響應面法優(yōu)化產內切葡聚糖酶重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基

張彥君，魏 晉，周鑫輝，雍洪亮，李 鵬，馬顥榮，布同良，唐自鐘，陳 惠

（四川農業(yè)大學生命科學學院，四川雅安 625014）

響應面法優(yōu)化產內切葡聚糖酶重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基

張彥君，魏 晉，周鑫輝，雍洪亮，李 鵬，馬顥榮，布同良*，唐自鐘，陳 惠

（四川農業(yè)大學生命科學學院，四川雅安 625014）

【目的】對產內切葡聚糖酶重組大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化?！痉椒ā坎捎脝我蛩貙嶒灪晚憫鍮ox-Behnken實驗設計相結合，對培養(yǎng)基的碳源及濃度、氮源及濃度和無機鹽離子及濃度進行優(yōu)化。【結果】結果表明，最佳的碳源、氮源和無機鹽離子及添加量分別為乳糖0.63%，酵母粉1.06%，氯化鎂0.11%，發(fā)酵產酶酶活最大值達到191.23 U/mL，比優(yōu)化前52.43 U/mL提高了3.65倍?！窘Y論】利用響應面法Box-Behnken實驗設計對產內切葡聚糖酶的重組大腸桿菌K369R進行培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化，為內切葡聚糖酶在工業(yè)中的大規(guī)模生產提供理論依據(jù)。

重組大腸桿菌；內切葡聚糖酶；響應面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

纖維素是植物細胞壁的主要組成成分，在自然界中分布廣泛，是取之不盡、用之不竭的天然高分子化合物[1]。由于其豐富性和特殊的性能，使纖維素成為石油最有潛力的替代品[2]。盡管植物來源的纖維素具有實現(xiàn)這目標的潛力，但由于將植物纖維素轉化為生物醇衍生物和生物柴油時存在困難，目前大規(guī)模應用是有問題的[3]。目前纖維素的降解方式主要有酸降解、堿降解、熱降解、氧化降解和微生物降解等。利用微生物降解纖維素，可以有效提高其綜合利用率，因而成為近年來研究的熱點[4-5]。

纖維素降解過程中需要3種酶，即內切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）、外切葡聚糖酶（cellubiohydr alases，CBH）和 β-葡聚糖苷酶（β-glucosidases，BG）的協(xié)同作用將纖維素降解為葡萄糖。天然纖維素酶催化活性低、生產成本高，很難符合工業(yè)生產的需求[6]。通過基因工程、蛋白質工程及發(fā)酵工程的手段可以對相關基因進行有效改造，優(yōu)化產酶發(fā)酵培養(yǎng)基，進而提高相關酶的活性及產酶效率。前期，本研究室利用定點突變技術對內切葡聚糖酶F-10基因進行改造并獲得重組大腸桿菌K369R，其比活力及熱穩(wěn)定性較原始酶有明顯改觀，酶活性方面改變不明顯[7]。研究表明，通過發(fā)酵條件的優(yōu)化可以有效提高工程菌產酶能力。楊曉志等[8]研究通過對大腸桿菌工程菌K12△dapA發(fā)酵條件優(yōu)化，產L-蘇氨酸提高了近1.2倍。王華等[9]在原有培養(yǎng)基基礎上選用不同的碳源、氮源、金屬離子及磷酸鹽對重組大腸桿菌PUCRF產β-CGTase能力進行比較，經優(yōu)化β-CGTase酶活力提高1.34倍。張龍等[10]采用響應面分析方法對重組大腸桿菌生產精氨酸脫亞胺酶（ADI）的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，優(yōu)化后比初始培養(yǎng)基提高了1.53倍，比LB培養(yǎng)基提高了2.01倍。響應面法可以有效優(yōu)化發(fā)酵產酶條件。本研究以前期構建的重組大腸桿菌K369R為研究對象，在單因素基礎上，運用響應面法對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，旨在進一步提高重組大腸桿菌（K369R）產內切葡聚糖酶的能力，為該酶的工業(yè)化生產提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株

試驗菌株來自四川農業(yè)大學生命科學學院生物化學與分子生物學實驗室構建并保存的重組大腸桿菌K369R。

1.2 實驗試劑

異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和氨芐青霉素（Amp）均購自北京索萊寶科技有限公司，其他試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.3 培養(yǎng)基

LB+Amp培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基基礎上加入Amp使其終濃度為100 μg/mL。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，pH自然。

