針康法對腦缺血大鼠缺血半暗區(qū)細胞凋亡及X連鎖凋亡抑制蛋白和cleaved-caspase-9蛋白表達的影響①

唐強，田源，葉濤，朱路文，阮野，趙彬，陳慧杰，王雪

·專題·

針康法對腦缺血大鼠缺血半暗區(qū)細胞凋亡及X連鎖凋亡抑制蛋白和cleaved-caspase-9蛋白表達的影響①

唐強1，田源2，葉濤2，朱路文1，阮野1，趙彬1，陳慧杰1，王雪2

目的觀察針康法對腦缺血大鼠缺血半暗區(qū)細胞凋亡及X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)和cleaved-caspase-9蛋白表達的影響。方法選取180只雄性Sprague-Dawley大鼠，通過隨機數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組。每組再分為3 d、7 d和14 d三個亞組(n=12)。采用改良Longa線栓法進行造模，假手術(shù)組和模型組不予治療，針刺組進行頭穴叢刺治療，康復(fù)組進行跑臺康復(fù)訓(xùn)練，針康組進行針康法治療。術(shù)后各時間點對大鼠進行改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)后取材，采用TUNEL染色觀察大鼠腦缺血半暗區(qū)細胞凋亡率，Western blotting檢測腦缺血半暗區(qū)XIAP和cleaved-caspase-9蛋白表達。結(jié)果術(shù)后各時間點，與模型組比較，各治療組mNSS評分均降低(P＜0.05)，細胞凋亡率均降低(P＜0.05)，XIAP蛋白表達上調(diào)(P＜0.05)，cleaved-caspase-9蛋白表達下調(diào)(P＜0.05)；與針刺組、康復(fù)組比較，針康組細胞凋亡率進一步降低(P＜0.05)，XIAP蛋白表達進一步上調(diào)(P＜0.05)。術(shù)后7 d、14 d，針康組mNSS評分進一步降低(P＜0.05)，針康組cleaved-caspase-9蛋白表達進一步下調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論針康法能降低腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損，優(yōu)于單獨的頭穴叢刺和康復(fù)訓(xùn)練，其機制可能與促進XIAP蛋白表達，抑制caspase-9蛋白活化，從而減少細胞凋亡有關(guān)。

腦缺血；神經(jīng)功能；針康法；凋亡；X連鎖凋亡抑制蛋白；cleaved-caspase-9；大鼠

缺血性腦卒中作為臨床常見疾病，約占腦卒中發(fā)病的80%，主要是由于各種原因引起大腦血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致局部腦組織缺血缺氧發(fā)生壞死，從而引起運動、感覺、言語和認知等功能障礙的一類臨床疾病[1]。針康法是在頭穴叢刺時進行康復(fù)訓(xùn)練并長時間留針的方法，具有“針康同步、動態(tài)治療、整體康復(fù)”的優(yōu)點，在臨床上對腦卒中后痙攣狀態(tài)、運動功能和言語功能障礙有顯著的療效[2-4]，但其機制還有待進一步闡明[5]。細胞凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis,IAPs)家族中X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是最有效的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)抑制物，通過其氨基端的BIR3與caspase-9結(jié)合使其失活無法裂解為cleaved-caspase-9，從而抑制細胞凋亡[6-8]。本實驗通過觀察針康法對大鼠腦缺血后神經(jīng)功能及缺血半暗區(qū)細胞凋亡的影響，同時檢測缺血半暗區(qū)XIAP和cleaved-caspase-9蛋白表達水平，探討針康法神經(jīng)保護作用的相關(guān)機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，鼠齡10～12周，初始體質(zhì)量240～260 g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，動物使用許可證號SYXX(黑)2010007。飼養(yǎng)條件：室溫(24±1)℃，濕度(65±10)%，噪音小于60 dB，通氣良好，明暗光照交替各12 h，自由食水。實驗前大鼠進行適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，15 m/min，每天15 min，共3 d。篩選自愿跑臺訓(xùn)練的大鼠180只進行實驗。實驗過程中的動物飼養(yǎng)及取材嚴格遵循實驗動物倫理準則和指南相關(guān)的規(guī)定。

