基于三維打印技術(shù)的異煙肼/利福平雙載藥聚乳酸環(huán)形植入劑的制備

吳 貴，伍衛(wèi)剛，周劍波，鄭啟新

1福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院骨科，福州 350005 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 武漢協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022

·論著·

基于三維打印技術(shù)的異煙肼/利福平雙載藥聚乳酸環(huán)形植入劑的制備

吳 貴1，伍衛(wèi)剛2，周劍波2，鄭啟新2

1福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院骨科，福州 3500052華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 武漢協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022

目的探討基于三維打印技術(shù)制備異煙肼/利福平/聚乳酸環(huán)形緩釋制劑的可行性，并對(duì)打印的緩釋劑的體外釋放性能及生物相容性進(jìn)行檢測(cè)。方法將聚乳酸制成大小為75～100 μm的粉末，異煙肼和利福平藥物分別溶解于有機(jī)溶劑中作為三維打印的黏結(jié)液，三維打印機(jī)通過層層黏結(jié)的原理，將聚乳酸逐層黏結(jié)成環(huán)形植入劑，用動(dòng)態(tài)浸泡的方法研究該植入劑的體外釋放特征，通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)植入劑的細(xì)胞相容性。結(jié)果將異煙肼或利福平溶解于黏結(jié)液中，以聚乳酸為載藥基質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)多載藥緩釋植入劑的三維打??；在電鏡下藥物成巢狀分布于植入劑內(nèi)。雙載藥環(huán)形植入劑在體外能夠持續(xù)釋放32 d以上，在體外釋放32 d測(cè)得的異煙肼和利福平的濃度高于藥物的最低有效抑菌濃度。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以及體外直接接觸實(shí)驗(yàn)表明該植入劑無(wú)細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性。結(jié)論所配制的載藥聚乳酸三維打印方法能夠?qū)崿F(xiàn)雙載藥植入劑的制備，為抗結(jié)核藥物的局部緩釋制劑的制備提供了新方法。

異煙肼；利福平；左旋聚乳酸；植入劑；三維打印

三維打印技術(shù)由美國(guó)麻省理工學(xué)院Sachs等[1]首先提出，它的基本原理是打印機(jī)通過粉末層層堆積，逐層黏結(jié)的方法，根據(jù)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的三維立體模型，在程序控制下，將粉末黏結(jié)成所設(shè)計(jì)的立體實(shí)物?？焖俪尚渭夹g(shù)方法簡(jiǎn)單，無(wú)需造模，能夠較精確的控制模型的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。在醫(yī)藥領(lǐng)域，學(xué)者們開始探索該技術(shù)在制備組織工程支架、個(gè)性化內(nèi)植物或復(fù)雜結(jié)構(gòu)的局部植入劑等方面的應(yīng)用[2- 4]。藥物的局部緩釋技術(shù)將藥物直接且持續(xù)的作用于病灶部位，提高藥物的局部治療作用，而血藥濃度較低，減少藥物的全身毒副作用。骨與關(guān)節(jié)結(jié)核通常需要多藥聯(lián)合的長(zhǎng)療程化療，多藥聯(lián)合緩釋植入劑是理想的抗結(jié)核藥物。普通緩釋片劑或球形植入劑隨著藥物的溶出，藥物釋放面積下降，同時(shí)藥物溶出距離變大從而藥物的溶出速度逐漸下降[5]。Kim[5]研制了特殊的中空的環(huán)形骨架片結(jié)構(gòu)，能夠在一定程度上代償藥物有效釋藥面積的減少，使藥物釋放過程更加平穩(wěn)。既往多層片劑主要采用壓片技術(shù)制備，然而這種制備方法容易出現(xiàn)層與層脫落的現(xiàn)象[6]，而三維打印技術(shù)采用一體成型的方法，能夠克服壓片技術(shù)制備多層片工藝上的缺點(diǎn)。本研究嘗試?yán)萌S打印技術(shù)，將異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RIF)分別溶入三維打印的黏結(jié)液中，并用體內(nèi)可降解的聚乳酸為載藥基質(zhì)，探討三維打印技術(shù)制備多層多載藥緩釋片的可行性，及其體外的藥物釋放特征和它的細(xì)胞相容性。

