HPLC法測(cè)定鹽酸林可霉素注射液中林可霉素的含量

包愛情，陸春波，林仙軍，陳曉林，蔡文金

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101)

HPLC法測(cè)定鹽酸林可霉素注射液中林可霉素的含量

包愛情，陸春波，林仙軍，陳曉林，蔡文金

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101)

建立并驗(yàn)證了高效液相色譜法測(cè)定鹽酸林可霉素注射液中林可霉素含量的方法。試驗(yàn)采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以0.02 mol/L磷酸氫二銨-乙腈(75∶25,V/V)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，波長為214 nm。試驗(yàn)結(jié)果表明林可霉素在0.1～4.0 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，R2=1.0000，平均回收率為98.7%(n=9)，RSD為0.8%。與《中國獸藥典》2015年版一部收載的方法相比，本研究開發(fā)的方法優(yōu)化了流動(dòng)相，流動(dòng)相含鹽量大大降低，林可霉素峰形更尖銳，理論板數(shù)更高。本方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于鹽酸林可霉素注射液的質(zhì)量控制。

鹽酸林可霉素注射液；含量測(cè)定；高效液相色譜法

林可霉素屬于林可胺類抗生素，主要作用于細(xì)菌核糖體的50s亞基，抑制肽鏈延長，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，屬生長期抑菌劑。鹽酸林可霉素注射液屬于人畜共用藥，對(duì)人與動(dòng)物的革蘭氏陽性菌和支原體感染都有較好的作用[1]。獸用鹽酸林可霉素注射液，收錄于《中國獸藥典》2015版一部[2]，其中采用高效液相色譜法對(duì)含量和有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。但該方法使用的流動(dòng)相為0.05 mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0)-甲醇-乙腈(67∶33∶2,V/V)，該流動(dòng)相中使用了高濃度的硼砂溶液，在流動(dòng)相配制時(shí)硼砂溶解需要較長的時(shí)間，且高濃度的鹽溶液對(duì)色譜柱和液相系統(tǒng)都有較大的損害，長期處于高濃度的鹽溶液中，將大大縮短色譜柱和儀器壽命[3]。同時(shí)該流動(dòng)相下林可霉素峰形有前沿現(xiàn)象，峰寬過大容易干擾有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)中已經(jīng)有較多涉及到對(duì)林可霉素的定量，化學(xué)發(fā)光法[4-5]、酶聯(lián)免疫法[6-8]、毛細(xì)管色譜法[9]、氣相法[10]、氣質(zhì)法[11]、液質(zhì)法[12-13]和液相法[14-15]等方法，但其中液相法多采用不同濃度的硼酸溶液作為流動(dòng)相。開發(fā)一種新的液相方法來改善以上問題，既可以提高檢測(cè)效率，又可以延長儀器和耗材壽命。本文改進(jìn)了流動(dòng)相，開發(fā)了高效液相色潽法測(cè)定鹽酸林可霉素注射液含量的方法，并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材 料

1.1 儀器 Aglient 1260 高效液相色譜儀，配安捷倫二極管陣列檢測(cè)器，美國Aglient公司； XS-205電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇、乙腈為色譜純，Merck KGaA 公司，其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水。林可霉素對(duì)照品(來源：中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130432-201510，含量：85.5%)；鹽酸林可霉素注射液供試品(批號(hào)分別為20161201、20161202、20161203，規(guī)格10 mL∶1 g)，由浙江某廠生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18 XDB(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸氫二銨-乙腈(75∶25,V/V)；流速1.0 mL/min；溫度30 ℃；檢測(cè)波長214 nm；進(jìn)樣量10 μL。在此色譜條件下，對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1。在《中國獸藥典》2015年版一部中的條件下對(duì)照品色譜圖見圖2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取林可霉素對(duì)照品100 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加流動(dòng)相約20 mL，超聲5 min，冷卻至室溫，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(約4 mg/mL)。精密量取適量，用流動(dòng)相稀釋成2 mg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取鹽酸林可霉素注射液適量，用流動(dòng)相定量稀釋制成每l mL中含林可霉素2 mg的溶液，搖勻。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍 精密量取對(duì)照品貯備液(約4 mg/mL)適量，用流動(dòng)相稀釋成0.1，0.2，0.5，1，2 mg/mL的系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，精密量取10 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值(Y)對(duì)濃度(X，mg/mL)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，方程為：Y=2209.4X-18.7(R2=1.0000)，線性范圍0.1～4.0 mg/mL。結(jié)果表明在線性范圍內(nèi)，林可霉素濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算結(jié)果，林可霉素峰面積的RSD為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)20161202)，分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積，林可霉素峰面積的RSD為0.7%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào)20161202)，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定供試品溶液中林可霉素的含量。結(jié)果測(cè)得林可霉素的峰面積分別為4592.1、4598.1、4569.3、4589.1、4536.1和4578.1，RSD為0.5%，表明方法重復(fù)性良好。

圖1 優(yōu)化條件下(A)對(duì)照品色譜圖和(B)供試品色譜圖(批號(hào)為20161202)Fig 1 Chromatograms of (A) the reference substance and (B) the sample(lot munber:20161202) under optimized conditions

