多蕊蛇菰不同提取物及其抑菌活性

歐陽(yáng)錦逵++吳春銀++王小晴++王松++伍慧雄++王軍++單體江

摘 要 采用甲醇冷浸提取法提取多蕊蛇菰次生代謝產(chǎn)物，并通過薄層層析-生物自顯影法和含毒平板法分別測(cè)定了次生代謝產(chǎn)物對(duì)不同供試細(xì)菌和降香黃檀炭疽病菌的抑制活性。結(jié)果表明，多蕊蛇菰乙酸乙酯層提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑制活性最強(qiáng)，其次是正丁醇層，石油醚層提取物的活性最弱；所有提取物對(duì)桉樹青枯病菌均表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制活性。多蕊蛇菰乙酸乙酯層提取物對(duì)降香黃檀炭疽病菌的抑制活性強(qiáng)，EC50值為0.89 mg/mL，正丁醇層次之，EC50值為6.52 mg/mL，石油醚層提取物在供試濃度下未表現(xiàn)出抑制活性。

關(guān)鍵詞 多蕊蛇菰 ；提取物 ；抑菌活性 ；桉樹青枯病菌

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.11.012

The Crude Extracts of Balaophora polyandra and

Their Antimicrobial Activities

OUYANG Jinkui WU Chunyin WANG Xiaoqing

WANG Song WU Huixiong WANG Jun SHAN Tijiang

（Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm， College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University，

Guangzhou， Guangdong， 510642）

Abstract The crude extracts of Balaophora polyandra were extracted by methanol. The thin layer chromatography-bioautography assay and radial growth assay were used for inhibitory activities against different bacteria and Colletotrichum gloeosporioides. The results showed that the ethyl acetate layer extracts showed the strongest inhibitory activity on the bacteria， followed by n-butanol layer crude， and the petroleum ether extract showed the weakest activity； All extracts showed the strongest inhibitory activity on Ralstonia solanacearum. The ethyl acetate crude extracts also showed the best inhibitory activity against Colletotrichum gloeosporioides. and the EC50 value was 0.89 mg/mL. The EC50 value of n-butanol crude extract was 6.52 mg/mL. The petroleum ether extracts didn't show any anti-fungus activity under the test concentration.

Keywords Balaophora polyandra ； crude extracts ； antimicrobial activities ； Ralstonia solanacearum

多蕊蛇菰（Balaophora polyandra Griff.）為蛇菰科蛇菰屬多年生寄生性肉質(zhì)草本植物，俗稱土蓯蓉，常寄生于殼斗科樹木的根上，如錐栗、杜鵑等，分布于我國(guó)四川及華南各省，全草入藥，具有滋陰補(bǔ)腎、止痛的功效，民間常用于治療血虛、出血和淋病等[1-2]。多蕊蛇菰乙醇提取物具有很好的降血糖活性[3]。田金英等[4]發(fā)現(xiàn)多蕊蛇菰提取物對(duì)人的PTP1B酶也具有顯著的抑制活性。王開金等[5]首次對(duì)多蕊蛇菰進(jìn)行化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)部分化合物具有較好的抗氧化活性。招麗娟等[1]發(fā)現(xiàn)植物甲醇提取物具有顯著的抗腫瘤活性。目前，已初步闡明多蕊蛇菰次生代謝產(chǎn)物的主要化學(xué)成分[2，5]，然而尚未見多蕊蛇菰次生代謝產(chǎn)物抗菌活性的報(bào)道。本研究采用甲醇冷浸提取和不同極性溶劑依次萃取的方法，分別制備不同極性的次生代謝產(chǎn)物，并測(cè)定了不同提取物對(duì)不同供試細(xì)菌和真菌的抑制活性，以期為多蕊蛇菰資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)，為植物病害的生物防治提供先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

多蕊蛇菰于2015年9月18日采自廣東省始興縣車八嶺自然保護(hù)區(qū)，標(biāo)本由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院鄭明軒老師鑒定。

1.1.2 供試菌株

大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922，G-）、桉樹青枯病菌[Ralstonia solanacearum （Smith）]Yabuuchi， G-）、黃瓜角斑病菌（Pseudomonas lachrymans ATCC11921，G-）、番茄瘡痂病菌（Xanthomonas vesicatoria ATCC11633，G-）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ATCC11562，G+）、降香黃檀炭疽病菌[Colletotrichum gloeosporioides（Penz） Sacc]，以上菌株均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院森林保護(hù)教研室提供。endprint