材料和方法

材料與設(shè)備左旋聚乳酸(poly L-lactic acid，PLLA)(相對(duì)分子質(zhì)量 100 000，成都迪康中科生物醫(yī)學(xué)材料有限公司)；異煙肼及利福平原料藥(臺(tái)州天瑞化工有限公司)；丙酮(上海試一化學(xué)試劑有限公司，AR)；乙醇(上海試一化學(xué)試劑有限公司，AR)；CCK- 8檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；聚乙烯吡咯烷酮(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，AR)；LTY型立體打印快速成形機(jī)(上海富奇凡機(jī)電科技有限公司)；臺(tái)式恒溫震蕩器(上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；日立L- 2000高效液相色譜儀；粉碎機(jī)(南京龍立天目超微粉體技術(shù)公司)。

黏結(jié)液的配制及聚乳酸粉末的加工黏結(jié)液由有機(jī)溶劑構(gòu)成，其中丙酮、乙醇和水按20∶ 4∶ 5的體積比配置，并在其中加入適量甘油、聚乙烯吡咯烷酮及十二烷基硫酸鈉等助劑，優(yōu)化有機(jī)溶劑從墨盒中噴出。將利福平和異煙肼原料藥分別溶解于所配制的有機(jī)溶劑中制成濃度為150 g/L的含藥黏結(jié)液。上述載藥黏結(jié)液和空白黏結(jié)液分別注入空打印墨盒中作為三維打印的墨水。干燥的聚乳酸粉末用粉碎機(jī)充分粉碎后，篩選出粒徑為75～100 μm的粉末，使粉末粒徑均勻，將其保存于P2O5真空干燥儀中干燥備用。

植入劑的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)的植入劑為中空的環(huán)形柱狀結(jié)構(gòu)，植入劑分為3層，總高度為6.8 mm，上下表層為阻釋層，其厚度各1 mm，中間分兩層，分別含有異煙肼和利福平，每個(gè)載藥層厚度為2.4 mm。植入劑外徑為9 mm，內(nèi)徑為3 mm(圖1)。

三維打印過程在工作平臺(tái)上均勻鋪上一層經(jīng)過篩選的粒徑合適的聚乳酸粉末，在控制軟件中輸入植入劑模型參數(shù)，打印機(jī)自動(dòng)將聚乳酸粉末鋪成200 μm層厚的粉末層，并在粉末層上根據(jù)所設(shè)定的環(huán)形圖案噴灑上黏結(jié)劑，每層重復(fù)噴灑黏結(jié)液15次，以增加含藥量和黏結(jié)強(qiáng)度。當(dāng)完成一層黏結(jié)后，三維打印機(jī)下降200 μm，重新鋪上粉末，打印機(jī)重新將聚乳酸粉末鋪平，再次于粉末層的同一位置噴灑出環(huán)形圖案的黏結(jié)劑。這樣可將兩層聚乳酸粉末黏結(jié)在一起，重復(fù)該過程，預(yù)先設(shè)置的模型便可通過層層疊加的方式，最后打印出所需要形狀的植入劑(圖2)。打印順序?yàn)椋?/p>

圖1植入劑結(jié)構(gòu)示意圖

Fig1Structure diagram of the implant

阻釋層-載異煙肼層-載利福平層-阻釋層。其中上下阻釋層各用空白黏結(jié)液打印5層，厚1 mm；載藥層分別用含異煙肼和利福平的黏結(jié)液各打印12層，厚分別為2.4 mm。打印結(jié)束后，植入劑在粉末中靜置30 min，干燥后去除多余的粉末。用丙酮噴霧加強(qiáng)植入劑表層的黏結(jié)。

體外生物相容性檢測(cè)

鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：選取4～6周雌雄不限SD大鼠，斷頸處死后用70%酒精浸泡10 min；分離大鼠雙側(cè)后肢股骨及脛骨，用PBS液沖洗剝離軟組織；剪斷骨端，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基將骨髓沖至10 ml無(wú)菌離心管中。培養(yǎng)基總用量10 ml。將細(xì)胞懸液分離液加入15 ml離心管中，并分成等量的兩管。室溫下以100×g離心15 min。棄上清分別加入5 ml培養(yǎng)基并用滴管吹打使細(xì)胞懸浮。將上面細(xì)胞懸液接種于6孔板上，于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24 h后對(duì)半換液，每3天換1次液，直到細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)消化傳代。

細(xì)胞毒性檢測(cè)(CCK- 8法)：根據(jù)ISO10993- 12的標(biāo)準(zhǔn)制備植入劑浸提液，將植入劑以0.2 kg/L的比例浸泡入胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中在37℃恒溫箱中浸提1 d，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，取濾液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩⑹蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml，以每孔200 μl，接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)1 d，使細(xì)胞貼壁。各取8孔作為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分別用200 μl制備的浸提液培養(yǎng)24及48 h，對(duì)照組用普通DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，分別用DMEM和CCK- 8試劑的混合液(10∶ 1)100 μl替換各培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基。于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔的吸光度A450值。

直接接觸實(shí)驗(yàn)：將環(huán)氧乙烷消毒過的植入劑，切割成2 mm×2 mm×2 mm的小方塊。在持續(xù)攪拌的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮液中吸取2 ml細(xì)胞懸浮液，注入培養(yǎng)皿內(nèi)，共6孔，同時(shí)取3孔作為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)動(dòng)器皿，使細(xì)胞均勻分散在每只器皿中。將培養(yǎng)皿置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至近匯合。觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。將植入劑置于實(shí)驗(yàn)孔中。繼續(xù)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24及72 h后，在倒置相差顯微鏡中觀察植入劑周圍細(xì)胞的形態(tài)和增殖情況。

體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)植入劑的藥物溶出實(shí)驗(yàn)在PBS(pH=7.4)中進(jìn)行。將5 ml PBS液裝入玻璃瓶中，植入劑用細(xì)絲線捆綁后懸掛于釋放介質(zhì)內(nèi)。將該玻璃瓶置于37℃恒溫振蕩床內(nèi)，并調(diào)整振蕩頻率為100 次/min。分別于2、4 d以及以后每4天取樣1次直到第32天。在取樣時(shí)間點(diǎn)吸取2 ml測(cè)濃度，移除剩余的溶液，并重新更換5 ml PBS液。用反向高效液相色譜法，利用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)檢測(cè)樣本的濃度。甲醇∶磷酸氫二鈉(0.02 mol/L，用磷酸調(diào)pH至4.5)(75∶ 25)為流動(dòng)相，紫外光檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速為1 ml/min。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其中細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A.打印機(jī)側(cè)面觀，打印機(jī)在平臺(tái)上鋪聚乳酸粉末層；B.打印機(jī)噴頭在粉末層上噴涂黏結(jié)劑；C.打印機(jī)正面觀，聚乳酸粉末層上噴出環(huán)形黏結(jié)液圖形

A.lateral view of the printer and poly L-lactic acid powder was spread on the platform of the printer；B.binding liquid was injected on the powder through the printing head；C.anterior view of the printer and annulus patterns were printed on the poly L-lactic acid powder

圖2三維打印原理圖

Fig2Diagram of 3D printing

結(jié) 果

植入劑的結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)制備的INH/RIF/PLLA環(huán)形植入劑粉末黏結(jié)較緊密，層與層之間無(wú)斷開(圖3A)。經(jīng)過外圍噴涂丙酮黏結(jié)液處理后，表面黏結(jié)緊密，表面無(wú)粉末脫落現(xiàn)象，植入劑體積略有收縮(0.2～0.5 mm)。植入劑在電鏡下觀察顯示，阻釋層表面結(jié)構(gòu)致密無(wú)明顯的孔隙，且表面無(wú)異煙肼及利福平結(jié)晶附著(圖3B)；在含藥層，可見許多直徑為50～100 μm的微孔，微孔在植入劑表面分布較均勻，在微孔中包含著大量的藥物結(jié)晶，結(jié)晶嵌入聚乳酸載藥基質(zhì)中(圖3C)。

