尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白的提取及其理化特性分析

廖 偉，夏光華，李 川，仇昶旭，李永成，申鉉日*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228）

尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白的提取及其理化特性分析

廖 偉，夏光華，李 川，仇昶旭，李永成，申鉉日*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228）

以尖吻鱸魚鱗和魚皮為原料，提取并分離純化酶溶性膠原蛋白，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）、氨基酸組成分析、差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）、傅里葉變換紅外光譜、X射線衍射和Zeta電位以及溶解度研究，分析和比較了其主要理化性質(zhì)。冷凍干燥后魚鱗和魚皮膠原蛋白得率（干質(zhì)量）分別為2.3 g/100 g和47.3 g/100 g；SDS-PAGE結(jié)果顯示兩種膠原蛋白構(gòu)型均為[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)，初步判斷屬于Ⅰ型膠原蛋白；DSC結(jié)果顯示魚鱗和魚皮膠原蛋白熱變性溫度（Td）分別為37.54 ℃和36.74 ℃；傅里葉變換紅外光譜和X射線衍射結(jié)果顯示膠原蛋白經(jīng)胃蛋白酶處理后仍能保持其完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)；Zeta電位結(jié)果顯示魚鱗和魚皮膠原蛋白等電點(diǎn)分別為pH 6.40和pH 6.64；溶解度研究結(jié)果顯示兩種膠原蛋白在酸性條件和低NaCl質(zhì)量濃度下均表現(xiàn)出良好的溶解性。

尖吻鱸；魚鱗；魚皮；膠原蛋白；氨基酸

膠原蛋白是脊椎動(dòng)物中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，約占蛋白總量的30%[1]。目前，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少29 種不同類型的膠原蛋白，每種膠原蛋白都有其獨(dú)特的氨基酸序列與分子結(jié)構(gòu)，其中Ⅰ型膠原蛋白在日常生活中最為常見[2]。Ⅰ型膠原蛋白在食品、生物材料、藥制品和化妝品工業(yè)中已有廣泛應(yīng)用[3]。目前，牛、羊和豬畜等加工下腳料仍是提取膠原蛋白的主要原料。但是禽流感、瘋牛病、口蹄疫和一些宗教的相關(guān)問題對(duì)陸地生物提取膠原蛋白造成了一定的影響[4]。因此，研究者開始尋找新的膠原蛋白來源，特別是魚類膠原蛋白已經(jīng)被納入天然膠原蛋白的提取來源之中。

尖吻鱸（Lates calcarifer），又名盲曹魚，在沿海水域棲息和覓食，是我國(guó)南方人民最喜食的魚類之一。尖吻鱸肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，由于具有生長(zhǎng)快、養(yǎng)殖周期短、廣鹽性等優(yōu)點(diǎn)，吸引了東南亞、澳大利亞等地的廣泛養(yǎng)殖。伴隨著養(yǎng)殖產(chǎn)量增大，尖吻鱸深加工后產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——魚鱗和魚皮，其富含膠原蛋白，可作為提取膠原蛋白的新原料。尖吻鱸深加工后的副產(chǎn)物得到充分利用后不僅可以增加魚制品的附加值，還可以減少其對(duì)環(huán)境的污染。目前，膠原蛋白提取自條紋鯰魚[5]、鯉魚[3]、烏鱧和草魚[6]等已有相關(guān)報(bào)道。然而，系統(tǒng)比較魚鱗和魚皮膠原蛋白性質(zhì)特征的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在通過酶法提取尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白并系統(tǒng)比較它們主要的性質(zhì)特征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

尖吻鱸購(gòu)買于?？谑兄行霓r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；胃蛋白酶美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

DSC131EV差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 法國(guó)塞塔拉姆儀器公司；DYCZ-24DN垂直電泳系統(tǒng) 北京市六一儀器廠；TV-1900雙光束紫外-可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司；EYEL4冷凍干燥機(jī) 日本Rikakikai公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀、X射線粉末衍射儀 德國(guó)Bruker公司；Zetasizer Nano S90激光粒度分析儀 英國(guó)馬爾文公司；Stratos高速冷凍離心機(jī)美國(guó)賽默飛世爾公司。