將180只大鼠從1至180進行編號后，計算機隨機生成180個數(shù)字，隨機選取一個數(shù)字作為起始點與編號1號的大鼠相對應(yīng)，從左至右、由上而下分別對應(yīng)1至180號大鼠。用隨機數(shù)字除以5得的余數(shù)0、1、2、3、4對應(yīng)假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組，最終每組各分得36只大鼠。各組再分成3 d、7 d、14 d 3個亞組(n=12)。

造模失敗或者實驗中死亡的大鼠另外補充。

1.2 主要試劑及儀器

XIAP、cleaved-caspase-9多克隆抗體：美國CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。PVDF膜：美國MILLIPORE公司。TEMED：美國AMRESCO公司。內(nèi)參抗體β-actin、羊抗兔IgG-HRP：沈陽萬類生物科技有限公司。TUNEL檢測試劑盒：德國ROCHE公司。預(yù)染蛋白分子量標準：加拿大FERMENTAS公司。ECL發(fā)光液：上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。

一次性無菌針灸針：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。ZH-PT型動物實驗跑臺：徐州利華電子科技發(fā)展有限公司。H-2050R型超速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)、DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽、DY-CZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀、WD-9405B型水平搖床：北京六一生物科技有限公司。ELX-800型酶標儀：美國BIOTEK公司。RM2235型切片機：德國LEICA公司。DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特儀器有限公司。NW10LVF型超純水系統(tǒng)：香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。Proline型微量移液器：芬蘭BIOHIT公司。

1.3 造模及入組標準

根據(jù)改良Longa線栓法[9]對大鼠進行腦缺血模型的制備。術(shù)前12 h大鼠禁食不禁水，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg對大鼠進行麻醉。麻醉后將大鼠固定于恒溫手術(shù)臺(36～37℃)，在頸部用酒精進行消毒后，頸前正中線切口。鈍性剝離皮下肌肉組織，找到右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈，用微動脈夾閉阻頸內(nèi)動脈離心端血流，然后在下方3～4 mm處用2 ml注射器針頭刺入頸總動脈形成“V”形缺口，將制備好的前端2 mm過蠟、長3 cm的魚線沿缺口插入頸總動脈后，打開動脈夾，將魚線繼續(xù)插入頸內(nèi)動脈，當(dāng)遇到阻力時停止并打死結(jié)固定線栓，完成后進行縫合消毒。

假手術(shù)組不插入魚線，其余處理方式相同。

24 h后進行Longa評分，保留1～3分大鼠入組。

1.4 干預(yù)方法

假手術(shù)組、模型組術(shù)后不進行任何治療，僅進行與其他組同等條件的抓取。

針刺組術(shù)后24 h采用直徑0.25 mm、長25 mm針灸針，選取大鼠百會穴和百會穴左、右各旁開2 mm處針刺，快速捻轉(zhuǎn)1 min后留針2 h[10]。每天1次。

康復(fù)組術(shù)后24 h進行電動跑臺訓(xùn)練，每天30 min；第 1～3天 8 m/min，第4～7天12 m/min，7 d后15 m/min；坡度0°[11]。每天1次。

針康組術(shù)后24 h，在頭穴叢刺針長留針治療期間，同步進行跑臺訓(xùn)練。針刺方案同針刺組，跑臺訓(xùn)練方案同康復(fù)組。每天1次。

1.5 神經(jīng)功能缺損評估

在各時間點采用14分制改良神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Score,mNSS)[10]評估各組大鼠神經(jīng)功能。

1.6 TUNEL染色

各時間點各組大鼠mNSS評分后，每組取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛4 ml/kg深度麻醉大鼠后暴露心臟，采用生理鹽水和4%多聚甲醛進行在體灌流，待大鼠肺組織變白、四肢僵硬后迅速斷頭取腦，常規(guī)制備5μm石蠟切片后進行TUNEL染色。切片脫蠟、水合后滴加0.1%TritonX-100溶液50 μl，室溫靜置8 min，PBS漂洗5 min，共3次；滴加3%H2O250 μl，室溫靜置10 min，PBS漂洗后滴加TUNEL反應(yīng)液50 μl，避光條件下37℃孵育60 min，再次PBS漂洗。滴加DAB顯色液50 μl，鏡下觀察染色深度，完成后入水終止反應(yīng)。PBS漂洗后進行蘇木素復(fù)染，最后將返藍的切片依次放入上行梯度乙醇中脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察采圖，每例樣本取3個不同視野進行計數(shù)，以其均值代表該樣本的TUNEL陽性細胞數(shù)。

