長鏈非編碼RNA CASC19在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及功能

王健君，李曉敏，何 雷，鐘樹志，彭彥霄，季 娜

皖南醫(yī)學(xué)院 1組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 2病理學(xué)教研室 3附屬弋磯山醫(yī)院病理科，安徽蕪湖 241002

·論著·

長鏈非編碼RNA CASC19在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及功能

王健君1，李曉敏2，何 雷3，鐘樹志1，彭彥霄1，季 娜1

皖南醫(yī)學(xué)院1組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室2病理學(xué)教研室3附屬弋磯山醫(yī)院病理科，安徽蕪湖 241002

目的探討長鏈非編碼RNA CASC19在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能及臨床意義。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測40對結(jié)直腸癌及相應(yīng)癌旁正常組織中CASC19的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；檢測CASC19在5株結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，應(yīng)用小干擾RNA下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中CASC19的表達(dá)，應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)研究CASC19對結(jié)直腸癌細(xì)胞體外遷移的影響。結(jié)果CASC19在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于相對應(yīng)的癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.527，P<0.000 1)，其高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.044)；下調(diào)CASC19的表達(dá)能夠抑制體外培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力。結(jié)論結(jié)直腸癌組織中CASC19的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織，CASC19的表達(dá)與患者的年齡、性別和腫瘤的部位、分化無相關(guān)性，而與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示CASC19的高表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。

CASC19；結(jié)直腸癌；遷移；長鏈非編碼RNA

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)的常見腫瘤，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，患者死亡的主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，闡明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，開發(fā)針對轉(zhuǎn)移的靶向藥物，對于提高結(jié)直腸癌患者的治愈率至關(guān)重要。然而，目前對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制仍不完全清楚。已知在這一過程中涉及到多基因的異常表達(dá)，如BRAF基因的突變[1]、激活癌基因Ras[2]、抑癌基因P53的失活[3]等，這些基因都是編碼蛋白的基因。近年來，通過基因芯片及二代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中伴有非編碼基因的異常表達(dá)。這些非編碼基因包括小RNA、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lnc-RNAs)、環(huán)狀RNA等，其中，lncRNAs是轉(zhuǎn)錄本長度超過200 bp的RNA分子，其能夠在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用[4]，參與腫瘤的增殖、凋亡、分化、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。目前，大部分結(jié)直腸癌中異常表達(dá)的lncRNAs在大腸癌侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的功能和作用機(jī)制仍屬未知。CASC19是新發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA，關(guān)于其功能研究報(bào)道較少。本研究探討CASC19在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能及其臨床意義，以進(jìn)一步揭示結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

材料和方法

標(biāo)本收集皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本共40例，包括腫瘤組織和配對的癌旁組織。所有病例均為2015年7月至2016年3月由普通外科收治的結(jié)直腸癌患者，患者術(shù)前均未接受放、化療，術(shù)后病理均證實(shí)為腺癌，且無其他腫瘤性疾病。

細(xì)胞株人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LOVO、CACO2、DLD1、HCT8、RKO及永生化的正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞FHC均購自美國American type culture collection(ATCC)公司。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃ 5%CO2孵箱內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞生長的融合度為70%～80%時(shí)，取生長狀態(tài)好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄使用TRIzol試劑提取結(jié)直腸癌組織總RNA，使用RNAisoTMPlus(Takara公司)提取細(xì)胞RNA，使用primeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用BestarTMRealtime PCR Master Mix(SYBR Green法)(DBI公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)，所用引物：CASC19：上游5’-CTCAGCATTTGCCATACTACAT- 3’，下游5’-TTCTAACCCAGGCACTCCAA- 3’；內(nèi)參GAPDH：上游5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT- 3’，下游5’- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG- 3’；引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火、延伸34 s，40個(gè)循環(huán)，檢測各樣品的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)算每個(gè)樣本的平均ΔCt，ΔCt= CtCASC19-CtGAPDH。

Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)選取結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO和CACO2進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用小干擾RNA下調(diào)CASC19，小干擾RNA序列：正義鏈5’-AGAGA-TAACACTAACAAAG- 3’，反義鏈5’- CTTTGTTAGTGTTATCTCT- 3’，小干擾RNA由蘇州吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，應(yīng)用lipo2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)干擾效率。轉(zhuǎn)染后24 h以1×105/室接種細(xì)胞，72 h取出小室，應(yīng)用吉姆薩染液染色后鏡檢穿出小室的細(xì)胞數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件(IBM)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。癌組織與配對癌旁組織中CASC19的表達(dá)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較；各細(xì)胞中CASC19的表達(dá)量分別用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)與FHC細(xì)胞株中的表達(dá)量進(jìn)行比較；癌組織中CASC19的表達(dá)水平與患者臨床資料之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法統(tǒng)計(jì)(CASC19的表達(dá)水平通過中位數(shù)分為高表達(dá)20例及低表達(dá)20例)；Transwell 實(shí)驗(yàn)采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

