。

圖3 BEC對(duì)HKCs胞內(nèi)MDA含量的影響Fig. 3 Effect of BCE on MDA content in HKCs

如圖3所示，BCE處理質(zhì)量濃度在0～8 mg/mL時(shí)，隨著BCE質(zhì)量濃度的增大，胞內(nèi)MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。8 mg/mL BCE處理組胞內(nèi)MDA含量約是對(duì)照組的2 倍，達(dá)到最大值。但12 mg/mL BCE處理組胞內(nèi)MDA含量與對(duì)照組相比卻顯著降低（P＜0.05），只達(dá)到對(duì)照組MDA含量的一半。

BCE處理HKCs后引起ROS水平升高，同時(shí)可能引起胞內(nèi)自由基含量也隨之增高，這些自由基可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生[31]。由此，BCE質(zhì)量濃度在0～8 mg/mL時(shí)，可能引起胞內(nèi)自由基含量增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜受損。因此，胞內(nèi)MDA含量不斷升高意味著細(xì)胞膜的受損程度在不斷加劇。BCE質(zhì)量濃度達(dá)12 mg/mL時(shí)，胞內(nèi)MDA含量與對(duì)照組相比卻顯著降低（P＜0.05），表明12 mg/mL BCE可能嚴(yán)重?fù)p傷了細(xì)胞膜的正常功能，造成細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)MDA含量降低。

2.5 BCE對(duì)HKCs胞內(nèi)總SOD活力的影響

SOD作為重要的抗氧化酶系，在自由基引起的氧化損傷過(guò)程中，通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基，阻斷自由基連鎖反應(yīng)[32]，提高細(xì)胞抗氧化能力，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。機(jī)體內(nèi)SOD活力的下降表明機(jī)體抗自由基毒性能力下降，即機(jī)體氧化受損程度增加[33]。因此研究HKCs胞內(nèi)SOD活力可以評(píng)估BCE對(duì)胞內(nèi)抗氧化酶系的損傷程度，進(jìn)一步確定BCE處理后細(xì)胞的受損程度。

圖4 BCE對(duì)HKCs胞內(nèi)總SOD活力的影響Fig. 4 Effect of BCE on total SOD activity in HKCs

如圖4所示，4 mg/mL BCE處理組細(xì)胞內(nèi)總SOD活力與對(duì)照組相比雖降低，但無(wú)顯著差異（P＞0.05），然而當(dāng)BCE質(zhì)量濃度增加到8、12 mg/mL時(shí)，胞內(nèi)總SOD活力與對(duì)照組相比極顯著降低（P＜0.01），即隨著BCE質(zhì)量濃度的增加，HKCs胞內(nèi)總SOD活力不斷降低。尤其當(dāng)BCE質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí)，胞內(nèi)總SOD活力與對(duì)照組相比降低了約45%。

SOD可防止超氧化物在細(xì)胞內(nèi)積累進(jìn)而保護(hù)一些蛋白質(zhì)。細(xì)胞在新陳代謝過(guò)程中，胞內(nèi)SOD的缺乏會(huì)導(dǎo)致ROS在細(xì)胞內(nèi)大量積累，進(jìn)而會(huì)損傷細(xì)胞內(nèi)一些大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA）及細(xì)胞膜[34-35]。因此，隨著BCE質(zhì)量濃度的增加，引起HKCs胞內(nèi)ROS水平持續(xù)升高，胞內(nèi)高水平的ROS可能對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜造成損傷，進(jìn)而導(dǎo)致胞內(nèi)SOD活力持續(xù)降低，最終造成細(xì)胞損傷。

2.6 BCE對(duì)上清液中LDH活力的影響

LDH是一種胞內(nèi)酶，在糖酵解過(guò)程中可將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸產(chǎn)生ATP，為細(xì)胞代謝提供能量。培養(yǎng)上清液中LDH活力增高意味著細(xì)胞膜受損或功能紊亂。因此，LDH可作為一個(gè)生物化學(xué)標(biāo)記反應(yīng)疾病的嚴(yán)重程度的指標(biāo)[36]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同質(zhì)量濃度的BCE處理，檢測(cè)HKCs培養(yǎng)上清液中的LDH活力，即分泌型LDH活力，進(jìn)而對(duì)BCE引起的HKCs細(xì)胞膜的損傷進(jìn)行評(píng)估，作為判斷細(xì)胞受損程度的指標(biāo)。

圖5 BCE對(duì)上清液中LDH水平的影響Fig. 5 Effect of BCE on LDH levels in culture supernatants of HKCs