1.7 Western blotting

各時間點各組大鼠mNSS評分后，每組取6只大鼠，深度麻醉后斷頭取鮮腦，取大腦中動脈梗死周邊區(qū)組織，液氮速凍5 min后置于-80℃冰箱保存。取樣本加入細胞裂解液，低溫離心分離上清液為所需蛋白。BCA測定樣本蛋白總濃度，上樣體積20 μl，含蛋白40 μg。10%SDS-PAGE電泳分離目的蛋白(80 V,2.5 h)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(80 V,1.5 h)。用TTBS緩沖液配制5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，加入XIAP一抗(1∶100)4℃過兩夜、cleaved-caspase-9一抗(1∶1000)4℃過夜，后分別加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5000)，37℃下XIAP孵育2 h、cleaved-caspase-9孵育45 min。洗膜后ECL發(fā)光試劑孵育5 min，顯影后拍攝。內(nèi)參β-action稀釋比1∶1000，檢測過程同XIAP和cleaved-caspase-9一抗。Gel-Pro-Analyzer 4.0分析定量分析反應(yīng)條帶灰度值，每組條帶分別進行3次分析，以模型組灰度為1，得到其余4組的蛋白表達相對灰度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，最終mNSS評分、TUNEL染色細胞凋亡率與XIAP、cleaved-caspase-9蛋白相對表達量均以(xˉ±s)表示。采用單因素方差分析(ANOVA)比較各組間差異，LSD-t檢驗比較兩兩之間差異。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 mNSS評分

各時間點，假手術(shù)組大鼠mNSS評分均為0。與假手術(shù)組比較，模型組mNSS評分升高(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組mNSS評分降低(P＜0.05)；術(shù)后7 d、14 d，與針刺組、康復(fù)組相比，針康組mNSS評分降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠各時間點mNSS評分

2.2 缺血半暗區(qū)細胞凋亡

TUNEL陽性細胞為圓形或橢圓形，細胞核固縮，核內(nèi)可見棕褐色的TUNEL反應(yīng)產(chǎn)物，細胞核呈半月形或環(huán)狀，主要位于缺血半暗帶區(qū)。假手術(shù)組大鼠大腦皮層內(nèi)幾乎未見TUNEL染色陽性細胞，神經(jīng)元排列整齊，核仁清晰可見。見圖1。

與假手術(shù)組比較，各時間點模型組TUNEL染色細胞凋亡率升高(P＜0.05)；與模型組比較，各時間點各治療組TUNEL染色細胞凋亡率降低(P＜0.05)；與康復(fù)組、針刺組比較，針康組TUNEL染色細胞凋亡率進一步降低(P＜0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠各時間點缺血半暗區(qū)細胞凋亡情況(TUNEL染色，400×，bar=50 μm)

表2 各組大鼠各時間點TUNEL染色細胞凋亡率(%)

2.3 缺血半暗區(qū)XIAP蛋白表達

各時間點上，假手術(shù)組均可見XIAP蛋白表達。與假手術(shù)組比較，各時間點上模型組XIAP蛋白表達降低(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組各時間點XIAP蛋白表達均升高(P＜0.05)；與針刺組和康復(fù)組比較，針康組各時間點XIAP蛋白表達均增加(P＜0.05)。見圖2、表3。

圖2 Western blotting檢測各組XIAP蛋白表達

表3 各組大鼠各時間點XIAP蛋白表達

2.4 缺血半暗區(qū)cleaved-caspase-9蛋白表達

各時間點上，假手術(shù)組均能見cleaved-caspase-9蛋白表達。與假手術(shù)組比較，模型組造模后各時間點cleaved-caspase-9表達增加(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組各時間點cleaved-caspase-9表達均下降(P＜0.05)；與針刺組和康復(fù)組相比較，術(shù)后7 d、14 d，針康組cleaved-caspase-9表達降低(P＜0.05)。見圖3、表4。

