人參白虎湯對(duì)1型糖尿病幼鼠血糖及干擾素γ、白細(xì)胞介素4的影響

陳 晶 郭 艷 閆玉潔 辛 麗 張俊玲

(華北理工大學(xué)2015級(jí)碩士研究生，河北 唐山 063000)

人參白虎湯對(duì)1型糖尿病幼鼠血糖及干擾素γ、白細(xì)胞介素4的影響

陳 晶 郭 艷 閆玉潔 辛 麗 張俊玲△

(華北理工大學(xué)2015級(jí)碩士研究生，河北 唐山 063000)

目的探究人參白虎湯對(duì)1型糖尿病(T1DM)幼鼠血糖及干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素4(IL-4)的影響作用。方法將50只幼鼠隨機(jī)選取10只設(shè)為正常組，剩余40只以鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射1次誘導(dǎo)T1DM模型，造模成功后隨機(jī)分為模型組、胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組，每組各10只。胰島素組予精蛋白生物合成人胰島素注射液2 U/(kg·d)皮下注射，人參白虎湯高、低劑量組分別予人參白虎湯12、6 mL/(kg·d)灌胃，正常組及模型組予0.9%氯化鈉注射液1 mL灌胃，均持續(xù)6周。觀察5組幼鼠給藥前后體質(zhì)量變化，分別于給藥前及給藥結(jié)束后采集5組幼鼠尾靜脈血測定空腹血糖，處死幼鼠取腹主動(dòng)脈血采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測IFN-γ和IL-4水平，并觀察5組幼鼠胰腺的病理變化。結(jié)果給藥前，模型組、胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組幼鼠體質(zhì)量均較正常組明顯下降(P<0.05)，空腹血糖升高(P<0.05)；給藥后，胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組幼鼠體質(zhì)量均較本組給藥前及模型組同期升高(P<0.05)，空腹血糖降低(P<0.05)，但與正常組同期比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與胰島素組相比，人參白虎湯高劑量組體質(zhì)量及空腹血糖無明顯差異(P>0.05)，而人參白虎湯低劑量組體質(zhì)量低，空腹血糖高(P<0.05)。與正常組相比，模型組、胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組IFN-γ水平升高，IL-4水平降低(P<0.05)；與模型組相比，胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)，IL-4水平明顯升高(P<0.05)，且人參白虎湯高劑量組與胰島素組相比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。胰腺組織病理觀察顯示，胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組胰島β細(xì)胞損傷較模型組減輕，但仍未恢復(fù)正常。結(jié)論人參白虎湯能明顯降低T1DM幼鼠血糖、IFN-γ水平，提高IL-4水平，改善胰腺病理結(jié)構(gòu)，進(jìn)而發(fā)揮修復(fù)T1DM幼鼠胰島免疫損傷的作用。