1.1.3 儀器與試劑

SW-CJ-2G型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；LRH系列生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；烘干箱（上海?，斣O(shè)備有限公司）；移液槍（Eppendorf公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化公司）；JJ300型電子天平（雙杰測(cè)試儀器廠）；DSX-280KB30手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；ZF-2型三用紫外儀（上海安亭電子儀器廠）。

硫酸鏈霉素（美國(guó)Sigma公司）；98.4%多菌靈（中國(guó)農(nóng)科院植保所廊坊農(nóng)藥中試廠）；甲醇、二甲基亞砜、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷和丙酮等試劑（均為分析純，天津富宇精細(xì)化工廠）； GF254薄層層析硅膠（青島海洋化工廠）；羧甲基纖維素鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT）生物顯色劑（Amresco公司）。

1.2 方法

1.2.1 多蕊蛇菰不同提取物的制備

將多蕊蛇菰根狀莖及其地上部分洗凈后切碎，裝入1 L的三角瓶中，加入3倍體積的甲醇室溫下冷浸提取3次，過濾濃縮甲醇提取液，然后水混懸，分別用等體積石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，各萃取3次，濃縮萃取液即得到石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層提取物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗細(xì)菌活性的測(cè)定

多蕊蛇菰次生代謝產(chǎn)物抗細(xì)菌活性的測(cè)定采用薄層層析（TLC）-生物自顯影法[6-7]。將多蕊蛇菰石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層提取物分別用甲醇（或丙酮）溶解，用直徑為 0.5 mm 的毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為 5 μL，點(diǎn)樣點(diǎn)越小越好。采用二氯甲烷和甲醇作為展開劑進(jìn)行薄層層析，薄層層析后在薄層板的一側(cè)原點(diǎn)處點(diǎn) 5 μL 濃度為 0.2 mg/mL 的硫酸鏈霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，晾干備用。將滅菌的 LB 半固體培養(yǎng)基（瓊脂含量為 0.5%）融化，待溫度降至 40～50℃時(shí)，取1 mL濃度為108 CFU/mL的各菌液分別加入到40 mL的半固體培養(yǎng)基中，迅速搖勻。而后用噴樣器將制備好的菌懸液均勻噴灑到層析后的硅膠板上（層析液已揮干）。待培養(yǎng)基在硅膠板上冷卻后，將硅膠板置于培養(yǎng)皿中于 4 ℃的冰箱中放置 4 h，以利于抗菌成分的擴(kuò)散。而后將其置于 28 ℃下保濕培養(yǎng)，12 h 后，取出硅膠板，上面噴加外源顯色劑噻唑藍(lán)（MTT），約 10 min 后，即可觀察并量取Rf值（抑菌斑直徑）。有抗菌活性成分處，供試菌由于受到抑菌成分的抑制而出現(xiàn)抑菌斑；無抗菌活性成分處，供試菌正常生長(zhǎng)，通過 MTT 顯色后而出現(xiàn)背景色藍(lán)色，從而與抑菌斑區(qū)分開。

1.2.3 抗真菌活性的測(cè)定

多蕊蛇菰次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性的測(cè)定采用含毒平板法[8-10]，降香黃檀炭疽病菌在25℃的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)6 d，而后用直徑7 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，使菌絲面朝下接種于經(jīng)不同藥劑處理的含毒培養(yǎng)平板中，每處理重復(fù)3次，倒置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以加入無菌水的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，以加入30%二甲基亞砜（DMSO）的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，以98.4%的商用多菌靈培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照，每組對(duì)照重復(fù)3次。待生長(zhǎng)6 d后，即空白對(duì)照菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿面積2/3時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量不同處理菌落生長(zhǎng)直徑，并求出各種化學(xué)藥劑的抑菌率。

