電針百會(huì)、四關(guān)穴對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)中Tax1結(jié)合蛋白1表達(dá)的影響①

馬宏梅，蔣錦，詹劍，李瓊莉，張瑩，秦文熠，羅勇

電針百會(huì)、四關(guān)穴對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)中Tax1結(jié)合蛋白1表達(dá)的影響①

馬宏梅1a,2，蔣錦1a,2，詹劍1a,2，李瓊莉1a,2，張瑩1a,2，秦文熠1b，羅勇1a,2

目的觀察電針百會(huì)、四關(guān)穴對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)中Tax1結(jié)合蛋白1(TAX1BP1)表達(dá)的影響，探討電針抑制核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路的激活，發(fā)揮腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。方法105只健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組再分為缺血2 h后再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h五個(gè)亞組。改良Longa線栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈梗死再灌注模型。電針組給予電針百會(huì)穴和病側(cè)四關(guān)(合谷/太沖)穴。檢測(cè)各組神經(jīng)功能，缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中TAX1BP1蛋白的表達(dá)情況、TAX1BP1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、鋅指蛋白A20和胞核NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺損，與模型組相比，電針組在局灶性腦缺血2 h再灌注48 h、72 h時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分降低(P＜0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組在再灌注12 h、24 h、48 h時(shí)TAX1BP1蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)；與模型組相比，電針組在再灌注12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)TAX1BP1蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加(P＜0.05)，再灌注24 h為表達(dá)高峰。在再灌注24 h后，與假手術(shù)組相比，模型組A20表達(dá)、TAX1BP1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、胞核NF-κB p65表達(dá)增加(P＜0.05)；與模型組相比，電針組的A20表達(dá)、TAX1BP1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增加(P＜0.05)，胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示，TAX1BP1蛋白主要表達(dá)在胞漿，電針組TAX1BP1與A20共表達(dá)在胞漿。免疫組化結(jié)果顯示，模型組NF-κB p65主要表達(dá)在胞核，電針組主要表達(dá)在胞漿。結(jié)論電針抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注后NF-κB信號(hào)通路的激活，促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)TAX1BP1蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

腦缺血再灌注；電針；Tax1結(jié)合蛋白1；鋅指蛋白A20；核因子-κB p65；大鼠

腦卒中是目前導(dǎo)致人類死亡的第二位原因[1]。腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中絕大多數(shù)是發(fā)生在大腦中動(dòng)脈的缺血性腦卒中[2-3]。局灶性腦缺血再灌注后，有多種病理生理機(jī)制對(duì)腦組織造成損傷，其中炎癥反應(yīng)在局灶性腦缺血再灌注損傷中擔(dān)當(dāng)重 要 角 色[4]。 核 因 子 -κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號(hào)通路的激活是神經(jīng)性炎癥的主要機(jī)制[5]。Tax1結(jié)合蛋白1(Tax1-binding protein 1,TAX1BP1，亦稱TABP151或T6BP)最初因結(jié)合人嗜T淋巴細(xì)胞病毒1型(human T-lymphotropic virus type 1,HTLV-1)Tax1蛋白而被發(fā)現(xiàn)[6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TAX1BP1是調(diào)控抑制NF-κB信號(hào)通路的抑制蛋白，目前已有研究證實(shí)TAX1BP1是終止NF-κB信號(hào)通路應(yīng)答腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的關(guān)鍵靶點(diǎn)，TAX1BP1通過(guò)招募結(jié)合鋅指蛋白A20，又稱腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白3(TNF-α induced protein 3,TNFAIP3)發(fā)揮抗炎作用，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活[7]。Lim等[8]的系統(tǒng)評(píng)價(jià)和Meta分析結(jié)果亦顯示，電針能夠有效減輕腦卒中后肢體的痙攣狀態(tài)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針百會(huì)、四關(guān)穴能減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注早期(6～72 h)腦組織的炎性損傷，上調(diào)A20表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活[9-11]。故在局灶性腦缺血再灌注早期炎性損傷中，電針是否通過(guò)上調(diào)TAX1BP1蛋白的表達(dá)抑制局灶性腦缺血再灌注早期的炎性損傷，值得探討。