生物相容性

細(xì)胞毒性：INH/RIF/PLLA環(huán)形植入劑與細(xì)胞混合培養(yǎng)24及48 h后，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)植入劑組與對(duì)照組的A450值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[24 h：(0.58±0.03)比(0.50±0.05)，t=2.24，P=0.07；48 h：(0.53±0.03)比(0.53±0.04)，t=-0.75，P=0.94]。

直接接觸實(shí)驗(yàn)結(jié)果：NH/RIF/PLLA環(huán)形植入劑與鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)3 d，結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)良好，植入劑周圍的細(xì)胞呈梭形，圍繞植入劑周圍生長(zhǎng)；共培養(yǎng)24 h時(shí)植入劑周圍細(xì)胞較稀疏，呈均勻分布，未發(fā)現(xiàn)植入劑周圍有細(xì)胞畸形或變性區(qū)域；培養(yǎng)72 h時(shí)植入劑周邊的細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞間距縮小，緊密圍繞植入劑周圍生長(zhǎng)(圖4)。

箭頭：異煙肼

arrows：isoniazid

A.植入劑的大體相；B.阻釋層的微觀結(jié)構(gòu)；C.含藥層的微觀結(jié)構(gòu)

A.appearance of the implants；B.microstructure of the barrier layer；C.microstructure of the drug-loaded layer

圖3植入劑的結(jié)構(gòu)

Fig3Structure of the implants

黑色部分為異煙肼/利福平/聚乳酸植入劑

The black area was isoniazid/rifampicin/poly L-lactic acid implant

A.共培養(yǎng)24 h時(shí)的細(xì)胞形態(tài)；B.共培養(yǎng)72 h時(shí)的形態(tài)

A.cellular morphology after co-culture for 24 hours；B.cellular morphology after co-culture for 72 hours

圖4倒置相差顯微鏡觀察植入劑周圍細(xì)胞的形態(tài)

Fig4Cellular morphology around the implant under the inverted phase contrast microscope

體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果植入劑的體外釋放實(shí)驗(yàn)觀察了32 d。在最初的第2和4天藥物溶出量較多，INH累積溶出量為(46.85±11.45)mg/L，RIF累積溶出量為(40.25±8.20)mg/L。在隨后的時(shí)間里，植入劑內(nèi)的藥物逐漸緩釋，溶出的量逐漸下降，到第32天時(shí)，異煙肼和利福平的濃度均高于1 mg/L(圖5)。并且植入劑在浸泡的過程中未出現(xiàn)層與層脫落的現(xiàn)象。

討 論

三維打印技術(shù)是目前研究較為熱門的增材制造技術(shù)。根據(jù)打印機(jī)不同的工作原理可分為選擇性激光燒結(jié)技術(shù)、光固化成形技術(shù)以及熔融堆積成形技術(shù)等[7]。然而目前研究較為成熟的三維打印技術(shù)所制備的材料通常由單一組份構(gòu)成，例如用選擇性激光燒結(jié)技術(shù)制備的鈦合金支架[8]、熔融堆積成形技術(shù)制備的聚合物材料等[9]。然而隨著研究的深入，學(xué)者們逐漸開始對(duì)復(fù)合材料的三維打印展開研究，以實(shí)現(xiàn)組織器官和復(fù)合材料等非單一成份物件的三維打印[10- 11]。骨與關(guān)節(jié)結(jié)核病灶周圍常發(fā)生栓塞性動(dòng)脈炎，病灶內(nèi)血供差或成為無(wú)血供區(qū)，經(jīng)靜脈或口服給藥抗結(jié)核通常效果不理想，在病灶清除手術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合局部應(yīng)用抗結(jié)核藥物緩釋制劑有利于骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的治療。其中異煙肼和利福平是抗結(jié)核治療的一線用藥，可抑制或殺滅結(jié)核桿菌。本研究利用三維打印技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，以體內(nèi)可降解的聚乳酸為載藥基質(zhì)，通過熔融堆積成形技術(shù)制備載INH/RIF的抗結(jié)核植入劑。

