當歸中混入不同比例獨活HPLC特征指紋圖譜研究

張平 馬瀟 王曉琳 李冬華 宋平順

摘要：目的 建立測定當歸中按不同比例摻入獨活的HPLC分析方法及特征指紋圖譜，為HPLC特征指紋圖譜法甄別當歸藥材摻偽樣品提供依據(jù)。方法 采用Agilent TC-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈（A）-0.05%磷酸（B）為流動相，梯度洗脫（0～20 min，95%～75%B；20～60 min，75%～65%B；60～80 min，65%～5%B），流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30 ℃。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》對當歸、獨活及摻偽樣品的HPLC圖譜進行比較分析。結(jié)果 當歸和獨活色譜圖中各色譜峰分離良好，HPLC指紋圖譜中有11個峰可作為區(qū)別點，其中7號峰為阿魏酸，32號峰為蛇床子素，34號峰為二氫歐芹醇當歸酸酯。結(jié)論 本方法快速、簡單易行，能夠全面反映當歸藥材品質(zhì)，可以明確判斷當歸中是否混入獨活。

關(guān)鍵詞：當歸；獨活；高效液相色譜法；指紋圖譜；摻偽

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.018

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）11-0083-04

Abstract： Objective To establish HPLC analysis methods and fingerprint of different proportions of Angelicae Pubescentis Radix in Angelicae Sinensis Radix； To use HPLC fingerprint method to identify the adulteration of Angelicae Pubescentis Radix in Angelicae Sinensis Radix. Methods Agilent TC-C18 column （5 μm， 4.6 mm × 250 mm） was adopted. Acetonitrile （A） - 0.05% phosphoric acid （B） was the mobile phase， and the gradient elution （0–20 min， 95%–75%B； 20–60 min， 75%–65%B； 60–80 min， 65%–5%B） was used； The flowrate was 1 mL/min； Detection wavelength was 254 nm； Column temperature was 30 ℃. The HPLC spectra of Angelicae Sinensis Radix， Angelicae Pubescentis Radix and adulterated samples were compared and analyzed by using TCM chromatogram fingerprint similarity evaluation system. Results Angelicae Sinensis Radix and Angelicae Pubescentis Radix showed good chromatographic peaks in chromatogram separation. 11 peaks in HPLC fingerprint could be used as the mark， including 7th peak for ferulic acid， 32th peak for osthole， and 34th peak for columbianadin. Conclusion This method is rapid， simple and feasible， can fully reflect the quality of Angelicae Sinensis Radix and clearly identify whether Angelicae Pubescentis Radix is adulterated in Angelicae Sinensis Radix.

Keywords： Angelicae Sinensis Radix； Angelicae Pubescentis Radix； HPLC； fingerprint； adulteration

獨活為傘形科植物重齒毛當歸Angelica pubescens Maxim.F.biserrata Shan et Yuan的干燥根，具有祛風除濕、通痹止痛功效[1]。當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便功效[1]。獨活主要含有蛇床子素、二氫歐山芹素、二氫歐山芹醇、歐前胡素、異歐前胡素等成分，當歸主要含揮發(fā)油（藁本內(nèi)酯）、有機酸（阿魏酸、亞油酸、硬脂酸）、多糖和黃酮等[2-5]。

當歸和獨活藥材來源相近、外觀性狀差異不大[6]，藥材商品流通和臨床用藥時極易混淆。甄別藥材市場上摻偽現(xiàn)象，傳統(tǒng)的性狀鑒別存在很大困難，中藥指紋圖譜技術(shù)則以其特征性和完整性而具有明顯優(yōu)勢[7]，因此，建立當歸和獨活藥材指紋圖譜對甄別藥材真?zhèn)尉哂兄匾饬x[8-10]。本研究通過HPLC-DAD建立當歸、獨活及當歸中按不同比例摻入獨活的指紋圖譜，從而對當歸與獨活進行鑒別，在藥品檢驗及臨床應(yīng)用中對摻假樣品進行甄別，保證用藥安全。

1 儀器與試藥

Waters e2998高效液相色譜儀（2998 DAD檢測器，Empower3工作站），美國Waters公司；ME-204型分析天平，梅特勒公司；XMTD-4000恒溫水浴鍋，北京永光明儀器有限公司。