1.3 方法

1.3.1 魚皮和魚鱗膠原蛋白的提取、純化

酸輔酶法提取酶溶性膠原蛋白（pepsin-soluble collagen，PSC）參考Nagai等[7]的方法并略作修改。具體方法如下：用剪刀將解凍后的魚皮和魚鱗剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，隨后浸泡在0.1 mol/L的NaOH溶液（1∶20，m/V）中36 h，以除去雜蛋白和色素。堿處理后的魚鱗和魚皮用去離子水沖洗至中性。魚皮浸泡在10%的正丁醇溶液（1∶10，m/V）中脫脂24 h；魚鱗浸泡在0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液（1∶10，m/V）中處理72 h，以除去羥磷灰石。

處理后的魚鱗和魚皮殘留物浸泡在含有1 g/100 mL胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸溶液（1∶20，m/V）中48 h以提取膠原蛋白，隨后溶解液在20 000×g，4 ℃的條件下離心20 min，收集上清液后鹽析至終濃度0.9 mol/L。鹽析后的樣品液在12 000×g，4 ℃的條件下離心15 min，收集沉淀；收集的沉淀完全溶于0.5 mol/L的乙酸溶液，在0.1 mol/L的乙酸溶液（1∶50，V/V）中透析24 h，隨后在相同體積的去離子水中透析24 h。透析后的樣品凍干后即為PSC。膠原蛋白的得率是指提取所得膠原蛋白樣品質(zhì)量（干質(zhì)量）與凍干魚皮的質(zhì)量比。膠原蛋白的提取重復(fù)3次，得率取其平均值，所有的操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。

1.3.2 膠原蛋白理化性質(zhì)研究

1.3.2.1 SDS-PAGE

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）根據(jù)Laemmli[8]的方法，采用不連續(xù)的Tris-甘氨酸電泳系統(tǒng)。膠原蛋白樣品溶解于去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的膠原蛋白溶解液。7.5%的分離膠和4%的濃縮膠，以80 V的穩(wěn)流電壓進(jìn)行電泳分析。

1.3.2.2 氨基酸組成測(cè)定

膠原蛋白樣品經(jīng)鹽酸水解后密封在消化管中，110 ℃減壓處理。隨后采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果以每1 000 個(gè)氨基酸殘基中的特定氨基酸殘基數(shù)來表示。

1.3.2.3 DSC測(cè)定

膠原蛋白樣品溶于去離子水中（1∶40，m/V），在4 ℃靜置24 h。稱取溶解后的樣品9～15 mg于鋁鍋中，加蓋密封，置于儀器樣品槽中進(jìn)行測(cè)定?？盏拿芊怃X鍋?zhàn)鳛閷?duì)照。樣品掃描溫度為15～50 ℃，掃描速率為2 ℃/min。

1.3.2.4 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

取5 mg膠原蛋白樣品與150 mg KBr粉末在干燥條件下充分研磨，壓片。研磨壓片后的藥片狀樣品置于樣品室內(nèi)待測(cè)定。紅外光譜掃描范圍為4 000～500 cm-1，分辨率2 cm-1。掃描結(jié)果使用Origin 8.0 軟件分析。

1.3.2.5 X射線衍射分析

膠原蛋白樣品的晶體結(jié)構(gòu)用X射線衍射儀記錄分析，X射線源為Cu靶Ka輻射，電壓為40 kV，電流為40 mA。掃描角度2θ為10°～50°，掃描速率為0.06°/s。

1.3.2.6 Zeta電位測(cè)定

Zeta電位分析根據(jù)Singh等[5]的方法進(jìn)行測(cè)定。膠原蛋白樣品溶解于0.5 mol/L的乙酸溶液中至終質(zhì)量濃度5 mg/mL，用1 mol/L KOH和1mol/L HNO3溶液將膠原蛋白樣品液調(diào)至不同的pH值（2～10），隨后用Zeta電位儀測(cè)定不同pH值的Zeta電位。

1.3.2.7 溶解度測(cè)定

參考Liu Dasong等[9]的方法探索pH值和NaCl質(zhì)量濃度對(duì)膠原蛋白樣品溶解度的影響。

pH值對(duì)膠原蛋白溶解度的影響：膠原蛋白樣品在4 ℃條件下溶于0.5 mol/L的乙酸溶液，終質(zhì)量濃度為3 mg/mL，磁力攪拌直至完全溶解。取8 mL的膠原蛋白樣品液用6 mol/L HCl或6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至不同的pH值（1～10）。樣品液調(diào)至要求的pH值后，用0.5 mol/L的乙酸溶液將其補(bǔ)足至10 mL。隨后，混合液在20 000×g、4 ℃的條件下離心30 min，收集上清液。根據(jù)Lowry法[10]測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，牛血清白蛋白作為對(duì)照。相對(duì)溶解度的計(jì)算是某一特定pH值膠原蛋白的溶解度比上膠原蛋白最大的溶解度。