結(jié)直腸癌及相應(yīng)癌旁正常組織CASC19的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示40對結(jié)直腸癌組織中CASC19的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織(t=5.527，P<0.000 1)(圖1)。

圖1結(jié)直腸癌及相應(yīng)癌旁正常組織CASC19的表達(dá)

Fig1CASC19 expressions at the mRNA level in colorectal cancer and paired normal colorectal mucosa

CASC19在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系統(tǒng)計(jì)分析顯示，CASC19的表達(dá)水平與患者的年齡、性別和腫瘤的部位、分化無相關(guān)性

(P均>0.05)；而與腫瘤的大小(χ2=5.013，P=0.025)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=8.286，P=0.004)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=5.625，P=0.044)呈正相關(guān)(表1)；40例結(jié)直腸癌中8例伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中1例為肺轉(zhuǎn)移、1例為髂窩轉(zhuǎn)移、6例伴肝轉(zhuǎn)移，7例高表達(dá)CASC19，這7例中5例原發(fā)癌位于直腸、2例位于結(jié)腸。

CASC19在體外培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示CASC19的表達(dá)在CACO2、RKO、LOVO、HCT8、DLD1和FHC細(xì)胞中逐漸降低，以FHC細(xì)胞為參照，兩兩比較結(jié)果顯示，CASC19在5種結(jié)直腸癌細(xì)胞株LOVO(t=10.770，P=0.004 0)、CACO2(t=7.589，P=0.001 6)、DLD1(t=9.432，P=0.000 7)、HCT8(t=18.840，P<0.000 1)、RKO(t=8.140，P=0.001 2)中的表達(dá)均高于FHC細(xì)胞中的表達(dá)(圖2)。

表 1 結(jié)直腸癌組織中CASC19的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(n)Table 1 Correlations of clinicopathological features with CASC19 expression in colorectal cancer tissues(n)

CASC19促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移根據(jù)CASC19在5種結(jié)直腸癌細(xì)胞株的表達(dá)水平，選取RKO及CACO2細(xì)胞，應(yīng)用小干擾RNA下調(diào)CASC19的表達(dá)，應(yīng)用qRT-PCR檢測CASC19的表達(dá)，結(jié)果顯示干擾后RKO(t=56.230，P< 0.000 1)和CACO2(t=22.200，P<0.000 1)細(xì)胞中CASC19的表達(dá)顯著降低(圖3)。通過Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)檢測CASC19干擾后細(xì)胞遷移能力的改變，結(jié)果與對照組相比，CASC19表達(dá)下調(diào)后，RKO(t=8.782，P=0.000 9)和CACO2(t=14.900，P=0.000 1)的遷移能力明顯下降(圖4)。

圖2CASC19在結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞FHC中的表達(dá)

Fig2CASC19 expressions in colorectal cancer cell lines compared with the normal colorectal epithelium cell line FHC

討 論

現(xiàn)代生物學(xué)研究顯示，基因組中存在大量非編碼RNA[5]，其中許多在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。其中l(wèi)ncRNAs是轉(zhuǎn)錄本長度超過200 bp的非編碼RNA，由于其能夠在表觀遺傳水平及轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后等多水平調(diào)控基因的剪接、表達(dá)、入核、基因的穩(wěn)定性等，參與腫瘤的增殖、遷移、凋亡等過程，近幾年備受關(guān)注。

由于二代測序技術(shù)及芯片技術(shù)的發(fā)展，越來越多的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)，有研究表明在結(jié)直腸癌中也存在lncRNAs的異常表達(dá)，這些異常表達(dá)的lncRNAs的功能和機(jī)制大部分是未知的，僅有少數(shù)幾個(gè)被研究。例如，轉(zhuǎn)移相關(guān)性肺腺癌轉(zhuǎn)錄因子1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，其通過3’端的功能域促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖、遷移及浸潤，加速結(jié)直腸癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移[7]；HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA通過促進(jìn)結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)結(jié)直腸癌的浸潤及轉(zhuǎn)移，其高表達(dá)與結(jié)腸癌患者腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化、腫瘤分期呈正相關(guān)，可作為結(jié)直腸癌的預(yù)后指標(biāo)[8]；H19具有雙重作用，在結(jié)直腸癌中能被c-Myc激活，參與c-Myc下游基因的調(diào)控，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展[9]，又能發(fā)揮抑癌基因的角色，在小鼠結(jié)腸癌腫瘤模型中敲除H19基因后，腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移能力降低[10]。