圖3 Western blotting檢測各組cleaved-caspase-9蛋白表達

表4 各組大鼠各時間點cleaved-caspase-9蛋白表達

3 討論

本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，針康法可以縮小腦梗死灶，降低神經(jīng)功能缺損，從而促進運動和認知功能的恢復(fù)，其機制與對抗細胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、促進軸突與血管再生等多個方面有關(guān)[5,12-15]。本研究mNSS結(jié)果表明，針康法在改善大鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺損方面優(yōu)于單一的針刺或康復(fù)治療，且遠期療效更為明顯。腦缺血后細胞凋亡率升高，3 d最明顯，7 d、14 d逐漸緩解。經(jīng)過針刺、康復(fù)和針康法治療后，各時間點細胞凋亡率降低，提示針刺、康復(fù)和針康法均能降低腦缺后神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量，其中針康法效果最佳，表明針康法能有效抑制腦缺血引起的細胞凋亡，優(yōu)于單純康復(fù)和針刺。

細胞凋亡有三條途徑，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷途徑、細胞凋亡線粒體途徑和死亡受體途徑[16-17]，腦缺血細胞凋亡主要以線粒體途徑為主。由于缺血區(qū)腦神經(jīng)細胞受缺血和缺氧的刺激，發(fā)生線粒體膜的去極化和電位下降，使細胞色素C從線粒體中被釋放，激活線粒體依賴的caspase-9，并剪切活化為cleaved-caspase-9，繼而活化下游caspase-3、caspase-6、caspase-7，直接引起腦缺血區(qū)細胞的凋亡[18-19]。其他兩條通路最后也都激活caspase介導(dǎo)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)，引起細胞凋亡程序，最終導(dǎo)致細胞死亡[20]。在細胞凋亡中，不論是線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑還是死亡受體途徑，三者都與caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[21]。

XIAP是IAPs家族中最主要的凋亡抑制蛋白，通過氨基端的BIR1、BIR2、BIR3可抑制caspase-3、caspase-7、caspase-9的活化，從而抑制細胞凋亡[22]。在線粒體途徑中，XIAP可以通過其氨基端BIR3與caspase-9蛋白結(jié)合，使細胞色素C難以與未活化的caspase-9結(jié)合活化為cleaved-caspase-9引起細胞凋亡，同時也使與XIAP結(jié)合的caspase-9無效化[23]。在缺血性腦卒中中，XIAP的表達呈逐漸下降趨勢；隨著XIAP蛋白表達的下降，線粒體途徑下caspase-9被活化為cleaved-caspase-9，從而使細胞凋亡[24]。曾芳等[25]發(fā)現(xiàn)電針對阿爾茨海默病治療效應(yīng)的發(fā)揮可能與抑制caspase-9蛋白表達和增加XIAP蛋白表達，從而抑制細胞凋亡線粒體途徑的級聯(lián)反應(yīng)，減少細胞凋亡有關(guān)。趙雯等[26]研究發(fā)現(xiàn)，肝豆湯改良方通過上調(diào)XIAP蛋白的表達，下調(diào)caspase-9、caspase-3蛋白及其mRNA在腦組織中的表達，減輕銅沉積對神經(jīng)細胞的氧化應(yīng)激損傷，從而抑制神經(jīng)細胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血發(fā)生后，在缺氧缺血損傷作用下，caspase-9被持續(xù)活化為cleaved-caspase-9，啟動線粒體凋亡途徑；大量的XIAP在與caspase-9蛋白競爭性結(jié)合抑制其活性轉(zhuǎn)化過程中被消耗，造成XIAP的表達量驟然減少；在無外界干預(yù)的情況下，XIAP的表達水平無明顯上調(diào)，致使cleaved-caspase-9長時間積蓄，細胞凋亡持續(xù)存在。經(jīng)針刺、康復(fù)、針康法干預(yù)后，各時間點XIAP表達均升高，同時cleaved-caspase-9表達下降，細胞凋亡程度緩解，提示三種療法均可通過上調(diào)缺血腦組織中XIAP的表達來抑制由caspase-9活化起始的細胞凋亡，且隨著治療時間延長，針康法的治療效果優(yōu)于單一頭穴叢刺或康復(fù)治療。