NaCl質(zhì)量濃度對(duì)膠原蛋白溶解度的影響：膠原蛋白樣品在4 ℃條件下溶于0.5 mol/L的乙酸溶液（終質(zhì)量濃度為6 mg/mL），磁力攪拌直至完全溶解。取5 mL的膠原蛋白溶解液與5 mL含有不同質(zhì)量濃度NaCl（0、1、2、3、4、5 g/100 mL和6 g/100 mL）的0.5 mol/L乙酸溶液混合均勻。隨后混合液在20 000×g、4 ℃條件下離心30 min。采用上述Lowry法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。NaCl溶液質(zhì)量濃度為0 g/100 mL時(shí)作為參比計(jì)算相對(duì)溶解度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSC提取率

尖吻鱸魚鱗和魚皮PSC的提取率分別為2.3 g/100 g和47.3 g/100 g（干質(zhì)量，下同）。尖吻鱸魚鱗PSC的提取率低于鳙魚魚鱗PSC的（2.7 g/100 g），而高于紅點(diǎn)海鯡鯉PSC（1.2 g/100 g）和酸法提取膠原蛋白（acid soluble collagen，ASC）（0.46 g/100 g）[2,11]。尖吻鱸魚皮PSC提取率低于鳙魚魚皮PSC（60.3 g/100 g）和史氏鱘魚皮PSC（52.8 g/100 g），而遠(yuǎn)高于大鰭鳠ASC（16.8 g/100 g）和羅非魚ASC（27.2 g/100 g）[1,12]。膠原蛋白提取率的差異可能是由不同物種膠原蛋白結(jié)構(gòu)的差異和膠原蛋白制備方法的差異造成的。另外，相比PSC，ASC得率較低是因?yàn)槟z原蛋白端肽鏈的交聯(lián)使其在酸性條件下溶解度降低[13]。而PSC經(jīng)胃蛋白酶處理后裂解了端肽結(jié)構(gòu)，從而提高膠原蛋白在酸性條件下的溶解度，所以用酸法有助于提高膠原蛋白的提取率[14]。

2.2 SDS-PAGE結(jié)果

尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，兩種膠原蛋白都含有兩條不同的α鏈（α1和α2）和一條β鏈，其中α1條帶濃度明顯高于α2且接近于α2條帶濃度的兩倍，提示該膠原蛋白是由兩個(gè)單位α1鏈和一個(gè)單位α2鏈組成（[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)），這與楊玲等[15]的結(jié)果相似，可初步判定尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白屬于典型的Ⅰ型膠原蛋白。分析可知，魚鱗膠原蛋白在電泳條帶上分子質(zhì)量分布（α1120 kDa和α2114 kDa）與魚皮膠原蛋白（α1122 kDa和α2116 kDa）基本一致。另外，圖中條帶清晰、雜帶少，說明膠原蛋白純度較高。

圖1 尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE of collagen from scales and skin of Asian seabass

2.3 氨基酸組成分析結(jié)果

表1 尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白氨基酸組成分析Table 1 Amino acid composition of collagen from scales and skin of Asian seabass

尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白氨基酸組成分析如表1所示。兩種膠原蛋白都含有豐富的甘氨酸（約占總氨基酸含量的1/3）、丙氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸，也都含有少量的組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。

亞氨酸（脯氨酸+羥脯氨酸）含量通常被用來判斷膠原蛋白的熱穩(wěn)定性，因?yàn)楦彼岷土u脯氨酸的吡咯烷環(huán)可加強(qiáng)多肽鏈的構(gòu)象限制，并有助于增強(qiáng)三股螺旋的穩(wěn)定性[16]。尖吻鱸魚鱗膠原蛋白亞氨酸含量（207.6/1 000 個(gè)殘基）高于魚皮膠原蛋白的（195.5/1 000 個(gè)殘基）。相比之前已經(jīng)報(bào)道的魚類ASC或PSC[3,9,17]，尖吻鱸魚鱗和魚皮PSC具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。另外，已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)顯示尖吻鱸魚鱗ASC亞氨酸含量（193/1 000 個(gè)殘基）[18]低于本實(shí)驗(yàn)的魚鱗PSC（207.6/1 000 個(gè)殘基），這可能是由于膠原蛋白制備方法的不同或魚類棲息環(huán)境的不同所造成。另外，食品中膠原蛋白水解物具有抗氧化性是由于疏水性氨基酸作用而產(chǎn)生的，這些疏水性氨基酸包括膠原蛋白N端上的亮氨酸和纈氨酸，或蛋白序列中的組氨酸、酪氨酸和脯氨酸。另外蛋白肽鏈上的疏水氨基酸，諸如膠原蛋白C端上的丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸可以增強(qiáng)ACE抑制劑活性[19]。而尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白中含有大量的疏水性氨基酸，這意味著尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白具有潛在的抗氧化和降血壓活性。