圖2 《中國獸藥典》2015版條件下對(duì)照品色譜圖Fig 2 Chromatogram of the reference substance under conditions of Chinese veterinary pharmacopoeia 2015

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確量取已知含量的鹽酸林可霉素注射液(批號(hào)20161202，規(guī)格為10 mL∶1 g，含量為103.6 mg/mL)250 μL，共9份，置25 mL量瓶中，按高(120%)、中(100%)、低(80%)三個(gè)濃度水平分別添加林可霉素對(duì)照品，制得向已知含量制劑中添加已知測(cè)定物的添加樣品，每個(gè)濃度水平的添加樣品分別制備3份供試樣。用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果表(n=9)Tab 1 Results of recovery test (n=9)

2.3.6 耐用性 在優(yōu)化的色譜條件下，比較了Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm)和Aglient Eclipse XDB C18 (4.6 mm×250 mm)色譜柱，結(jié)果表明,兩者均能使林可霉素峰形尖銳；對(duì)溫度進(jìn)行了考察，在本文優(yōu)化的流動(dòng)相下選擇溫度為25 ℃和35 ℃時(shí)，除出峰時(shí)間發(fā)生變化外，其余變化很小；將流動(dòng)相水相和有機(jī)相比例調(diào)整為78∶22和72∶28進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明，流動(dòng)相比例的微調(diào)也僅能影響出峰時(shí)間，對(duì)峰形和理論塔板數(shù)影響甚小。不同品牌的色譜柱、不同流動(dòng)相有機(jī)相與水相比例以及不同溫度，均能滿足試驗(yàn)需要，方法耐用性較強(qiáng)。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的鹽酸林可霉素注射液，按2.2.2項(xiàng)下方法處理，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品制備2份，計(jì)算樣品中林可霉素的含量，取平均值。同時(shí)與《中國獸藥典》2015年版一部比較結(jié)果(表2)。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(標(biāo)示量/%，n=2)Tab 2 Results of content determination of samples (labelled amount/%, n=2)

3 討論與小結(jié)

在波長選擇上，由于林可霉素在200 nm左右有最大吸收波長，但該處容易受溶劑干擾，因此本文沿用《中國獸藥典》中的214 nm作為檢測(cè)波長。

在流動(dòng)相優(yōu)化上，本文嘗試了《中國獸藥典》2015年版一部中的流動(dòng)相，水-乙腈(75∶25,V/V)，水-甲醇(65∶35,V/V)，0.02 mol/L磷酸氫二鉀(用85%磷酸調(diào)節(jié)pH至6.1)-乙腈(75∶25,V/V)，以及0.01 mol/L磷酸氫二銨-乙腈(75∶25,V/V)，上述流動(dòng)相體系除最后一種外，其余均導(dǎo)致林可霉素峰形差；而最后一種則在峰形略差于本文選擇的流動(dòng)相，經(jīng)過優(yōu)化，選擇了本文開發(fā)的流動(dòng)相。由于《中國獸藥典》中的流動(dòng)相使得林可霉素峰有前沿現(xiàn)象，經(jīng)優(yōu)化后有很大改善，理論板數(shù)也由6245增加到10239，分離性能更好。

使用本文開發(fā)的方法與《中國獸藥典》2015年版一部方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩者在測(cè)定鹽酸林可霉素注射液含量時(shí)，結(jié)果基本一致。方法使用了常用的溶解性好的磷酸氫二銨作為水相的溶質(zhì)，且配制流動(dòng)相時(shí)不需要調(diào)pH，在配制流動(dòng)相時(shí)縮短了時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，且低濃度鹽溶液有利于儀器的長期使用。

本文開發(fā)的方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，能夠有效的控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，為產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)提供了研究基礎(chǔ)。

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ContentDeterminationofLincomycininLincomycinHydrochlordeInjectionbyHPLC

BAQ Ai-qing, LU Chun-bo, LIN Xian-jun, CHEN Xiao-lin, CAI Wen-Jin

(ZhejiangProvinceInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou311101,China)

The method for content determination of lincomycin in lincomycin hydrochlorde injection by HPLC was developed and validated. Analysis was performed on a C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with a mobile phase of 0.02 mol/L diammonium phosphate aqueous solution-acetonitrile (75∶25,V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30 ℃. The determination wave length was 214 nm. The results showed that a good linear relationship was accepted in the range of 0.1～4.0 mg/mL (R2=1.0000), and the average recovery was 98.7% (n=9)withRSDof 0.8%. In contrast with method in Chinese veterinary pharmacopoeia 2015, the mobile phase was optimized by reducing salinity while the peak shape and number of theoretical plates of lincomycin were improved. This method was convenient, accurate, reliable and was suitable to control the quality of lincomycin hydrochlorde injection.

lincomycin hydrochlorde injection; content determination; high performance liquid chromatography (HPLC)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.09

2017-03-21

A

1002-1280 (2017) 12-0047-05

S859.83

包愛情，從事獸藥檢測(cè)工作。E-mail：baoaiqing@126.com

(編輯：侯向輝)