糖尿病，1型；疾病模型，動(dòng)物；白細(xì)胞介素4；干擾素Ⅱ型；小鼠

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是因內(nèi)源性胰島素不能正常分泌而引起血糖升高等一系列臨床表現(xiàn)的疾病，是由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的部分或全部胰島β細(xì)胞破壞所引發(fā)，多發(fā)生于兒童和青少年。目前，T1DM發(fā)病率逐年上升[1]，兒童一旦患病，則需終生治療，且易合并全身器官損傷，嚴(yán)重降低患兒生活質(zhì)量，甚至危及生命。中醫(yī)學(xué)將糖尿病歸為“消渴”范疇。人參白虎湯具有消渴生津之效。眾多研究顯示，細(xì)胞因子如干擾素γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素4(IL-4)在T1DM的發(fā)病中有重要作用[2]。目前，許多研究[3-6]聚焦在T1DM患兒與正常兒童IFN-γ和IL-4的變化比較，及IFN-γ和IL-4在T1DM發(fā)病中的作用。本實(shí)驗(yàn)通過鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射制備T1DM幼鼠模型，然后觀察不同方法治療后幼鼠體質(zhì)量、空腹血糖、IFN-γ、IL-4水平及胰腺組織的病理變化情況，進(jìn)一步探討人參白虎湯對(duì)T1DM幼鼠血糖及胰島免疫損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD幼鼠50只，雌性，體質(zhì)量100～120 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK2016-0011，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動(dòng)物房，自由進(jìn)水，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.1.2 藥物與試劑 STZ，美國Sigma公司，批號(hào)S0130；血糖儀、測試條[艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司]。人參白虎湯藥物組成：石膏30 g，甘草6 g，知母18 g，粳米12 g，人參9 g，藥材購自北京同仁堂藥房。以上藥物水煎濃縮成含中藥3 g/mL的湯劑。精蛋白生物合成人胰島素注射液(丹麥諾和諾德公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20070163)，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.1.3 主要儀器 L-420低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，CX4 Pro全自動(dòng)生化分析儀(美國Beckman公司)，DP80生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，HM340石蠟切片機(jī)(上海倍曼生物科技有限公司)，美國熱電Thermo移液器(1～10 μL、1～200 μL、5～1 000 μL、0.5～50 μL)；IL-4及IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模方法 50只SD幼鼠飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組10只，實(shí)驗(yàn)組40只。正常組幼鼠進(jìn)行普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組幼鼠禁食但不禁水，12 h后行STZ 60 mg/kg腹腔注射1次誘導(dǎo)T1DM模型，于72 h后測空腹血糖≥16.7 mmol/L，并有多飲、多食、多尿表現(xiàn)者即為造模成功[7]。結(jié)果40只幼鼠均造模成功，將40只T1DM幼鼠模型隨機(jī)分為模型組、胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組，每組各10只。

1.2.2 給藥方法 造模成功后3 d，胰島素組予精蛋白生物合成人胰島素注射液2 U/(kg·d)皮下注射，人參白虎湯高、低劑量組分別予人參白虎湯12、6 mL/(kg·d)灌胃，正常組及模型組予0.9%氯化鈉注射液1 mL灌胃，均持續(xù)6周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般情況 觀察5組幼鼠造模后一般情況，包括飲食、飲水、尿量、體質(zhì)量、體毛、活動(dòng)量等情況。

1.3.2 體質(zhì)量 5組幼鼠均每周稱體質(zhì)量，觀察其體質(zhì)量的變化。

1.3.3 血糖 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，分別于給藥前及給藥結(jié)束后采集5組幼鼠尾靜脈血測定空腹血糖，并進(jìn)行比較。

1.3.4 IFN-γ及IL-4水平 最后一次給藥后，5組幼鼠禁食12 h后，予10%水合氯醛麻醉，剖腹，腹主動(dòng)脈取血置于干燥的黃色管中，3 000 r/min，離心15 min，取上清液置于-80 ℃冰箱內(nèi)待測。采用ELISA法檢測IFN-γ及IL-4水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 胰腺病理觀察 取腹主動(dòng)脈血后，處死各組幼鼠，切除5組幼鼠胰腺組織，0.9%氯化鈉注射液沖洗，于10%中性甲醛溶液中固定24 h，再進(jìn)行石蠟包埋、切片、烤片、蘇木精-伊紅(HE)染色，最后顯微鏡(×200)下觀察各組幼鼠胰腺的病理變化。

2 結(jié) 果

2.1 5組幼鼠一般情況 模型組、胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組幼鼠造模后逐漸出現(xiàn)多飲，多食，多尿，體質(zhì)量下降，體毛松散，活動(dòng)量下降等癥狀，符合糖尿病模型的診斷，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的糖尿病動(dòng)物癥狀、體征相似[6]。正常組幼鼠在此期間飲食、飲水、大小便、體毛、活動(dòng)度較前基本無變化，體質(zhì)量明顯增長。

2.2 5組幼鼠給藥前后體質(zhì)量變化比較 見表1。

組 別n給藥前給藥后差值正常組10212．80±8．03280．63±9．4067．83±6．64模型組10183．67±6．72?222．79±6．82?△39．12±7．79胰島素組10181．29±5．13?239．72±4．71?△#58．43±5．80人參白虎湯高劑量組10182．78±9．69?240．15±7．67?△#57．37±6．18人參白虎湯低劑量組10181．79±8．36?236．31±8．27?△#○54．53±4．24