2.4 DSC分析結(jié)果

圖2 尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白DSC測(cè)定結(jié)果Fig. 2 DSC curves of collagen from scales and skin of Asian seabass

圖2為兩種膠原蛋白熱變性溫度（Td）曲線，尖吻鱸魚鱗膠原蛋白的變性溫度比魚皮膠原蛋白的稍高，分別出現(xiàn)在37.54 ℃和36.74 ℃處。魚鱗膠原蛋白熱焓值（0.937 J/g）也比魚皮膠原蛋白（0.827 J/g）高，所以魚鱗膠原蛋白比魚皮膠原蛋白擁有更好的熱穩(wěn)定性。尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性，高于已經(jīng)報(bào)道過的草魚魚皮PSC（Td＝35.81 ℃）和烏鱧魚皮PSC（Td＝34.06 ℃），大黃魚魚鱗PSC（Td＝27.5 ℃）和鰱魚魚鱗PSC（Td＝29 ℃）[20-21]，略低于牛皮ASC（Td＝40.8 ℃）和小雞胸骨PSC（Td＝43.8 ℃）[3,22]。Ikoma等[23]曾報(bào)道脯氨酸和羥脯氨酸中的吡啶環(huán)狀結(jié)構(gòu)有助于增強(qiáng)膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，所以亞氨酸含量和熱穩(wěn)定性呈正相關(guān)。尖吻鱸魚鱗膠原蛋白（207.6/1 000 個(gè)殘基）亞氨酸含量高于魚皮膠原蛋白（195.5/1 000 個(gè)殘基），與DSC結(jié)果相符。另一方面，Nagai等[7]曾報(bào)道膠原蛋白熱穩(wěn)定性與脯氨酸羥基化率呈正相關(guān)[24]。而計(jì)算得尖吻鱸魚鱗羥基化率為40.55%，低于魚皮膠原蛋白的40.77%，與DSC結(jié)果不符。所以膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與氨基酸組成具體關(guān)系還需要進(jìn)一步研究證明。

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 FTIR spectra of collagen from scales and skin of Asian seabass

從圖3中可以清晰觀察到膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜圖中酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的吸收峰，這些峰的位置有細(xì)微差別，此結(jié)果與條紋鯰魚[5]、羅非魚[25]的報(bào)道較為類似。歸屬于N—H的伸縮振動(dòng)的酰胺A帶分別出現(xiàn)在尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白紅外光譜3 442.07 cm-1和3 424.25 cm-1處。根據(jù)Doyle等[26]的報(bào)道，酰胺A帶出現(xiàn)的位置與肽鏈N—H基團(tuán)的氫鍵鍵合程度有關(guān)，當(dāng)N—H的氫鍵鍵合程度較高時(shí)，則吸收峰會(huì)藍(lán)移。歸屬于—CH2非對(duì)稱拉伸的酰胺B帶，出現(xiàn)在尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜的2 933.63 cm-1和2 929.46 cm-1處。膠原蛋白的酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶與膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，其中C＝O伸縮振動(dòng)歸屬于酰胺Ⅰ；N—H和C—H扭轉(zhuǎn)振動(dòng)歸屬為酰胺Ⅱ；甘氨酸和脯氨酸殘基上的—CH2特征振動(dòng)歸屬為酰胺Ⅲ[1]。魚鱗膠原蛋白的酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶分別出現(xiàn)在1 658.18、1 549.38 cm-1和1 241.37 cm-1處，而魚皮膠原蛋白出現(xiàn)在相對(duì)稍低的1 652.41、1 548.99 cm-1和1 240.42 cm-1的位置，這意味著魚皮膠原蛋白比魚鱗膠原蛋白擁有更多或更強(qiáng)的氫鍵，更多的氫鍵則意味著蛋白分子規(guī)整度更低，所以魚皮膠原蛋白規(guī)整度不如魚鱗膠原蛋白。