圖5異煙肼/利福平/聚乳酸植入劑的藥物體外緩釋曲線圖

Fig5Drug release curve of isoniazid/rifampicin/poly L-lactic acid implantinvitro

聚乳酸具有良好的生物相容性，是目前已被批準(zhǔn)的可用于人體的可降解有機(jī)材料[12]。它被用于制造成多種醫(yī)用可吸收植入物，并且廣泛應(yīng)用于臨床，例如可降解骨螺釘[13]、可降解的醫(yī)用防黏連膜[14]等。聚乳酸易溶于有機(jī)溶劑，溶劑揮發(fā)干燥后可固化成具有一定強(qiáng)度的固體實(shí)物，因此符合熔融堆積成形技術(shù)對(duì)粉末的要求。此外三維打印技術(shù)還要求粉末具有良好的流動(dòng)性[15]，本研究將聚乳酸粉末加工成微小顆粒，并選用其中粒徑為75～100 μm的顆粒，實(shí)驗(yàn)過程可見該粉末具有良好的流動(dòng)性，能夠順利完成200 μm層厚的鋪粉。將異煙肼及利福平溶解于有機(jī)溶劑黏結(jié)液中通過墨盒噴涂能夠逐層將聚乳酸粉末黏結(jié)，并經(jīng)過逐層累積最終打印出中空環(huán)形植入劑。該植入劑在顯微鏡下可見顆粒狀的聚乳酸粉末被溶解并再干燥后呈薄片狀，INH/RIF則呈巢穴狀均勻分布于植入劑內(nèi)。而植入劑上下阻釋層則致密無(wú)孔隙，用以預(yù)防因藥物自上下表層釋放而影響緩釋效果。

1965年，Cleave[16]提出一個(gè)數(shù)學(xué)理論，認(rèn)為如果在環(huán)形的片劑中間制備出一個(gè)或多個(gè)孔隙，有可能使片劑在溶解過程中保持表面積相對(duì)恒定，從而使藥物釋放更加平穩(wěn)。Sundy和Danckwerts[6]用自制的沖壓機(jī)制備羥丙基甲基纖維素復(fù)合明膠多層環(huán)形緩釋片，體外緩釋5 h，結(jié)果顯示該緩釋片初期表現(xiàn)出突釋效應(yīng)，隨后藥物逐漸從多層緩釋片中釋放，表明多層環(huán)形片結(jié)構(gòu)能夠在一定程度上使藥物釋放更加平穩(wěn)，然而該研究的緩釋時(shí)間持續(xù)較短，而結(jié)核及腫瘤等藥物的局部治療時(shí)間要求達(dá)到幾周甚至幾個(gè)月。本研究用體內(nèi)降解周期較長(zhǎng)的聚乳酸為載藥基質(zhì)，用三維打印技術(shù)制備長(zhǎng)效多層環(huán)形植入劑，本研究緩釋實(shí)驗(yàn)的初期可見植入劑較快地緩釋出較多的異煙肼和利福平，這可能與表層藥物的快速溶蝕有關(guān)，而隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物持續(xù)從植入劑中釋放，且釋放的速度逐漸下降，在第32天觀察終末時(shí)藥物的濃度仍高于1 mg/L，均高于兩種抗結(jié)核藥物在體內(nèi)最低的有效作用濃度(異煙肼：0.025～0.05 mg/L；利福平：0.06～0.25 mg/L)。用沖壓機(jī)制備多層片，層與層之間并非一體成形，因此用該種方法沖壓制備長(zhǎng)效的緩釋植入劑有可能出現(xiàn)層與層脫落的現(xiàn)象，而破壞了植入劑的結(jié)構(gòu)。三維打印技術(shù)通過逐層黏結(jié)的方法，在不同層連接處也達(dá)到一樣的黏結(jié)效果，因此能夠更加穩(wěn)固的黏結(jié)。在緩釋實(shí)驗(yàn)中層與層未見有脫落的現(xiàn)象。