蛇床子素對照品（批號110822-201308）、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品（批號111583-200402）、阿魏酸對照品（批號110773-201313）、歐前胡素對照品（批號110826-201616），中國食品藥品檢定研究院；當歸、獨活樣品各5批，均由本課題組在甘肅、四川、湖北等地采集或購買，經(jīng)甘肅省藥品檢驗研究院宋平順主任藥師鑒定，分別為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根、傘形科植物重齒毛當歸Angelica pubesce Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根。乙腈為色譜純（天津市康科德科技有限公司），水為自制純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 摻偽樣品的制備

取當歸、獨活樣品，粉碎，置自封袋中備用。取當歸樣品粉末10 g，共5份，分別置燒杯中，放入分析天平稱量，分別精密加入0.5、1、2、3、4 g獨活樣品粉末，混勻，制成分別含5%、10%、20%、30%、40%獨活的摻偽當歸樣品，備用。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液

精密稱取樣品1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液

精密稱取蛇床子素、歐前胡素、阿魏酸、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品適量，加甲醇制成每1 mL含蛇床子素、歐前胡素、阿魏酸、二氫歐山芹醇當歸酸酯80 μg的混合溶液，即得。

2.3 色譜條件

采用Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸（B）[4-5，11-12]，梯度洗脫（見表2），流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗

取對照品溶液、供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣，結(jié)果表明各色譜峰分離度較好，峰形對稱，專屬性強。

2.4.2 精密度試驗

精密吸取當歸供試品溶液，連續(xù)進樣5次，以7號峰阿魏酸為內(nèi)參比峰，測得各共有峰的相對保留時間RSD為0.1%～0.5%，相對峰面積RSD為1.5%～3.0%。精密吸取獨活供試品溶液，連續(xù)進樣5次，以32號峰蛇床子素為內(nèi)參比峰，測得各共有峰的相對保留時間RSD為0.3%～1.0%，相對峰面積RSD為2.0%～3.5%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜測定要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取當歸供試品溶液，于制備后0、4、8、16、24 h進樣分析，測得各共有峰的相對保留時間RSD為0.2%～1.5%，相對峰面積RSD為1.1%～2.8%。取獨活供試品溶液，于制備后0、4、8、16、24 h進樣分析，測得各共有峰的相對保留時間RSD為0.5%～2.0%，相對峰面積RSD為1.6%～3.2%。表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復性試驗

精密稱取當歸樣品5份，按“2.2.1”項下方法平行制備供試品溶液，分別進樣并記錄。測得各共有峰的相對保留時間RSD為0.1%～0.4%，相對峰面積的RSD為0.7%～2.8%。符合指紋圖譜要求。

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 指紋圖譜的建立與主要色譜峰的確認

按“2.3”項下色譜條件分別對當歸及獨活供試品溶液進行測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件，分別對當歸和獨活進行色譜峰匹配，生成指紋圖譜（見圖1、圖2），并計算各批次樣品指紋圖譜與各自生成的對照圖譜的相似度，結(jié)果當歸和獨活的指紋圖譜相似度均在0.9以上。

在同樣色譜條件下測定蛇床子素、歐前胡素、阿魏酸、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品，并與當歸、獨活樣品指紋圖譜中相應(yīng)色譜峰進行比較，結(jié)果表明，當歸指紋圖譜中7號峰的保留時間及紫外光譜與阿魏酸吻合，7號特征峰為阿魏酸。獨活指紋圖譜中32、34號峰的保留時間及紫外光譜與蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯吻合，32、34號特征峰分別為蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯。對照品圖譜見圖3。

2.5.2 當歸、獨活及摻偽樣品指紋圖譜比較

同一色譜條件下的當歸、獨活HPLC指紋圖譜見圖4、圖5，其中當歸共有峰26個，獨活共有峰34個。通過對當歸、獨活指紋圖譜峰進行比較，發(fā)現(xiàn)11個峰有較為明顯的不同。其中，當歸在49～58 min時間段無峰，獨活有5個峰。變化最明顯的3處為49.7、54.8、65.4 min。

分別用蛇床子素、歐前胡素、阿魏酸、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品對指紋圖譜進行指認，最終蛇床子素、阿魏酸、二氫歐山芹醇當歸酸酯3個成分得以確認。指紋圖譜色譜峰中未能指認出歐前胡素，可能由于歐前胡素在樣品中含量較低，未能檢出。