抑菌率=[（陰性對(duì)照純生長(zhǎng)量-處理純生長(zhǎng)量）/對(duì)照純生長(zhǎng)量]×100%

純生長(zhǎng)量=菌落平均直徑-菌餅直徑

毒力分析以及毒力回歸方程的建立[11]：計(jì)算出供試樣品不同濃度下的抑菌率，并將抑菌率根據(jù)生物統(tǒng)計(jì)機(jī)率值換算表?yè)Q算為機(jī)率值，以供試樣品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑菌率機(jī)率值為縱坐標(biāo)在Excel 中做XY 散點(diǎn)圖，并添加趨勢(shì)圖，得出毒力回歸方程以及r，并計(jì)算出抑菌中濃度EC50（mg/mL），以此表示供試樣品對(duì)降香黃檀炭疽病菌抑制作用的強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 多蕊蛇菰次生代謝產(chǎn)物的抗細(xì)菌活性

采用薄層層析-生物自顯影法測(cè)定多蕊蛇菰石油醚層、乙酸乙酯層以及正丁醇層提取物對(duì)不同供試細(xì)菌的抑制活性，其結(jié)果如表1和圖1所示。

從表1可以看出，多蕊蛇菰不同極性的次生代謝產(chǎn)物對(duì)供試細(xì)菌均表現(xiàn)出一定的抑制活性。乙酸乙酯和正丁醇層提取物對(duì)桉樹青枯病菌和大腸桿菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制活性，抑菌斑直徑均大于10 mm，石油醚層提取物也對(duì)桉樹青枯病菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制活性，乙酸乙酯提取物在Rf值0.00～0.10范圍內(nèi)除對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)較弱活性之外，對(duì)其他病原菌都表現(xiàn)出很好的抑制活性，抑菌斑直徑均大于10 mm；在Rf值為0.25～0.33范圍內(nèi)對(duì)桉樹青枯病菌、黃瓜角斑病菌也表現(xiàn)出一定的抑制活性，但抑菌斑直徑小于5 mm。綜上所述，不同提取物對(duì)不同供試細(xì)菌的抑制活性存在一定的差異，其中乙酸乙酯層提取物活性最強(qiáng)，其次是正丁醇層，石油醚層提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑制活性最弱，抑菌斑直徑均小于10 mm。

2.2 多蕊蛇菰次生代謝產(chǎn)物的抗真菌活性

多蕊蛇菰不同提取物對(duì)降香黃檀炭疽病菌的抑制活性如表2和圖2所示。其中乙酸乙酯層提取物對(duì)降香黃檀炭疽病菌的抑制最強(qiáng)，EC50值為0.89 mg/mL；正丁醇層提取物則次之，EC50值為6.52 mg/mL。石油醚層提取物在供試濃度下未表現(xiàn)出任何抑菌活性。

3 結(jié)論與討論

植物次生代謝產(chǎn)物是一類重要的天然活性資源，從中篩選具有抗菌活性的化學(xué)成分一直是人們研究的熱點(diǎn)[12]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人類環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，植物源的活性物質(zhì)越來越受到人們的重視，目前已從植物中提取出40多萬種次生代謝產(chǎn)物，其中一些化合物具有很好的抗真菌和抗細(xì)菌活性[13-14]。TLC-生物自顯影法能夠快速篩選和檢測(cè)生物活性物質(zhì)，目前已廣泛用于抗菌以及抗氧化等活性的分析，同時(shí)通過Rf值可以判斷活性化合物的極性大小，為后續(xù)活性化合物的分離以及篩選提供理論依據(jù)[15]。本研究采用TLC-生物自顯影法測(cè)定了多蕊蛇菰次生代謝產(chǎn)物對(duì)不同供試細(xì)菌的抑制活性，結(jié)果表明多蕊蛇菰乙酸乙酯層提取物表現(xiàn)出較好的抗細(xì)菌活性，同時(shí)對(duì)降香黃檀炭疽病菌也表現(xiàn)出較好的抑制活性，EC50值為0.89 mg/mL，說明在乙酸乙酯層提取物中含有抗菌活性物質(zhì)，具體為何種物質(zhì)還需進(jìn)一步的分離、純化，利用光譜和波譜學(xué)的方法鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

參考文獻(xiàn)

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[2] 王彥改，田 晉，馬 潔，等. 多蕊蛇菰化學(xué)成分研究[J]. 中藥材，2010，33（3）：368-370.

[3] 田金英，吉騰飛，蘇亞倫，等. 蛇菰乙醇提取物降血糖作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2007，32（12）：1 194-1 198.

[4] 田金英，葉 菲，吉騰飛，等. 蛇菰提取物對(duì)人PTP1B

（下轉(zhuǎn)第75頁(yè)）endprint