本實(shí)驗(yàn)研究電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注早期缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中TAX1BP1蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探明電針對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注早期炎性損傷的保護(hù)機(jī)制及TAX1BP1在其中的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠105只，體質(zhì)量280～300 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(渝)2012-0002。

按照隨機(jī)數(shù)字表將75只大鼠分為假手術(shù)組(n=25)、模型組(n=25)和電針組(n=25)。每組大鼠再按照隨機(jī)數(shù)字表法分為局灶性腦缺血2 h再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h亞組，每組5只，用于神經(jīng)功能評(píng)分、Western blotting檢測(cè)。

另30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組再按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)各選取5只，在局灶性腦缺血2 h再灌注24 h時(shí)，分別進(jìn)行免疫熒光染色及免疫組織化學(xué)染色。

大鼠禁食12 h后開始造模。動(dòng)物處置按照重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

TAX1BP1兔單克隆抗體：英國(guó)ABCAM公司。NF-κB p65小鼠單克隆抗體：美國(guó)CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。A20兔多克隆抗體、β-actin兔多克隆抗體、山羊抗兔熒光二抗cy3、山羊抗小鼠熒光二抗488：武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。A20小鼠單克隆抗體：美國(guó)SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司。核纖層蛋白B1(Lamin b1)兔多克隆抗體：武漢ABCLONAL公司。免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒、一抗稀釋液：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：沈陽(yáng)萬(wàn)類生物有限公司。

G6805-2型電針治療儀：北京新勝公司。電泳、電轉(zhuǎn)儀：美國(guó)BIO-RAD。lourmat fusion FX 7 Spectra顯影儀：法國(guó)VILBER公司。Axio Observer ZI激光共聚焦熒光顯微鏡：德國(guó)CARL ZEISS MICROIMAGING公司。PM20自動(dòng)顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 動(dòng)物模型與評(píng)價(jià)

根據(jù)Longa等[13]報(bào)道的方法，并結(jié)合本課題組秦文熠等[9]報(bào)道的經(jīng)驗(yàn)方法，規(guī)范制備線栓法右側(cè)大腦中動(dòng)脈梗死再灌注模型。3.5%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥位手術(shù)，結(jié)扎大鼠的頸外動(dòng)脈，插栓從頸外動(dòng)脈至大腦中動(dòng)脈，距頸動(dòng)脈分叉處18～20 mm；2 h后，拔出線栓至頸外動(dòng)脈，實(shí)現(xiàn)再灌注。造模后，采用Longa等[13]行為學(xué)評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀；1分，輕度局灶神經(jīng)功能缺失(不能完全伸展左側(cè)前肢)；2分，中度局灶神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)轉(zhuǎn)圈)；3分，重度神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)傾斜)；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。由于0分沒有神經(jīng)功能缺損，4分癥狀過(guò)重不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故1～3分為造模成功。

1.4 電針刺激

根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸委員會(huì)制定的大鼠穴位圖譜[12]，選取百會(huì)穴和病側(cè)四關(guān)(合谷/太沖)穴，利用直徑0.38 mm、長(zhǎng)1寸(≈3.33 cm)華佗牌不銹鋼銀針取百會(huì)穴斜刺入頭皮1 mm，直刺四關(guān)穴2 mm，接電針治療儀，頻率100/2 Hz，疏密波，強(qiáng)度1 mA，刺激時(shí)間20 min。電針組拔栓后立即行電針刺激，每天1次，直至處死大鼠，即再灌注6 h、12 h分別刺激1次，再灌注24 h、48 h、72 h分別共刺激2次、3次、4次。