與正常組比較，*P<0.05；與本組給藥前比較，△P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與胰島素組比較，○P<0.05

由表1可見，給藥前，模型組、胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組幼鼠體質(zhì)量均較正常組明顯下降(P<0.05)，且各組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥后，胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組幼鼠體質(zhì)量均較本組給藥前及模型組同期升高(P<0.05)，但仍低于正常組同期(P<0.05)；

與胰島素組相比，人參白虎湯高劑量組幼鼠體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)，人參白虎湯低劑量組幼鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)。給藥后，模型組體質(zhì)量較本組給藥前升高(P<0.05)，但仍低于正常組(P<0.05)。

2.3 5組幼鼠給藥前后空腹血糖變化比較 見表2。

組 別n給藥前給藥后差值正常組106．79±0．506．57±0．490．22±0．28模型組1019．18±1．32?19．02±1．31?△0．16±1．32胰島素組1019．10±1．72?12．63±0．74?△#6．47±1．99人參白虎湯高劑量組1019．00±1．93?12．73±0．88?△#6．27±1．75人參白虎湯低劑量組1019．39±1．51?15．02±0．96?△#○4．37±0．97

與正常組比較，*P<0.05；與本組給藥前比較，△P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與胰島素組比較，○P<0.05

由表2可見,給藥前,與正常組相比,模型組? 胰島素組?人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低 劑量組幼鼠空腹血糖均明顯升高(P＜0.05) ,且各組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?給 藥后,胰島素組?人參白虎湯高劑量組及人參白虎 湯低劑量組幼鼠的空腹血糖與本組給藥前及模型 組同期相比明顯下降( P＜0.05) ,但仍高于正常 組同期(P＜0.05);與胰島素組相比,人參白虎湯 高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),人 參白虎湯低劑量組空腹血糖仍較高(P＜0.05)?正常組?模型組幼鼠的空腹血糖于給藥前?后無明顯變化(P>0.05) ?

2.4 5 組幼鼠IFN-γ及IL-4 水平變化比較見表3?

由表3可見，與正常組相比，模型組、胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組IFN-γ水平升高，IL-4水平降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)，IL-4水平明顯升高(P<0.05)。與胰島素組相比，人參白虎湯高劑量組IFN-γ、IL-4水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，人參白虎湯低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 5組幼鼠胰腺組織病理變化 正常組幼鼠的胰島β細(xì)胞胞漿豐富，輪廓規(guī)整，滿視野可見大量的胰島β細(xì)胞，且分布均勻，排列整齊，細(xì)胞分界清晰。與正常組相比，模型組幼鼠胰島中可見少量散在的胰島β細(xì)胞，分布欠均勻，排列紊亂，且胰島β細(xì)胞部分溶解。與正常組相比，胰島素組、人參白虎湯高劑量組及人參白虎湯低劑量組胰島β細(xì)胞數(shù)量在一定程度上減少，且排列欠規(guī)整，但與模型組比較，胰島β細(xì)胞數(shù)量增多，分布稍均勻，排列稍整齊，胞漿稍豐富，且以人參白虎湯高劑量組改善更為明顯。5組幼鼠胰腺組織病理圖見圖1。

正常組 模型組 胰島素組

人參白虎湯高劑量組 人參白虎湯低劑量組

圖1 5組幼鼠胰腺組織病理變化(HE×200)