本研究使用的黏結(jié)劑及載藥基質(zhì)中含有較多的化學(xué)物質(zhì)，因此在體內(nèi)應(yīng)用前有必要對(duì)植入劑的毒性進(jìn)行檢測(cè)。將植入劑浸提液用于培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比細(xì)胞的數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。植入劑與細(xì)胞共培養(yǎng)3 d，植入劑周圍細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)良好，隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，植入劑周圍的細(xì)胞數(shù)量逐漸增殖。植入劑與細(xì)胞之間未出現(xiàn)無(wú)細(xì)胞條帶，表明本研究所制備的植入劑在體外具有良好的生物相容性，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。

綜上，本研究采用三維打印技術(shù)以聚乳酸為載藥基質(zhì)制備異煙肼/利福平雙載藥緩釋植入劑是一種可行的方法。環(huán)形植入劑在體外能夠達(dá)到1個(gè)月以上的緩釋作用，并且所制備的植入劑具有良好細(xì)胞相容性。聚乳酸是制備體內(nèi)可降解緩釋植入劑的良好載體，將不同的藥物溶入黏結(jié)液中，可以制備不同治療功能的緩釋制劑，本研究為制備長(zhǎng)效緩釋植入制劑提供新的方法。

[1] Sachs E，Cima M，Cornie J，et al. Three-dimensional printing：the physics and implications of additive manufacturing[J].CIRP Annals，1993，42(1)：257- 260. doi：10. 1016/S0007- 8506(07)62438- X.

[2] He J，Xia P，Li D. Development of melt electrohydrodynamic 3D printing for complex microscale poly (epsilon-caprolactone) scaffolds[J].Biofabrication，2016，8(3)：035008. doi：10. 1088/1758- 5090/8/3/035008.

[3] Xiao JR，Huang WD，Yang XH，et al. En bloc resection of primary malignant bone tumor in the cervical spine based on 3-dimensional printing technology[J].Orthop Surg，2016，8(2)：171- 178. doi：10. 1111/os. 12234.

[4] Schwam ZG，Chang MT，Barnes MA，et al. Applications of 3-dimensional printing in facial plastic surgery[J].J Oral Maxillofac Surg，2016，74(3)：427- 428. doi：10. 1016/j. joms. 2015. 10. 016.

[5] Kim CJ. Release kinetics of coated，donut-shaped tablets for water soluble drugs[J].Eur J Pharm Sci，1999，7(3)：237- 242. doi：10. 1016/S0928- 0987(98)00029- 3.

[6] Sundy E，Danckwerts MP. A novel compression-coated doughnut-shaped tablet design for zero-order sustained release[J].Eur J Pharm Sci，2004，22(5)：477- 485. doi：10. 1016/j. ejps. 2004. 05. 004.

[7] Malik HH，Darwood ARJ，Shaunak S，et al. Three-dimensional printing in surgery：a review of current surgical applications[J].J Surg Res，2015，199(2)：512- 522. doi：10. 1016/j. jss. 2015. 06. 051.

[8] Wang L，Cao T，Li X，et al. Three-dimensional printing titanium ribs for complex reconstruction after extensive posterolateral chest wall resection in lung cancer[J].J Thorac Cardiovasc Surg，2016，152(1)：e5- e7. doi：10. 1016/j. jtcvs. 2016. 02. 064.