綜上所述，針康法可上調(diào)腦缺血后缺血半暗區(qū)XIAP蛋白表達，抑制caspase-9活化，降低線粒體途徑介導(dǎo)的細胞凋亡，從而改善神經(jīng)功能缺損，優(yōu)于單一的頭穴叢刺或康復(fù)治療。后續(xù)我們將采用慢病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)對XIAP介導(dǎo)的細胞凋亡途徑展開深入研究，進一步豐富針康法的神經(jīng)保護作用機理，為針康法的臨床推廣提供理論支撐。

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Effects of Acupuncture-rehabilitation Therapy on Apoptosis and Expression of X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein and Cleaved-caspase-9 in Ischemic Penumbra of Rats with Cerebral Ischemia

TANG Qiang1,TIAN Yuan2,YE Tao2,ZHU Lu-wen1,RUAN Ye1,ZHAO Bin1,CHEN Hui-jie2,WANG Xue2
1.Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China

ObjectiveTo explore the effect of acupuncture-rehabilitation therapy on apoptosis and the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP)and cleaved-caspase-9 in ischemic penumbra of rats with cerebral ischemia.MethodsA total of 180 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group,model group,acupuncture group,rehabilitation group and acupuncture-rehabilitation therapy group.Each group was divided into three days,seven days and 14 days subgroups(n=12).The model was established with the modified Longa suture method.The model group and the sham operation group

no treatment.The acupuncture group received cluster needling of scalp acupuncture,the rehabilitation group received treadmill training,and the acupuncture-rehabilitation therapy group received both acupuncture and treadmill training.On the third,seventh and 14th days after modeling,the neurological function was assessed with modified Neurological Severity Score(mNSS).The apoptosis was observed by TUNEL staining and the expression of XIAP and cleaved-caspase-9 protein was determined by Western blotting in cerebral ischemic penumbra,respectively.ResultsCompared with the model group,the mNSS scores decreased,the rate of apoptosis decreased,the expression of XIAP protein increased,and the expression of cleaved-caspase-9 decreased in each treatment group at each time point(P＜0.05).Compared with the other two treatment groups,the rate of apoptosis further decreased at each time points(P＜0.05),the expression of XIAP protein further increased at each time points(P＜0.05),the mNSS score further decreased(P＜0.05)and the expression of cleaved-caspase-9 protein further decreased(P＜0.05)seven days and 14 days after modeling in the acupuncture-rehabilitation therapy group.ConclusionAcupuncture and rehabilitation therapy could reduce the neurological deficit in rats with cerebral ischemia,which was superior to the simple acupuncture treatment and rehabilitation training.The mechanism may be related to th reduction of apoptosis by promoting XIAP protein expression and inhibiting caspase-9 protein activation.

cerebral ischemia;neurological function;acupuncture-rehabilitation therapy;apoptosis;X-linked apoptosis inhibitory protein;cleaved-caspase-9;rats

TANG Qiang.E-mail:tangqiang1963@163.com

R743.3

A

1006-9771(2017)12-1365-07

[本文著錄格式]唐強，田源，葉濤，等.針康法對腦缺血大鼠缺血半暗區(qū)細胞凋亡及X連鎖凋亡抑制蛋白和cleaved-caspase-9蛋白表達的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2017,23(12):1365-1371.

CITED AS:Tang Q,Tian Y,Ye T,et al.Effects of acupuncture-rehabilitation therapy on apoptosis and expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein and cleaved-caspase-9 in ischemic penumbra of rats with cerebral ischemia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(12):1365-1371.

1.國家自然科學(xué)基金項目(No.81473762;No.81273818)；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)領(lǐng)軍人才計劃項目(No.2012RCL02)；3.黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團隊計劃項目(No.2013TD007)。

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040。作者簡介：唐強(1963-)，男，漢族，四川大竹縣人，博士，教授，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復(fù)基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:tangqiang1963@163.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.12.001

2017-07-17

2017-08-10)