1.5 Western blotting

各組大鼠到各觀察時(shí)間點(diǎn)時(shí)，3.5%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉。斷頭后取右側(cè)缺血區(qū)大腦皮質(zhì)，迅速放入液氮極速冷凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。取缺血區(qū)大腦皮質(zhì)，冰浴加入RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液、苯甲基磺酰氟化物(phenylmethyl sulfonyl fluoride,PMSF)，勻漿器勻漿后靜置5 min，4℃ 12000 g離心20 min。應(yīng)用BCA蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100℃沸水中煮15 min，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｈ【衷钚阅X缺血2 h再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)蛋白檢測(cè)TAX1BP1蛋白的表達(dá)，取局灶性腦缺血2 h再灌注24 h時(shí)間點(diǎn)蛋白檢測(cè)A20的表達(dá)情況；另取局灶性腦缺血2 h再灌注24 h時(shí)間點(diǎn)的缺血區(qū)大腦皮質(zhì)，按照細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取胞核蛋白檢測(cè)NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況。

配制8%SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣量為60 μg，恒壓60～120 V電泳，電轉(zhuǎn)250 mA 2 h，脫脂奶粉常溫封閉2 h，孵育一抗4℃過(guò)夜，一抗為TAX1BP1(ab176572 1∶ 2000)、 A20(23456-1-AP 1∶ 200)、NF-κB p65(6956S 1∶1000)、β-actin(20536-1-AP 1∶2000)、Lamin B1(A2452 1∶800)，TBST充分漂洗15 min，共3次，孵育抗兔二抗(1∶3000)或抗小鼠二抗(1∶3000)37℃1 h，TBST再次漂洗后顯影儀顯影，配套軟件FUSION-CAPT分析條帶灰度值，β-actin為TAX1BP1和A20的內(nèi)參，Lamin B1為NF-κB p65的內(nèi)參，目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值為所得圖像結(jié)果。

1.6 免疫熒光檢測(cè)

各組局灶性腦缺血2 h再灌注24 h時(shí)，用3.5%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉，“V”形剪開大鼠肋骨，充分暴露心臟，用生理鹽水及4%多聚甲醛經(jīng)心尖主動(dòng)脈灌流固定。取大鼠腦組織，多聚甲醛浸泡24 h，30%蔗糖脫水、切片制備冰凍切片，晾干5 min，PBS沖洗10 min，共3次。3%triton破膜，PBS漂洗，山羊血清封閉37℃2 h，TAX1BP1熒光單標(biāo)采用孵育TAX1BP1兔單克隆一抗(1∶50)，TAX1BP1與A20共標(biāo)采用孵育TAX1BP1兔單克隆抗體(1∶50)和A20小鼠單克隆一抗(1∶50)，4℃過(guò)夜，37℃復(fù)溫2 h，PBS沖洗15 min，共3次，山羊抗兔熒光二抗(避光1∶100)或山羊抗兔熒光二抗(避光1∶100)及山羊抗小鼠熒光二抗(1∶100)37℃孵育2 h，PBS沖洗10 min，共3次，DAPI染核(避光)后封片。盲法激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察缺血區(qū)大腦皮質(zhì)。每個(gè)樣本隨機(jī)選取缺血區(qū)大腦皮質(zhì)5個(gè)視野拍照，傳入Photoshop CS5計(jì)數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)為蛋白(紅色熒光)和胞核(藍(lán)色熒光)共同表達(dá)的細(xì)胞計(jì)數(shù)，參照Z(yǔ)han等[11]陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

各組大鼠局灶性腦缺血2 h再灌注24 h時(shí)，用3.5%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉，“V”形剪開大鼠肋骨，充分暴露心臟，用生理鹽水及4%多聚甲醛經(jīng)心尖主動(dòng)脈灌流固定。取大鼠腦組織，多聚甲醛充分固定后包埋、切片。切片脫蠟至水，抗原修復(fù)液37℃孵育2 h，3%H2O2去離子水常溫孵育10 min，PBS沖洗3 min，共3次，加NF-κB p65一抗(1∶100)孵育4℃過(guò)夜，PBS沖洗3 min，共3次，滴加生物素化二抗工作液室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min，共3次，滴加殘根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min，共3次，DAB顯色液顯色，復(fù)染、脫水、透明、封片。盲法自動(dòng)顯微鏡400倍下觀察缺血區(qū)大腦皮質(zhì)。