IPTG（24 mg/mL）和 Amp（100 mg/mL）參照李雨霏[7]的方法配置。

1.4 菌株的活化與發(fā)酵

將活化后的菌株由LB固體培養(yǎng)基接到液體培養(yǎng)基，于37℃180 r/min搖床震蕩培養(yǎng)過夜，以2%的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基在37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600達0.4～0.8。分別向各培養(yǎng)基中加入誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，在37℃、200 r/min培養(yǎng)5 h。

1.5 發(fā)酵粗酶液的制備

實驗選用超聲波法進行大腸桿菌細胞的破碎。具體方法參照李雨霏[7]的方法。

1.6 內切葡聚糖酶活力的測定

內切葡聚糖酶活力測定根據(jù)姚友旭[11]的方法略加改進。酶活力的定義：在1.4節(jié)所述培養(yǎng)條件下，1 mL酶液每分鐘催化底物產生相當于1 μg葡萄糖所需的酶量即為一個酶活力單位（U/mL）。

1.7 單因素實驗

1.7.1 碳源及濃度對重組大腸桿菌K369R產酶的影響

根據(jù)史永磊的方法[12]稍做改變。以1.0%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、麥芽糖和甘油為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，以0.5%的蛋白胨為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，測定酶活力，確定最佳碳源。在最佳碳源的基礎上，選擇0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%的最佳碳源的添加量為培養(yǎng)基的碳源，確定最佳碳源濃度。

1.7.2 氮源及濃度對重組大腸桿菌K369R產酶的影響

在最佳碳源及濃度的基礎上，選擇0.5%的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨為培養(yǎng)基的氮源，測定酶活力，確定最佳氮源濃度。選擇0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%的最佳氮源作為培養(yǎng)基的氮源，確定最佳氮源濃度[10]。

1.7.3 無機鹽離子及濃度對重組大腸桿菌K369R產酶的影響

在最佳碳源、氮源及濃度的基礎上，選擇0.1%的氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂和氯化錳添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，測定酶活力，確定促進效果最佳的離子。選擇0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的最佳離子添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，確定最佳的離子濃度。

1.8 響應面BOX-Behnken試驗設計

通過對單因素的實驗結果的整理與分析，進行響應面分析。采用Design expert 8.0.6軟件程序數(shù)據(jù)處理，結合Box-Behnken中心組合試驗設計的原理，選取自變量因素分別為乳糖（A），酵母粉（B）及氯化鎂（C）3個因素，響應值設計為內切葡聚糖酶的酶活力（R1），運用響應曲面回歸分析（Response surface analysis，RSA）對重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化[13-15]。Box-Behnken試驗設計因素水平各不同（見表1）。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平Table1 Factors levels in response surface design

2 結果與分析

2.1 碳源及濃度對重組大腸桿菌K369R產酶的影響

纖維素酶是誘導酶，不同的碳源對產酶的影響各不相同[16]。由圖1a可知，重組大腸桿菌K369R在以乳糖為碳源時，內切葡聚糖酶酶活力最高達70.97 U/mL；最低的為葡萄糖，僅為33.20 U/mL。選擇乳糖為下一步試驗的碳源。由圖1b可知，乳糖的濃度對內切葡聚糖酶酶活力的影響趨勢為先升高再降低，然后再升高。在乳糖為0.6%的添加量時，酶活力達到最大值，為84.65 U/mL。而在添加量為1.2%時，酶活力又呈上升趨勢，達75.36 U/mL。兩者酶活力相差不多，從經濟的角度考慮，選擇0.6%乳糖繼續(xù)下一步試驗。

2.3 氮源及濃度對重組大腸桿菌K369R產酶的影響

重組大腸桿菌K369R既可以利用有機氮源也可以利用無機氮源。由圖2a可知，重組大腸桿菌K369R對有機氮源的利用效率明顯高于無機氮源，其中內切葡聚糖酶酶活力最高的為酵母粉，酶活高達94.74 U/mL。當使用無機氮源時，酶活力較低，最低的為硝酸銨，僅為23.45 U/mL。選擇酵母粉作為氮源進行下一步的試驗。由圖2b可知，在添加量小于1.0%時，隨著濃度的升高酶活力增加，在1.0%時達到最高值，為106.53 U/mL；而超過1.0%，濃度增加，酶活力降低。選擇1.0%酵母粉進行下一步的試驗。

圖1 不同碳源及濃度對內切葡聚糖酶酶活力的影響Figure1 Effect of carbon source and concentration on endoglucanase activity