當歸中加入不同比例獨活指紋圖譜見圖6?？梢钥闯?，49～58 min時間段的5個峰均按所加獨活的比例逐漸增大。同時，74.9 min蛇床子素峰、76.2 min二氫歐山芹醇當歸酸酯峰也按加入獨活的比例依次增大，這2個成分是獨活的特有成分。可見，本方法可以很好地判斷當歸中是否混入了獨活，且混入5%獨活藥材即可定性、定量判斷。

3 討論

本試驗對制備供試品溶液時溶劑和提取方法的選擇進行了考察，分別選用甲醇、乙醇回流提取，甲醇、乙醇超聲提取。對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇回流提取所得圖譜的色譜峰數(shù)較多、特征性強，故供試品溶液制備采用甲醇回流提取法。

本試驗在190～400 nm波長掃描，同時分別設(shè)置了254、280、320、330 nm波長，通過對各成分紫外吸收圖譜的分析，綜合考慮基線、色譜峰數(shù)目、峰形和信號響應(yīng)強度，最終確定254 nm為最佳檢測波長。

本試驗對流動相的組成及洗脫方式進行了優(yōu)化。分別用甲醇-水、甲醇-水（含乙酸）、甲醇-水（含磷酸）、乙腈-水、乙腈-水（含乙酸）及乙腈-水（含磷酸）等體系進行洗脫，結(jié)果以乙腈-0.05%磷酸水溶液體系得到的色譜峰峰形較好且較穩(wěn)定。衡比例洗脫測定時色譜峰分離效果較差，梯度洗脫法能在80 min內(nèi)使大部分色譜峰得到基線分離。

與傳統(tǒng)的性狀鑒別或以藥材對照品作為指標性成分鑒別的方法相比，指紋圖譜鑒別方法快速、準確、簡單易行，能夠全面反映藥材品質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，當歸和獨活HPLC-DAD指紋圖譜色譜峰存在明顯差別，仿照市場上的摻偽情況，在當歸粉末中加入不同比例獨活粉末，最終在指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)有11個色譜峰面積隨加入比例的增加有較為明顯的變化。本試驗建立了當歸、獨活及當歸中摻入不同比例獨活的指紋圖譜，方法快速、簡便，采用該方法可對當歸與獨活進行鑒別，對摻假樣品進行甄別。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：263，133.

[2] 王元清，嚴建業(yè)，李順祥，等.當歸、枳殼揮發(fā)油HPLC指紋圖譜的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（10）：114-118.

[3] 唐文文，李國琴，晉小軍.當歸不同藥用部位有效成分研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（12）：58.

[4] 頓珠次仁，朱根華，鄒志琴，等.液-質(zhì)聯(lián)用測定不同產(chǎn)地獨活中蛇床子素和歐前胡素的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2015，26（1）：105-108.

[5] 唐文文，李國琴，晉小軍.高效液相色譜法測定風濕止痛藥酒中粉防己堿、防己諾林堿、蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2014，34（8）：657-660.

[6] 李文濤，楊世海.當歸質(zhì)量評價研究現(xiàn)狀[J].藥物分析雜志，2013， 33（3）：517.

[7] 李成義，王延惠，魏學明，等.HPLC測定不同產(chǎn)地當歸中阿魏酸的含量[J].西部中醫(yī)藥，2012，25（1）：34-36.

[8] 吳燕燕，尚明英，蔡少青，等.當歸的化學成分指紋圖譜[J].藥學學報， 2008，43（7）：728-732.

[9] 馬華僑，邸多隆，邵士俊，等.當歸HPLC指紋圖譜研究（I）[J].中草藥， 2004，35（8）：930-932.

[10] 楊英來，崔方，吳國泰，等.當歸藥材不同提取部位的指紋圖譜分析[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（7）：55-60.

[11] 劉榮霞，周婷婷，董婷霞，等.建立評價當歸質(zhì)量的HPLC指紋圖譜分析方法[J].中國藥學雜志，2003，38（10）：29-32.

[12] 溫學遜，牛研，王書芳.當歸不同藥用部位活性成分含量的HPLC分析方法及特征圖譜研究[J].藥物分析雜志，2014，34（2）：317-324.