結(jié)果判定：細(xì)胞核表達(dá)為藍(lán)色，陽(yáng)性結(jié)果為棕色，棕色和藍(lán)色重合為NF-κB p65表達(dá)在胞核，棕色表達(dá)在藍(lán)色周圍為NF-κB p65表達(dá)在胞漿。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用(xˉ±s)表示。不同組別相同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析，LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間均數(shù)的兩兩比較。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分

假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀。與假手術(shù)組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分均升高(P＜0.05)；與模型組比較，電針組在再灌注48 h、72 h時(shí)，神經(jīng)功能評(píng)分降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)評(píng)分

2.2 TAX1BP1蛋白

三組各時(shí)間點(diǎn)缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中TAX1BP1蛋白表達(dá)均有非常顯著性差異(P＜0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組在再灌注12 h、24 h、48 h時(shí)，缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中TAX1BP1蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)；與模型組比較，電針組在再灌注12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)進(jìn)一步增加(P＜0.05)，再灌注24 h為表達(dá)高峰。見表2、圖1。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中TAX1BP1蛋白表達(dá)水平

圖1 Western blotting檢測(cè)各組缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中TAX1BP1蛋白表達(dá)

2.3 A20、胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)

局灶性腦缺血2 h再灌注24 h后，三組間A20、胞核NF-κB p65表達(dá)水平均有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。與假手術(shù)組比較，模型組A20、胞核NF-κB p65表達(dá)增加(P＜0.05)；與模型組相比，電針組A20表達(dá)增加(P＜0.05)，胞核NF-κB p65表達(dá)減少(P＜0.05)。見表3、圖2。

2.4 TAX1BP1蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

再灌注24 h后，三組TAX1BP1蛋白均主要表達(dá)在胞漿中，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)組間均數(shù)比較有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。與假手術(shù)組相比，模型組TAX1BP1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加(P＜0.05)；與模型組相比，電針組相比表達(dá)進(jìn)一步增加(P＜0.05)。見表4、圖3。

2.5 NF-κB p65蛋白的表達(dá)位置

局灶性腦缺血2 h再灌注24 h后，模型組NF-κB p65蛋白主要表達(dá)在胞核，電針組的NF-κB p65蛋白主要表達(dá)在胞漿。見圖4。

2.6 TAX1BP1與A20共表達(dá)

局灶性腦缺血2 h再灌注24 h后，電針組TAX1BP1和A20共表達(dá)在胞漿。見圖5。

圖2 Western blotting檢測(cè)各組缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中A20、胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平

圖3 缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中TAX1BP1蛋白表達(dá)(免疫熒光染色，200×)

圖4 各組缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中NF-κB p65蛋白的表達(dá)位置(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖5 電針組缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中TAX1BP1與A20共表達(dá)(免疫熒光染色，200×)

表3 各組大鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中A20、胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平

表4 各組大鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中TAX1BP1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

3 討論

腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)，其中高達(dá)80%為缺血性腦卒中[14-15]。炎癥反應(yīng)貫穿腦缺血早期，主要發(fā)揮炎性損傷作用[15]；而再灌注將會(huì)加重炎性損傷、氧化應(yīng)激、腦水腫[16]。NF-κB信號(hào)通路是炎性損傷的主要信號(hào)通路[17]。靜息狀態(tài)下，NF-κB分子以二聚體形式(以p65/p50最廣泛)存在于胞漿內(nèi)，并與NF-κB的抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)結(jié)合形成復(fù)合物。IκB能夠遮蔽NF-κB的核定位信號(hào)，使其處于失活狀態(tài)，不能進(jìn)入胞核啟動(dòng)相關(guān)炎癥因子的基因表達(dá)[18-19]。腦缺血再灌注后，多種表面受體激活，引起下游IκB激酶(IκB kinase.IKK)復(fù)合物磷酸化。磷酸化的IKK激活下游的IκB，引起IκB的磷酸化及泛素化，最終導(dǎo)致蛋白酶體的降解，從而釋放NF-κB入核，轉(zhuǎn)錄多種炎性因子[20]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針刺激大鼠百會(huì)穴和四關(guān)穴能促進(jìn)大鼠局灶性腦缺血再灌注的神經(jīng)功能恢復(fù)，并應(yīng)用NF-κB信號(hào)通路阻滯劑NBD多肽證實(shí)電針通過(guò)下調(diào)IKK的表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，抑制局灶性腦缺血再灌注早期的炎性損傷[10]。本研究通過(guò)行為學(xué)評(píng)分證實(shí)，電針能夠促局灶性腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，并通過(guò)Western blotting和免疫組化證實(shí)電針能抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位，支持電針能有效抑制腦缺血再灌注后NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)炎性損傷的觀點(diǎn)，并與我們前期研究相符[9-11,21-22]。