3 討 論

目前，我國兒童T1DM的發(fā)病率逐年上升，且隨著年齡的增長而增加，其病程長，發(fā)展至成年常合并眼、心、腎、神經(jīng)等多種并發(fā)癥[8]，且尚無辦法根治，患兒常伴隨出現(xiàn)各種心理社會(huì)問題[9],很大程度地影響了患兒的身心健康，因此T1DM的防控工作尤為重要。到目前為止，T1DM的病因病機(jī)尚未完全揭示，但主要研究顯示，自身免疫細(xì)胞浸潤胰島，進(jìn)一步引起胰島β細(xì)胞損傷，使得胰島素分泌缺乏，是T1DM發(fā)生的根本原因[10]。CD4+T淋巴細(xì)胞主要表達(dá)于輔助T(Th)細(xì)胞,在免疫系統(tǒng)中起主導(dǎo)作用[11]。Th細(xì)胞可分為Th1和Th2亞群，Th1/Th2主要通過自身或其他免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行自我調(diào)節(jié)和相互調(diào)節(jié)，以維持平衡。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子參與細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子參與體液免疫應(yīng)答，免疫學(xué)常以IFN-γ和IL-4分別作為Th1、Th2細(xì)胞的特征性因子，二者比值的變化能夠反映Thl/Th2的平衡狀態(tài)。目前研究認(rèn)為，Th1/Th2平衡紊亂是T1DM發(fā)病的主要機(jī)制[12]。Th1細(xì)胞是主要效應(yīng)細(xì)胞，可直接或間接破壞胰島β細(xì)胞。IFN-γ對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)具有促進(jìn)作用，可以直接對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。在免疫應(yīng)答過程中，胰島自身抗原能刺激記憶淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,產(chǎn)生過多時(shí)，可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞免疫損傷，導(dǎo)致Th1/Th2失衡。國內(nèi)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，T1DM模型幼鼠脾細(xì)胞上清液中的IFN-γ水平明顯高于正常對(duì)照組[13-14]。Th2細(xì)胞對(duì)Th1細(xì)胞的功能有抑制作用，細(xì)胞因子IL-4可以減緩Th1細(xì)胞對(duì)胰島β細(xì)胞的破壞作用，還可促進(jìn)Th2細(xì)胞的生成和發(fā)育[15-16]。本研究結(jié)果顯示，T1DM幼鼠模型血清中IFN-γ水平升高，IL-4水平降低，機(jī)體處于Th1強(qiáng)勢，從而使得胰島β細(xì)胞受損，導(dǎo)致T1DM的發(fā)生和發(fā)展，與研究相一致[1-3]。

T1DM屬于中醫(yī)學(xué)消渴、消癉范疇[17]，系先天不足，五臟柔弱，六淫侵襲，熱毒留戀，化熱損陰所致。先天不足者宜補(bǔ)，但先天難補(bǔ)，應(yīng)以補(bǔ)益后天脾胃為主，同時(shí)清熱解毒養(yǎng)陰?！督饏T要略》曰：“渴欲飲水，口干舌燥者，白虎加人參湯主之?！卑谆⒓尤藚笫酪嘀^之人參白虎湯，是治療消渴的經(jīng)典方劑，由石膏、甘草、知母、粳米、人參組成，具有清熱瀉火、益氣生津的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，知母能夠降低血糖[18-19]。人參中的多肽和多糖成分均可使STZ導(dǎo)致的高血糖下降，能增加葡萄糖分解、降低糖異生；人參二醇皂苷和多糖能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[20]。

STZ對(duì)胰島β細(xì)胞具有高度選擇性，注入幼鼠體內(nèi)后可通過自由基破壞大部分胰島β細(xì)胞，使其功能障礙，導(dǎo)致胰島素分泌嚴(yán)重不足，從而導(dǎo)致糖尿病，其模型在病理生理特性上接近胰島素依賴型糖尿病，且組織毒性相對(duì)較小，具有耗時(shí)短、方法簡便、易于掌握和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，STZ注射后，幼鼠體質(zhì)量明顯減輕，空腹血糖升高。經(jīng)胰島素及人參白虎湯高、低劑量治療后，體質(zhì)量明顯升高，空腹血糖明顯下降，觀察胰腺組織的病理改變，胰島β細(xì)胞并未完全喪失，其機(jī)制與β細(xì)胞凋亡減少、再生增加密切相關(guān)[21]，尤以人參白虎湯高劑量組效果最佳。綜上，人參白虎湯可明顯降低T1DM幼鼠血糖，改善多飲、多食、多尿、體質(zhì)量下降的癥狀，促進(jìn)胰島β細(xì)胞的恢復(fù)。進(jìn)一步研究顯示，胰島素及人參白虎湯高、低劑量治療后T1DM幼鼠IFN-γ水平升高，IL-4水平降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且人參白虎湯高劑量組與胰島素組相比，IFN-γ、IL-4水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示人參白虎湯可調(diào)控T1DM幼鼠淋巴細(xì)胞免疫因子的釋放，降低IFN-γ和升高IL-4，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡狀態(tài)，修復(fù)胰島β細(xì)胞的免疫損傷，從而降低T1DM幼鼠血糖，且有一定的劑量依賴性，為T1DM的免疫防治提供了新的治療思路。