圖2 不同氮源及濃度對內切葡聚糖酶酶活力的影響Figure2 Effect of nitrogen source and concentration on endoglucanase activity

2.5 無機鹽離子及濃度對重組大腸桿菌K369R產酶的影響

由圖3a可知，氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂對內切葡聚糖酶都有促進作用，且氯化鎂的效果最好，達118.43 U/mL。而氯化錳有抑制作用?？赡苁且驗镸g2+是許多酶的輔助因子，并參與微生物細胞壁的形成，對產酶具有重要作用。選擇氯化鎂進行下一步試驗的。由圖3b可知，Mg2+的濃度對內切葡聚糖酶的影響趨勢是先升高在降低，最后在升高的趨勢，在濃度為0.10%時產酶活力到達峰值，為187.00 U/mL，選擇0.10%的氯化鎂進行下一步試驗。

圖3 無機鹽離子及濃度對內切葡聚糖酶酶活力的影響Figure3 Effect of inorganic salt and concentration on endoglucanase activity

2.7 響應面Box-Behnken試驗設計優(yōu)化結果分析

對培養(yǎng)基成分進行響應面分析，結果如表2所示。利用Design Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，獲得多元二次方程：R1=188.29+6.21A+9.44B+7.53C-1.25AB-11.79AC+0.42BC-13.65A2-14.89B2-16.81C2，其中R1是預測的內切葡聚糖酶酶活力，A是乳糖濃度，B是酵母粉濃度，C是氯化鎂濃度。

表2 響應面試驗設計分析Table2 Response surface design and corresponding analysis

表3 方差分析Table3 ANOVA of regression analysis

對二次回歸方程進行方差分析結果（見表3）。本試驗所得擬合二次回歸方程響應面分析模型P值具有顯著性（見表3），R2=0.9686。表明試驗的因變量與自變量之間存在多元回歸性，且因素間多元回歸關系具有顯著性。試驗實際值與預測值之間相關性表明該實驗方法具有極高的可靠性，并且也證明該回歸方程具有模擬真實曲面的真實性。從F值的大小可以推斷得出，試驗選取三因素對內切葡聚糖酶酶活力的影響排序為酵母粉＞氯化鎂＞乳糖。

為求得每個條件的最佳值，對所得的回歸方程求一階偏導，得到 A=0.135，B=0.315，C=0.180，對應的培養(yǎng)基配制實際值：乳糖0.63%，酵母粉1.06%，氯化鎂0.11%，對應的響應值R1最大預測值為190.872U/mL。利用Design-expert軟件對數(shù)據(jù)分析，可以得到響應面圖和等值線圖，3個因素之間的交互作用見圖4，從以下等值線圖和三維分析圖可見，響應面的穩(wěn)定點在所實驗的區(qū)域內。在響應面等高線分析中，橢圓形或者馬鞍形的等高線被認為是參數(shù)之間交互作用顯著，而圓形則被認為是不顯著[17]。由圖4a可知，當氯化鎂的添加量為0.10%時，在一定范圍內，內切葡聚糖酶酶活力隨著乳糖和酵母粉的添加量的增加而增加，在0.63%的乳糖和1.06%的酵母粉的添加量時，酶活達到最高值。等高線為近橢形，說明兩者的交互作用較為顯著。由圖4b可知，當酵母粉的添加量為1.0%時，在一定范圍內，內切葡聚糖酶酶活力隨著乳糖和氯化鎂的添加量的增加而增加，在0.63%的乳糖和0.11%的氯化鎂的添加量時，酶活達到最高值。等高線為橢圓形，說明兩者的交互作用較強。圖4c可知，在一定范圍內，內切葡聚糖酶酶活力隨著酵母粉和氯化鎂的添加量的增加而增加，在1.06%的酵母粉和0.11%的氯化鎂的添加量時，酶活達到最高值。等高線為扁圓形，說明兩者的交互作用不顯著。

圖4 各因素的響應面圖及等高圖Figure4 Response surface and contour plots of protease production

為了驗證這個模型的準確性和實用性，用響應面優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進行了驗證試驗。做3次重復試驗，所得的內切葡聚糖酶酶活力分別為191.23 U/mL、189.75 U/mL和190.68 U/mL，與預測值190.872 U/mL想接近，可以說明該模型具有實際意義。