電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注后下游NF-κB信號(hào)通路的抑制作用已得到證實(shí)，但是電針的“真正調(diào)控靶點(diǎn)”，有待進(jìn)一步研究。TAX1BP1能夠有效抑制NF-κB炎癥相關(guān)信號(hào)通路。TAX1能夠同時(shí)激活I(lǐng)KK、誘導(dǎo)IκB蛋白的降解、直接作用于NF-κB的亞基，從而增強(qiáng)NF-κB信號(hào)通路的激活[23]。上調(diào)TAX1BP1蛋白表達(dá)，能有效抑制TAX1誘導(dǎo)的NF-κB激活，A20可能參與其中[7,24]。但也有研究表明，TAX1BP1能夠與視神經(jīng)蛋白結(jié)合增強(qiáng)TAX1誘導(dǎo)的NF-κB激活作用[25]。這可能與TAX1BP1結(jié)合的蛋白有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)是促炎因子激活NF-κB信號(hào)通路上游IKK的關(guān)鍵靶點(diǎn)，而TAX1BP1通過(guò)與TRAF6和A20相互作用，抑制TRAF6介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活[26-27]。A20調(diào)節(jié)TRAF6需要TAX1BP1[28]。以上提示A20在TAX1BP1抑制NF-κB信號(hào)通路激活中發(fā)揮重要作用。A20具有泛素連接酶和去泛素化酶的雙重泛素編輯酶作用，從而阻斷各種炎癥介質(zhì)對(duì)IKK的激活，使NF-κB處于封閉狀態(tài)[29-30]。

本課題組前期已經(jīng)證實(shí)，電針通過(guò)上調(diào)局灶性腦缺血再灌注后A20的表達(dá)，抑制IKK的磷酸化，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮減輕局灶性腦缺血再灌注后炎性損傷和促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的作用[11]。而TAX1BP1能夠招募、結(jié)合A20，減少IKK的磷酸化，有效抑制NF-κB信號(hào)通路的激活；當(dāng)TAX1BP1沉默后，A20不能發(fā)揮其抗炎作用[7]。更有研究表明，TAX1BP1基因敲除的小鼠發(fā)生年齡依賴性的心瓣炎、皮炎，對(duì)低劑量的TNF-α、IL-1β高度敏感[31]。由此本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討電針治療局灶性腦缺血再灌注炎性損傷的作用靶點(diǎn)，探討TAX1BP1在電針治療局灶性腦缺血再灌注中的作用。