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EffectsofRenshen-baihudecoctiononplasmaglucose,interferon-γandinterleukin-4ofimmatureratswithtype1diabetesmellitus

CHENJing,GUOYan,YANYujie,etal.

2015-GradeMasterofHubeiUniversityofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Hebei,Tangshan063000

ObjectiveTo observe the effects of Renshen-baihu decoction on plasma glucose, IFN-γ and interleukin-4 (IL-4) of immature rats with type 1 diabetes mellitus (T1DM).Methods10 rats were randomly selected from 50 rats as the normal group, the remaining 40 rats were injected intraperitoneally with streptozotocin (STZ) to induce T1DM model. After successful modeling, the rats were randomly divided into model group, insulin group, high dose of Renshen-baihu decoction group and low dose of Renshen-baihu decoction group, and 10 rats in each group. The insulin group was was injected subcutaneously with insulin by 2 U/ (kg·d). The high and low dose of Renshen-baihu decoction groups were respectively given Renshen-baihu decoction gavage by 12 mL / (kg·d) and 6 mL / (kg·d). The normal group and model group were given 1 mL 0.9% sodium chloride injection gavage. The treatment course was continuously for 6 weeks. The changes of body weight of immature rats before and after administration were observed in 5 groups. The tail vein blood was collected to detect fasting blood glucose before and after the administration in 5 groups. The abdominal aorta blood was collected to detect he levels of IFN-γ and IL-4 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the pathological changes of pancreas of immature rats were observed.ResultsThe body weight before administration in model group, insulin group, high dose of Renshen-baihu decoction group and low dose of Renshen-baihu decoction group were significantly lower than those in normal group (P<0.05), and fasting blood glucose increased (P<0.05). The body weight after administration in the insulin group, high dose of Renshen-baihu decoction group and low dose of Renshen-baihu decoction group were higher than those before administration and those in the model group at the same period (P<0.05), and the blood glucose was decreased (P<0.05), and had statistical differences with the normal group at the same period (P<0.05). Compared with the insulin group, there was no significant difference on the body weight and fasting blood glucose in the high dose of Renshen-baihu decoction group (P>0.05), while the the body weight in the low-dose of Renshen-baihu decoction group was lower and the fasting blood glucose was still higher (P<0.05). Compared with the normal group, the IFN-γ increased in model group, insulin group, high dose of Renshen-baihu decoction group and low dose of Renshen-baihu decoction group, and IL-4 reduced (P<0.05).Compared with the model group, the IFN-γ in insulin group, high dose of Renshen-baihu decoction group and low dose of Renshen-baihu decoction group were significantly decreased (P<0.05), IL-4 was significantly increased (P<0.05), and there was no significant difference between high dose of Renshen-baihu decoction group and insulin group (P>0.05). The observation of pancreatic tissue histopathology showed that the injury of islet β cell in the insulin group,high dose of Renshen-baihu decoction group and low dose of Renshen-baihu decoction group were less than that in model group, but still not returned to normal.ConclusionRenshen-baihu decoction can significantly reduce the blood glucose, IFN-γ, and increase IL-4 in immature rats with T1DM, improve the pathological structure of the pancreas, and thus can play a role in the repair of islet immune injury in immature rats.

Diabetes; Type 1; Disease model; Animal;IL - 4;IFN - γ;Rat

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.11.025

R781.64；R285.5

A

1002-2619(2017)11-1700-06

△ 通訊作者：華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，河北 唐山 063000

陳晶(1990—)，女，碩士研究生在讀。研究方向：兒科學(xué)，兒童糖尿病。

2017-07-19)

曹志娟)