由圖5可知，隨著BCE質(zhì)量濃度的增加，上清液中LDH活力也隨之增加。4 mg/mL BCE處理組上清液中LDH活力與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。但當(dāng)BCE質(zhì)量濃度為8、12 mg/mL時(shí)，上清液中LDH活力與對(duì)照組相比均極顯著升高（P＜0.01），且12 mg/mL BCE處理組上清液中LDH活力達(dá)到最大值。

細(xì)胞膜解體后將LDH釋放到細(xì)胞外，因此LDH可以作為組織損傷的非特異性標(biāo)志物[37]。本實(shí)驗(yàn)中，隨著BCE質(zhì)量濃度的增加，LDH活力不斷上升，意味著細(xì)胞受損程度加劇。在BCE質(zhì)量濃度達(dá)8、12 mg/mL時(shí)，HKCs細(xì)胞膜可能受損，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，從而使上清液中LDH活力顯著增加。因此，BCE可能通過(guò)損傷細(xì)胞膜，增加細(xì)胞膜通透性，從而改變細(xì)胞正常生理功能，引起細(xì)胞受損。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)不同質(zhì)量濃度的BCE處理HKCs發(fā)現(xiàn)，BCE對(duì)HKCs活力具有顯著抑制作用。隨著BCE處理質(zhì)量濃度的增大，HKCs胞內(nèi)ROS水平不斷升高，進(jìn)而引起細(xì)胞正常生理功能紊亂，導(dǎo)致胞內(nèi)總SOD活力不斷降低。BCE可誘發(fā)HKCs胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，使胞內(nèi)MDA含量升高，造成細(xì)胞膜受損、通透性增加，導(dǎo)致培養(yǎng)上清液中LDH水平持續(xù)升高，使細(xì)胞受損。因此，對(duì)AGEs引發(fā)抗氧化損傷的具體機(jī)制將進(jìn)一步深入探究。

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Water-Soluble Advanced Glycation End Products from Bread Crust Cause Oxidative Damage to Human Kidney Tubular Epithelial Cells

JIA Benpan, YUAN Xiaojin, FAN Zhiyi, HU Jing, LI Juxiu*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Advanced glycation end products (AGEs) are a class of compounds that are formed during thermal processing and storage of foods, which are signif i cantly associated with various chronic diseases, such as cardiovascular diseases, diabetes,and kidney diseases. In the present study, bread crust extract (BCE), rich in AGEs, was obtained from bread crust through water extraction, and we investigated if BCE could cause intracellular oxidative stress and cell damage in human kidney tubular epithelial cells (HKCs). HKCs were treated with different BCE concentrations for determining the appropriate concentration of BCE by 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide assay for use in subsequent experiments. The effect of BCE on intracellular oxidative stress balance and the degree of cell damage was evaluated by detecting the levels of intracellular reactive oxygen species (ROS), total superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde(MDA) and lactic dehydrogenase (LDH) in supernatants. The results indicated that the level of ROS in HKCs was increased along with increasing BCE concentration after being cultured with different concentrations of BCE for 24 h, and reached a maximum value at 8 and 12 mg/mL. Intracellular MDA contents increased signif i cantly at 4 and 8 mg/mL of BCE (P ＜ 0.01),but markedly declined at 12 mg/mL (P ＜ 0.05). On the contrary, intracellular SOD activity was reduced with increasing concentration of BCE, and signif i cantly decreased at BCE concentrations of 8 and 12 mg/mL. The level of secreted LDH was increased with increasing BCE concentrations, and the increase was highly signif i cant at 8 and 12 mg/mL (P ＜ 0.01).Therefore, BCE can cause serious damage to HKCs via elevating intracellular ROS levels, inhibiting total SOD activity and thereby promoting lipid peroxidation reaction, altering the cell membrane permeability, and consequently improving extracellular LDH activity.

human kidney tubular epithelial cells; bread crust extract; oxidative damage; lipid peroxidation

10.7506/spkx1002-6630-201801021

R151.3

A

1002-6630（2018）01-0136-06

賈本盼, 袁曉金, 范智義, 等. 面包皮中水溶性晚期糖基化終產(chǎn)物對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞的氧化損傷[J]. 食品科學(xué), 2018,39(1): 136-141.

10.7506/spkx1002-6630-201801021. http://www.spkx.net.cn

JIA Benpan, YUAN Xiaojin, FAN Zhiyi, et al. Water-soluble advanced glycation end products from bread crust cause oxidative damage to human kidney tubular epithelial cells[J]. Food Science, 2018, 39(1): 136-141. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801021. http://www.spkx.net.cn

2016-09-27

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471579）

賈本盼（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)。E-mail：panjiaben@sina.com

*通信作者簡(jiǎn)介：李巨秀（1972—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)。E-mail：juxiuli@msn.com