目前國(guó)內(nèi)外未見TAX1BP1在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)機(jī)制方面的報(bào)道，所以本研究采用多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6～72 h)探討TAX1BP1在局灶性腦缺血再灌注早期時(shí)間表達(dá)規(guī)律，結(jié)果顯示，局灶性腦缺血再灌注后，內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制一定程度地提高TAX1BP1，而電針能進(jìn)一步上調(diào)TAX1BP1的表達(dá)，并持續(xù)至再灌注后72 h，提示電針可能通過(guò)上調(diào)TAX1BP1的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)，電針能夠上調(diào)A20的表達(dá)，抑制局灶性腦缺血再灌注后NF-κB p65介導(dǎo)的炎性損傷，且在再灌注24 h時(shí)，電針上調(diào)A20表達(dá)，抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的作用尤為明顯[10-11]。本研究結(jié)果亦顯示，電針上調(diào)TAX1BP1的表達(dá)在24 h時(shí)達(dá)到高峰，提示在再灌注24 h時(shí)，電針通過(guò)上調(diào)TAX1BP1的表達(dá)，招募、結(jié)合A20發(fā)揮抑制NF-κB信號(hào)通路激活的作用最為顯著，故本研究再次選取再灌注24 h為觀察時(shí)間點(diǎn)，定位觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)中TAX1BP1、A20、胞核NF-κB p65的表達(dá)情況以及TAX1BP1與A20的共標(biāo)情況。免疫熒光檢測(cè)顯示，TAX1BP1主要表達(dá)在胞漿中，電針干預(yù)后TAX1BP1仍主要表達(dá)在胞漿中，但是電針能夠上調(diào)TAX1BP1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，再次提示電針可能通過(guò)上調(diào)TAX1BP1的表達(dá)，減輕局灶性腦缺血再灌注損傷。本研究通過(guò)Western blotting和免疫組化再次證實(shí)電針能夠上調(diào)A20的表達(dá)，抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位，且免疫熒光共標(biāo)顯示，電針干預(yù)后TAX1BP1與A20共同表達(dá)在胞漿中，提示電針通過(guò)上調(diào)TAX1BP1的表達(dá)，招募、結(jié)合A20發(fā)揮抗NF-κB p65介導(dǎo)的炎性損傷作用。由于實(shí)驗(yàn)條件所限，未應(yīng)用免疫共沉淀的方法檢測(cè)電針對(duì)TAX1BP1與A20結(jié)合量的影響。

綜上所述，電針抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，發(fā)揮腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)TAX1BP1蛋白的表達(dá)，招募、結(jié)合A20，從而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減輕局灶性腦缺血再灌注后的炎性損傷，促進(jìn)大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究首次在局灶性腦缺血再灌注損傷中研究TAX1BP1的可能作用機(jī)制。進(jìn)一步研究TAX1BP1的抗炎性損傷作用，將為電針治療提供新的理論依據(jù)。

[1]賈建平,陳生弟.神經(jīng)病學(xué)[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:170.

[2]Abou-Chebl A.Management of acute ischemic stroke[J].Curr Cardiol Rep,2013,15(4):348.

[3]Liu L,Wang D,Wong KS,et al.Stroke and stroke care in China:huge burden,significant workload,and a national priority[J].Stroke,2011,42(12):3651-3654.

[4]Petrovic-Djergovic D,Goonewardena SN,Pinsky DJ.Inflam-matory disequilibrium in stroke[J].Circ Res,2016,119(1):142-158.

[5]Shih RH,Wang CY,Yang CM.NF-kappaB signaling pathways in neurological inflammation:a mini review[J].Front Mol Neurosci,2015,8:77.

[6]Chin KT,Chun AC,Ching YP,et al.Human T-cell leukemia virus oncoprotein tax represses nuclear receptor-dependent transcription by targeting coactivator TAX1BP1[J].Cancer Res,2007,67(3):1072-1081.

[7]Shembade N,Harhaj NS,Liebl DJ,et al.Essential role for TAX1BP1 in the termination of TNF-alpha-,IL-1-and LPS-mediated NF-kappaB and JNK signaling[J].EMBO J,2007,26(17):3910-3922.

[8]Lim SM,Yoo J,Lee E,et al.Acupuncture for spasticity after stroke:a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].Evid Based Complement Alternat Med,2015,2015:870398.

[9]秦文熠,羅勇,余超.電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬內(nèi)白介素-1β及轉(zhuǎn)錄核因子κB抑制蛋白激酶的影響[J].針刺研究,2013,38(4):271-276.

[10]Qin WY,Luo Y,Chen L,et al.Electroacupuncture could regulate the NF-κB signaling pathway to ameliorate the inflammatory injury in focal cerebral ischemia/reperfusion model rats[J].Evid Based ComplementAlternat Med,2013,2013:924541.

[11]Zhan J,Qin W,Zhang Y,et al.Upregulation of neuronal zinc finger protein A20 expression is required for electroacupuncture to attenuate the cerebral inflammatory injury mediated by the nuclear factor-kB signaling pathway in cerebral ischemia/reperfusion rats[J].J Neuroinflammation,2016,13(1):258.