2.6 X射線衍射分析

圖4 尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白的X射線衍射圖Fig. 4 X-ray diffraction patterns of collagen from scales and skin of Asian seabass

表2 尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白X射線衍射峰對(duì)應(yīng)的d值Table 2 d values of X-ray diffraction peaks of collagen from scales and skin of Asian seabass

兩種膠原蛋白X射線衍射分析結(jié)果如圖4、表2所示。采用布拉格二維方程2dsin θ＝λ（λ＝0.154）描述X射線衍射結(jié)果。魚鱗和魚皮膠原蛋白均有3 個(gè)不同的衍射峰，第1個(gè)衍射峰（標(biāo)記為A1）在7°～8°之間出現(xiàn)，峰型相對(duì)比較尖銳。A1峰的d值可反映了膠原蛋白纖維中分子鏈間的距離[27]，計(jì)算可得魚鱗和魚皮膠原蛋白纖維中分子鏈的距離分別是1.25 nm和1.18 nm，說明了魚鱗膠原蛋白比魚皮膠原蛋白更適合藥物傳輸方面的應(yīng)用[28]。在20°～25°之間出現(xiàn)了一個(gè)寬且大的峰（標(biāo)記為A2），A2峰代表了膠原蛋白纖維內(nèi)部的眾多結(jié)構(gòu)層次所引起的漫散射。在30°～35°之間出現(xiàn)了第3個(gè)峰，（標(biāo)記為A3），A3峰的d值代表代表了三股螺旋結(jié)構(gòu)上沿螺旋中心軸相鄰氨基酸殘基之間的距離。Eyre[29]曾報(bào)道膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)中每圈螺旋含有3.3 個(gè)氨基酸殘基（n＝3.3），螺距為0.96 nm；沿著螺旋中心軸，相鄰氨基酸殘基之間的距離為0.29 nm。尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白A3峰的d值均為0.29 nm，說明酶法提取的兩種膠原蛋白均保持了完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

2.7 Zeta電位測(cè)定結(jié)果

圖5 尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白在不同pH值條件下的Zeta電位Fig. 5 Zeta potential of collagen from scales and skin of Asian seabass at different pH levels

不同pH值的Zeta電位測(cè)定結(jié)果如圖5所示。兩種膠原蛋白的正電位在pH 2～6之間，負(fù)電位在pH 7～11之間。尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白表面靜電荷均隨著pH值的增加而降低，分別在pH 6.40和pH 6.64處?kù)o電荷為0，即等電點(diǎn)。當(dāng)pH值高于或低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子鏈之間斥力增加，產(chǎn)生較高的靜電荷并使得蛋白分子溶解度增加。當(dāng)靜電荷為0時(shí)，疏水基之間的相互作用增強(qiáng)而引起蛋白質(zhì)沉淀或聚集[5]。不同魚類的膠原蛋白有著不同的等電點(diǎn)。例如，黑鰭鯊魚皮PSC等電點(diǎn)為7.02，紅點(diǎn)海鯡鯉魚鱗PSC等電點(diǎn)為4.96[11,30]。這些魚類膠原蛋白具有不同的等電點(diǎn)可能是因?yàn)榘被岬男蛄胁煌桶被釟埢姆植疾煌隆?/p>

2.8 溶解度測(cè)定結(jié)果

2.8.1 pH值對(duì)膠原蛋白溶解度的影響

圖6 尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白在不同pH值條件下的相對(duì)溶解度Fig. 6 Relative solubility of collagen from scales and skin of Asian seabass as affected by different pH

不同pH值對(duì)尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白溶解度的影響如圖6所示。尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白溶解度受pH值的影響有著相近的趨勢(shì)。在酸性條件下，魚鱗和魚皮膠原蛋白溶解度較大，在pH 4處取得最大值，繼續(xù)增大溶液pH值，則溶解度下降。兩種膠原蛋白均在中性或堿性條件下溶解度較低，并在pH 7處取得最小值，與之前報(bào)道的羅非魚的結(jié)果相似[28]。不同pH值膠原蛋白溶解度差異可能是因?yàn)槟z原蛋白不同的分子特征和結(jié)構(gòu)構(gòu)象所造成的。