3 討論

3.1 碳源的選擇

碳源為微生物的生長提供物質基礎和能量來源。選擇乳糖為最佳碳源可能是其一方面作為基礎營養(yǎng)物質，為微生物的生長繁殖提供能量、為蛋白質等的合成提供碳骨架，另一方面又可以作為有效的誘導劑誘導重組蛋白的表達[18]。葡萄糖作為碳源時酶活力較低，可能是產生了“葡萄糖效應”，即以葡萄糖作為碳源雖能促進菌體生長，但對產酶相關基因的表達有阻遏作用，必須在這些物質被耗盡后才開始相關纖維素酶的合成[19]。

3.2 氮源的選擇

氮源是構成微生物細胞物質或代謝產物中氮元素來源的營養(yǎng)物質，對微生物的生長發(fā)育有重要的作用。酶本身是蛋白質，而氮元素是構成蛋白質的主要元素，因此氮源添加量對于產酶有重要作用[20]。達到一定濃度后，酶活力降低可能是由于添加量過高，會導致溶液變得更加黏稠，從而使底物流動性下降，不利于菌株生長及產酶。

3.3 響應面分析

目前，用于優(yōu)化發(fā)酵條件的數(shù)學統(tǒng)計方法有很多，比如正交實驗法和響應面分析。響應面分析比正交實驗法更為有效，因為響應面法是利用合理的試驗設計方法并通過試驗得到一定數(shù)據(jù)[21]，采用多元二次回歸方程擬合多個因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過分析回歸方程尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的統(tǒng)計方法[22]，在化學工業(yè)、生物學、醫(yī)學以及食品學等領域得到廣泛的應用。

舒暢等對重組大腸桿菌產谷氨酰胺轉移酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，在運用響應面法優(yōu)化后提高了1.56倍[23]。和玉軍等對重組大腸桿菌產脂肪氧合酶發(fā)酵條件優(yōu)化，利用響應面Box-Behnken設計進行優(yōu)化，優(yōu)化后比優(yōu)化前提高了56.87%[24]。Chen等運用響應面法對雙歧桿菌和干酪乳桿菌的山羊奶發(fā)酵條件優(yōu)化，最佳發(fā)酵條件對山羊奶發(fā)酵制品的響應值有正面影響[25]。Jia R.B.等通過單因素和響應面方法中的復合設計對Monacus菌株M-3產TMP的培養(yǎng)基及也太發(fā)酵組成進行優(yōu)化，TMP的產量最高可達 13.49 μg/mL[26]。

4 結論

通過單因素實驗和響應面Box-Behnken試驗設計對產內切葡聚糖酶的重組大腸桿菌K369R進行培養(yǎng)基發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基發(fā)酵條件為乳糖0.63%、酵母粉1.06%和氯化鎂0.11%，預測蛋白酶最大酶活為190.872 U/mL，實測最大值達到191.23 U/mL，比優(yōu)化前52.43 U/mL提高了3.65倍。

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Optimization of Culture Medium of Recombinant Escherichia Coli for Endoglucanase Production by Response Surface Methodology

ZHANG Yan-jun，WEI Jin，ZHOU Xin-hui，YONG Hong-liang，LI Peng，MA Hao-rong，BU Tong-liang*，TANG Zi-zhong，CHEN Hui
（ College of Life Science，Science Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China)

【Objective】The study aimed to optimize the fermentation medium of recombinant E.coli for endoglucanase production.【Method】Single factor experiment and response surface Box-Behnken design were used to optimize the carbon source and concentration，nitrogen source and concentration of the medium，and the concentration of inorganic salt.【Results】The results showed that the best carbon source，nitrogen source and inorganic salt ion were lactose，yeast powder and magnesium chloride respectively.The addition amount of various factor in fermentation medium was 0.63%lactose，1.06%yeast powder，0.11%magnesium chloride.Under the optimized conditions，the maximum endoglucanase activity reached to 191.23 U/mL，which was 3.65 times higher than that before optimization of 52.43 U/mL.【Conclusion】The fermentation conditions of recombinant Escherichia coli K369R were studied by using the response surface method Box-Behnken experiment.This research can provide the basis for the theoretical endoglucanase large-scale manufacture.

recombinant E.Coli；endoglucanase；response surface methodology；medium optimization

Q71

A

1000-2650（2017）04-0581-06

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.04.019

2017-05-05

四川省教育廳項目（13ZB0276）；四川農業(yè)大學科研興趣培養(yǎng)計劃項目。

張彥君，在讀碩士。*責任作者：布同良，博士，講師，主要從事微生物與生物質資源開發(fā)利用，E-mail：tlbu@163.com。

（本文審稿：陳 強；責任編輯：秦碧雯；英文編輯：劉益平）