[12]華興邦,周浩良.大鼠穴位圖譜的研制[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn),1991(1):1-5.

[13]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[14]Writing Group Members.Mozaffarian D,Benjamin EJ,Go AS,et al.Executive summary:heart disease and stroke statistics－2016 update:a report from the American Heart Association[J].Circulation,2016,133(4):447-454.

[15]Vidale S,Consoli A,Arnaboldi M,et al.Postischemic inflammation in acute stroke[J].J Clin Neurol,2017,13(1):1-9.

[16]Carden DL,Granger DN.Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury[J].J Pathol,2000,190(3):255-266.

[17]Mezzasoma L,Antognelli C,Talesa VN.A novel role for brain natriuretic peptide:Inhibition of IL-1β secretion via downregulation of NF-κB/Erk 1/2 and NALP3/ASC/caspase-1 activation in human THP-1 monocyte[J].Mediators Inflamm,2017,2017:5858315.

[18]Verma IM,Stevenson JK,Schwarz EM,et al.Rel/NF-kappa B/I kappa B family:intimate tales of association and dissociation[J].Genes Dev,1995,9(22):2723-2735.

[19]Baeuerle PA,Baltimore D.NF-kappa B:ten years after[J].Cell,1996,87(1):13-20.

[20]Miyamoto S.Nuclear initiated NF-κB signaling:NEMO and ATM take center stage[J].Cell Res,2011,21(1):116-130.

[21]Lan L,Tao J,Chen A,et al.Electroacupuncture exerts anti-inflammatory effects in cerebral ischemia-reperfusion injured rats via suppression of the TLR4/NF-κB pathway[J].Int J Mol Med,2013,31(1):75-80.

[22]Liu W,Wang X,Zheng Y,et al.Electroacupuncture inhibits inflammatory injury by targeting the miR-9-mediated NF-κB signaling pathway following ischemic stroke[J].Mol Med Rep,2016,13(2):1618-1626.

[23]Boxus M,Twizere JC,Legros S,et al.The HTLV-1 Tax interactome[J].Retrovirology,2008,5:76.

[24]Iha H,Kasai T,Kibler KV,et al.Pleiotropic effects of HTLV type 1 Tax protein on cellular metabolism:mitotic checkpoint abrogation and NF-kappaB activation[J].AIDS Res Hum Retroviruses,2000,16(16):1633-1638.

[25]Journo C,Filipe J,About F,et al.NRP/Optineurin Cooperates with TAX1BP1 to potentiate the activation of NF-kappaB by human T-lymphotropic virus type 1 tax protein[J].PLoS Pathog,2009,5(7):e1000521.

[26]Chen ZJ.Ubiquitination in signaling to and activation of IKK[J].Immunol Rev,2012,246(1):95-106.

[27]Morriswood B,Ryzhakov G,Puri C,et al.T6BP and NDP52 are myosin VI binding partners with potential roles in cytokine signalling and cell adhesion[J].J Cell Sci,2007,120(Pt 15):2574-2585.

[28]Bannon A,Zhang SD,Schock BC,et al.Cystic fibrosis from laboratory to bedside:the role of A20 in NF-κB-mediated inflammation[J].Med Princ Pract,2015,24(4):301-310.

[29]Wertz IE,O'Rourke KM,Zhou H,et al.De-ubiquitination and ubiquitin ligase domains of A20 downregulate NF-kappaB signaling[J].Nature,2004,430(7000):694-699.

[30]Skaug B,Chen J,Du F,et al.Direct,noncatalytic mechanism of IKK inhibition byA20[J].Mol Cell,2011,44(4):559-571.

[31]Iha H,Peloponese JM,Verstrepen L,et al.Inflammatory cardiac valvulitis in TAX1BP1-deficient mice through selective NF-kappaB activation[J].EMBO J,2008,27(4):629-641.