[9] Melocchi A，Parietti F，Maroni A，et al. Hot-melt extruded filaments based on pharmaceutical grade polymers for 3D printing by fused deposition modeling[J].Int J Pharm，2016，509(1- 2)：255- 263. doi：10. 1016/j. ijpharm. 2016. 05. 036.

[10] Rezende RA，Kasyanov V，Mironov V，et al. Organ printing as an information technology[J].Procedia Engineering，2015，110(Supplement C)：151- 158. doi：10. 1016/j. proeng. 2015. 07. 023.

[11] Kang HW，Lee SJ，Ko IK，et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity[J].Nat Biotechnol，2016，34(3)：312- 319. doi：10. 1038/nbt. 3413.

[12] Qiao T，Song P，Guo H，et al. Reinforced electrospun PLLA fiber membrane via chemical crosslinking[J].Eur Polym J，2016，74(Supplement C)：101- 108. doi：10. 1016/j. eurpolymj. 2015. 11. 012.

[13] Oba Y，Yasue A，Kaneko K，et al. Comparison of stability of mandibular segments following the sagittal split ramus osteotomy with poly-l-lactic acid (PLLA) screws and titanium screws fixation[J].Orthod Waves，2008，67(1)：1- 8. doi：10. 1016/j. odw. 2007. 10. 001.

[14] Lee JH，Go AK，Oh SH，et al. Tissue anti-adhesion potential of ibuprofen-loaded PLLA-PEG diblock copolymer films[J].Biomaterials，2005，26(6)：671- 678. doi：10. 1016/j. biomaterials. 2004. 03. 009.

[15] Butscher A，Bohner M，Roth C，et al. Printability of calcium phosphate powders for three-dimensional printing of tissue engineering scaffolds[J].Acta biomaterialia，2012，8(1)：373- 385. doi：10. 1016/j. actbio. 2011. 08. 027.

[16] Cleave JP. Some geometrical considerations concerning the design of tablets[J].J Pharm Pharmacol，1965，17(11)：698- 702. doi：10. 1111/j. 2042- 7158. 1965. tb07591. x.

FabricationofIsoniazid/Rifampicin/PolyL-lacticAcidDonut-shapedImplantsviaThreeDimensionalPrintingTechnique

WU Gui1，WU Weigang2，ZHOU Jianbo2，ZHENG Qixin2

1Department of Orthopedics，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350005，China2Department of Orthopedics，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

WU Gui Tel：0591- 87982105，E-mail：wugui_1985@sina.com

ObjectiveTo investigate the possibility of manufacturing dual-drug loaded isoniazid/rifampicin/poly L-lactic acid (PLLA) implant with donut-shaped structure via three-dimensional (3D) printing technique and study the drug release characteristic and biocompatibility of the implantinvitro.MethodsPLLA was crushed into particles with diameters around 75- 100 μm.Isoniazid and rifampicin bulk drugs were dissolved into the organic dissolvent respectively to be the binding liquid.The 3D printing machine fabricated the donut-shaped implant via binding the PLLA powder layer by layer.Dynamic socking method was used to study theinvitrorelease characteristics，and cell culture experiment was used to test the cytocompatibility of the implant.ResultsPLLA slow-release implants were made by using the PLLA powder as matrix and isoniazid/rifampicin organic solvent as binding liquid through 3D printing.The drugs in the implants distributed in nest under electron microscope.The concentrations of both drugs were still higher than the lowest effective bacteriostasis concentration after release for 32 days.Cytotoxicity and direct contact tests indicated that the implants had rare cytotoxicity and favorable biocompatibility.ConclusionThe donut-shaped implants can be successfully fabricated using the 3D printing method，which offers a new method for the manufacturing of topical slow-release anti-tuberculosis drugs.

isoniazid；rifampicin；poly L-lactic acid；implant；three-dimensional printing

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：743-748

吳 貴 電話：0591- 87982105，電子郵件：wugui_1985@sina. com

R978.3

A

1000- 503X(2017)06- 0743- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.002

2017- 04- 24)