圖3CASC19 小干擾RNA下調(diào)RKO和CACO2細(xì)胞中CASC19的表達(dá)

Fig3CASC19 expression was down-regulated by CASC19 small interfering RNA in RKO and CACO2 cells

A.在RKO及CACO2細(xì)胞中沉默CASC19能夠抑制細(xì)胞的遷移(吉姆薩染色)；B. RKO及CACO2細(xì)胞已遷移的細(xì)胞數(shù)

A. representative photographs of CASC19-silence inhibit cell migration in RKO and CACO2 cells (Giemsa staining)； B. the migration numbers of RKO and CACO2 cells

圖4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測CASC19對結(jié)直腸癌細(xì)胞體外遷移的影響

Fig4Effect of CASC19 on colorectal cancer cell migrationinvitroby Transwell invasion assay

CASC19是新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNAs，位于染色體8q24 區(qū)。有報(bào)道lncRNA作用機(jī)制依賴于他們的基因組位置，可以影響其附近基因的表達(dá)[11]。染色體8q24區(qū)有一重要的蛋白c-Myc，這一區(qū)域分布著很多l(xiāng)ncRNAs，有研究表明這一區(qū)域的lncRNAs可以通過c-Myc促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。例如，CCAT1可以被c-Myc 激活進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌增殖和浸潤[13]，CCAT2通過調(diào)控c-Myc轉(zhuǎn)錄和激活WNT通路促進(jìn)結(jié)直腸癌、肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移[14- 15]。CCAT1-L調(diào)控c-Myc促進(jìn)結(jié)直腸癌的浸潤[16]。通過GEO數(shù)據(jù)分析顯示結(jié)直腸癌CASC19存在異常表達(dá)。

本研究顯示CASC19的表達(dá)水平在結(jié)直腸癌組織中顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織，并且CASC19在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。CASC19在5種結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)均高于正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞FHC中的表達(dá)，Transwell結(jié)果證實(shí)下調(diào)CASC19表達(dá)后可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外遷移能力，表明CASC19發(fā)揮促進(jìn)結(jié)直腸癌生長和轉(zhuǎn)移的作用，能夠發(fā)揮癌基因的功能。對于CASC19的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)揭示。

綜上，lncRNA CASC19在結(jié)直腸癌增殖及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，可為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的思路。

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ExpressionandFunctionofLongNon-codingRNACASC19inColorectalCancer

WANG Jianjun1，LI Xiaomin2，HE Lei3，ZHONG Shuzhi1，PENG Yanxiao1，JI Na11Department of Histology and Embryology，2Department of Pathology，3Department of Pathology，
Yijishan Hospital of Wannan Medical College，Wannan Medical College，Wuhu，Anhui 241002，China

LI Xiaomin Tel：0553- 3932468，E-mail：lxm1980326@sina.com

ObjectiveTo investigate the expression， function and significance of long non-coding RNA (lncRNA) CASC19 in colorectal cancer (CRC).MethodsReal-time quantitative polymerase chain reaction was employed to determine the expression of CASC19 in 40 paired samples from CRC surgical specimens and 5 CRC cell lines. The correlations of CASC19 expression with clinicopathologic parameters were analyzed. Transwell assay was applied to detect the migration ability of CRC cells after the CASC19 expression was knocked down by small interfering RNA.ResultsThe expression of CASC19 in colorectal cancer was significantly higher than those in adjacent normal mucosa tissues (t=5.527，P<0.000 1) and was associated with metastasis (P=0.044). Knockdown of CASC19 expression in CRC inhibited the migration ability of CRCinvitro.ConclusionsThe expression of CASC19 increases in CRC. CASC19 expression is not associated with age， gender， or tumor site/differentiation but with tumor size， lymph node metastasis， and distant metastasis， suggesting high CASC19 expression may promote CRC metastasis.

CASC19；colorectal cancer；migration；long non-coding RNA

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：756-761

李曉敏 電話：0553- 3932468，電子郵件：lxm1980326@sina.com

皖南醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目培育基金(WK2016Z01)、皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金自然科學(xué)類(WK201619)和安徽省高校自然科學(xué)基金 (KJ2017A250) Supported by the Wannan Medical College Key Research Projects (WK2016Z01)，the Natural Sciences Youth Foundation of Wannan Medical College (WK201619)，and the Natural Science Foundation of the Anhui Provincial High-Education Institutions(KJ2017A250)

R735.3

A

1000- 503X(2017)06- 0756- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.004

2016- 12- 09)