Effect of Electroacupuncture at Baihui and Siguan on Expression of Tax1-binding Protein 1 in Cerebral Cortex in Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Rats

MA Hong-mei1a,2,JIANG Jin1a,2,ZHAN Jian1a,2,LI Qiong-li1a,2,ZHANG Ying1a,2,QIN Wen-yi1b,LUO Yong1a,2
1.a.Department of Neurology,b.Department of Integrated Chinese and Western Medicine,the FirstAffiliated Hospital of Chonqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.Chongqing Key laboratory of Neurology,Chongqing 400016,China

ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture(EA)at Baihui(GV20)and Siguan(Hegu/LI4 and Taichong/LR3)of affected side on expression of Tax1-binding protein 1(TAX1BP1)in cerebral cortex in focal cerebral ischemia-reperfusion rats,so as to investigate its protective mechanism in inhibiting nuclear factor kappa B(NF-κB)signaling pathway and promoting neurobehavioral recovery.MethodsA total of 105 Sprague-Dawley rats were randomly assigned into sham group,model group and EA group.Each group was randomly assigned into reperfusion six hours,twelve hours,24 hours,48 hours,72 hours groups after two hours of ischemia.The model was established by right middle cerebral artery occlusion and reperfusion.EA group

electroacupuncture at Baihui and left Siguan(Hegu and Taichong)acupoints.Neurobehavioral evaluation,TAX1BP1 protein expression,TAX1BP1 positive cell count,zink finger protein A20 expression,and nuclear NF-κB p65 protein expression were tested in each group.ResultsThere was no neurological deficit in the sham group.Compared with the model group,the neurological scores at 48 hours,72 hours after reperfusion decreased in EA group(P＜0.05).Compared with the control group,the TAX1BP1 expression at twelve hours,24 hours and 48 hours after reperfusion increased in the model group(P＜0.05),and further increased at twelve hours,24 hours,48 hours and 72 hours after reperfusion in EA group(P＜0.05),and peakedat 24 hours after reperfusion.Compared with the sham group,the expression of A20 and NF-κB p65,and the number of TAX1BP1 positive cells increased in the model group(P＜0.05),and the expression of A20 and the number of TAX1BP1 positive cells further increased,(P＜0.05)and the expression of NF-κB p65 decreased in EA group(P＜0.05)at 24 hours after reperfusion.Immunofluorescence labeling indicated that TAX1BP1 protein primarily expressed in the cytoplasm,TAX1BP1 protein and A20 protein co-expressed in the cytoplasm.Immunohistochemistry showed indicated that NF-κB p65 mainly expressed in the nucleus in the model groupr,and mainly expressed in the cytoplasm in the EA group.ConclusionElectroacupuncture could significantly inhibit neuronal NF-κB signaling pathway and promote neurobehavioral recovery in focal cerebral ischemia-reperfusion,which may related with up-regulating TAX1BP1 protein expression.

LUO Yong.E-mail:luoyong1998@163.com

cerebral ischemia-reperfusion;electroacupuncture;Tax1-binding protein 1;zink finger protein A20;nuclear factor kappa B p65;rats

R743.3

A

1006-9771(2017)12-1372-08

[本文著錄格式]馬宏梅，蔣錦，詹劍，等.電針百會(huì)、四關(guān)穴對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)中Tax1結(jié)合蛋白1表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(12):1372-1379.

CITED AS:Ma HM,Jiang J,Zhan J,et al.Effect of electroacupuncture at Baihui and Siguan on expression of tax1-binding protein 1 in cerebral cortex in focal cerebral ischemia-reperfusion rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(12):1372-1379.

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30470606;No.81403243)；2.重慶市渝中區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.20160102)；3.重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(No.2012-2-128)。

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，a.神經(jīng)內(nèi)科，b.中西醫(yī)結(jié)合科，重慶市400016；2.重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400016。作者簡(jiǎn)介：馬宏梅(1990-)，女，布依族，貴州龍里縣人，碩士研究生，主要研究方向：針刺治療腦血管病的保護(hù)機(jī)制。通訊作者：羅勇(1965-)，男，漢族，重慶市人，博士，博士生導(dǎo)師，研究員，主要研究方向：腦血管病的損傷及保護(hù)機(jī)制。E-mail:luoyong1998@163.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.12.002

2017-07-18

2017-11-08)