2.8.2 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)膠原蛋白溶解度的影響

圖7 尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白在不同NaCl質(zhì)量濃度條件下的相對(duì)溶解度Fig. 7 Relative solubility of collagen from scales and skin of Asian seabass as affected by NaCl concentrations

NaCl對(duì)膠原蛋白溶解度的影響如圖7所示，不同NaCl質(zhì)量濃度對(duì)尖吻鱸兩種膠原蛋白溶解度影響相近。膠原蛋白溶解度隨著NaCl質(zhì)量濃度的增大而逐漸降低，在NaCl質(zhì)量濃度為1～3 g/100 mL時(shí)，膠原蛋白具有較高且穩(wěn)定的溶解度。然而當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度超過3 g/100 mL時(shí)，膠原蛋白溶解度明顯下降，這樣的趨勢(shì)與鳙魚相似[9]。鹽離子通常以兩種不同的方式影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在低質(zhì)量濃度條件下，Na+可以與膠原蛋白穩(wěn)定結(jié)合，使膠原蛋白表面正電荷增加，蛋白質(zhì)分子之間相互排斥，分散性好，使三股螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，所以溶解度較大；然而在NaCl質(zhì)量濃度較高時(shí)，鹽離子與周圍水分子可結(jié)合形成水化膜，使蛋白質(zhì)脫水發(fā)生鹽析效應(yīng)而析出，導(dǎo)致溶解度急劇下降[31]。

通過對(duì)尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白溶解度的分析發(fā)現(xiàn)該膠原蛋白在酸性條件和低NaCl質(zhì)量濃度條件下溶解性良好。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用酶法提取尖吻鱸魚鱗和魚皮的膠原蛋白并比較其理化性質(zhì)。尖吻鱸魚皮膠原蛋白提取率（47.3 g/100 g）遠(yuǎn)高于尖吻鱸魚鱗膠原蛋白（2.3 g/100 g）；兩種膠原蛋白初步判斷均為Ⅰ型膠原蛋白，經(jīng)胃蛋白酶處理后仍保持了其完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)；DSC分析結(jié)果表明魚鱗膠原蛋白相比魚皮具有更好的熱穩(wěn)定性。另外，尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白在酸性和低鹽濃度下均具有良好的溶解性。綜上數(shù)據(jù)表明，尖吻鱸魚鱗和魚皮是工業(yè)中膠原蛋白提取潛在的新資源。

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Extraction and Characterization of Collagen from Scales and Skin of Asian Seabass

LIAO Wei, XIA Guanghua, LI Chuan, QIU Changxu, LI Yongcheng, SHEN Xuanri*
(College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

Pepsin-soluble collagen was extracted from the scales and skin of Asian seabass, and their physicochemical properties were characterized by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), amino acid composition analysis, differential scanning calorimetry (DSC), Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy, X-ray diffraction, zeta potential and solubility measurement. The yields of scale collagen and skin collagen were 2.3 and 47.3 g/100 g (dry weight), respectively. The SDS-PAGE profile showed that both collagens contained [α1(I)]2α2(I) and were characterized as type I collagen. DSC indicated that denaturation temperatures (Td) of scale and skin collagen were 37.54 and 36.74 ℃, respectively. Based on FT-IR spectra and X-ray diffraction spectra, after pepsin treatment, the triple-helical structure of the collagens was still intact. Zeta potential studies indicated that scale and skin collagen had a net charge of zero at pH 6.40 and 6.64,respectively. Both collagens exhibited high solubility under acidic and low salt concentration conditions.

Asian seabass; scale; skin; collagen; amino acid

10.7506/spkx1002-6630-201801005

TS254.1

A

1002-6630（2018）01-0036-06

廖偉, 夏光華, 李川, 等. 尖吻鱸魚鱗和魚皮膠原蛋白的提取及其理化特性分析[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(1): 36-41.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801005. http://www.spkx.net.cn

LIAO Wei, XIA Guanghua, LI Chuan, et al. Extraction and characterization of collagen from scales and skin of Asian seabass[J]. Food Science, 2018, 39(1): 36-41. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801005.http://www.spkx.net.cn

2016-10-02

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260376）

廖偉（1993—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：wei_food@163.com

*通信作者簡(jiǎn)介：申鉉日（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)和水產(chǎn)品精深加工。E-mail：shenxuanri2009@163.com