管碟法測定吉他霉素含量的不確定度評定

徐 嫄，韓寧寧，于麗娜，戴 青，趙 暉，楊秀玉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

管碟法測定吉他霉素含量的不確定度評定

徐 嫄，韓寧寧，于麗娜，戴 青，趙 暉，楊秀玉*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

建立了管碟法測定吉他霉素含量不確定度的評定方法。通過建立數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用測量不確定度評定與表達(dá)理論，分析不確定度來源，對各個不確定度分量進行評估，計算擴展不確定度，得到測定結(jié)果的不確定度報告。本實驗的測定結(jié)果可表示為(1636.2±11.1)U/mg(k=2)，測量不確度的主要來源為溶液的制備過程。

吉他霉素；管碟法；不確定度

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[1]。測量不確定度對于實驗室間比對、測量結(jié)果臨界值的判斷、方法的確認(rèn)及檢測工作國際化等方面都具有重要意義。ISO/IEC17025標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定檢測實驗室應(yīng)具有并應(yīng)用評定測量不確定度的程序，在國家實驗室認(rèn)可的評審過程中，測量不確定度報告同樣被關(guān)注。本文根據(jù)相關(guān)技術(shù)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)和參考文獻[2-8]，對管碟法測定吉他霉素效價結(jié)果的不確定度進行評定，以期為試驗方法的優(yōu)化和準(zhǔn)確認(rèn)識測量結(jié)果提供參考。

1 儀器與試藥

抗生素效價測量儀(北京潮聲技術(shù)開發(fā)公司，CHB-1)；分析天平(METTLER-TOLEDO，AX-205)，37 ℃恒溫培養(yǎng)室；鋼管自動放置器(北京先驅(qū)威峰技術(shù)開發(fā)公司，ZY-300G)；吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，1462 U/mg，批號0357-9901)；吉他霉素供試品(企業(yè)提供)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501](中國藥品生物制品檢定所)；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號，滅菌0.9%氯化鈉溶液，滅菌磷酸鹽緩沖液(pH7.8)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京中海動物保健科技公司)；乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液的制備 依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》[9]2015年版一部抗生素微生物檢定法配制。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品置50 mL容量瓶中，按吉他霉素每2 mg加乙醇1 mL使溶解，用滅菌水稀釋至刻度，搖勻制得每1 mL中含1000 U的溶液；精密量取該溶液10 mL，置50 mL容量瓶中，加滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻；再分別精密量取該溶液10 mL，分別置50 mL和100 mL容量瓶中，加滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含40 U和20 U的溶液，分別作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高、低劑量。供試品溶液的制備：精密稱定吉他霉素供試品，按上述方法制備，得每1 mL含40 U和20 U的溶液，分別作為供試品溶液的高、低劑量。

2.2 雙碟的制備與培養(yǎng) 取平底雙碟8(n)套，分別加入加熱融化的培養(yǎng)基20 mL，放置在水平臺面上使凝固，作為底層；另取加熱溶化后溫度降至約50 ℃的培養(yǎng)基適量，加入65 ℃保溫30 min的枯草芽孢桿菌的菌懸液適量，搖勻；在凝固好的底層培養(yǎng)基上加入5 mL該含菌培養(yǎng)基，使攤步均勻，作為菌層；凝固后，在雙碟中等距離安置不銹鋼小管4(k)個，靜置穩(wěn)定后，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液分別滴加于不銹鋼小管內(nèi)，將雙碟置37 ℃恒溫培養(yǎng)室，培養(yǎng)16～18 h。

2.3 抑菌圈直徑的測定與效價計算 用效價測量儀測量各抑菌圈的直徑，照生物檢定統(tǒng)計法[9]進行可靠性檢驗與效價計算。當(dāng)可靠性檢驗結(jié)果回歸非常顯著(P<0.01)與偏離平行不顯著(P>0.05)時，試驗結(jié)果成立。測定結(jié)果見表1。

表1 吉他霉素效價測定抑菌圈直徑測量結(jié)果Tab 1 diameter of antibacterial circles in potency assay of Kitasamycin

3 測量不確定度的評定

3.1 數(shù)學(xué)模型

3.2 測量不確定度來源分析 測量不確定度來源的分析常從數(shù)學(xué)模型入手，該數(shù)學(xué)模型中的各個參數(shù)可能都有一個與其數(shù)值相關(guān)的不確定，成為不確定度的潛在來源。從樣品的稱量到抑菌圈的測定，不確定度的來源除抑菌圈直徑測量值引起的輸入量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度外，還包括標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的稱量、標(biāo)準(zhǔn)品的效價、溶液的配制、玻璃儀器和定量移液器的校準(zhǔn)、溫度、效價測量儀等。

3.3 測量不確定度的評定

3.3.1 抑菌圈直徑測量的不確定度分量

3.3.1.1 抑菌圈直徑重復(fù)測量引入的不確定度分量 對抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，根據(jù)上述公式計算效價(Pt)為1636.2 U/mg(可信限率3.3%)，實驗測定n個培養(yǎng)皿，牛津杯個數(shù)k，統(tǒng)計分析得自由度f=(k-1)(n-1)，其合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差即標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urelx1=0.856/1636.2=0.00052。

3.3.2 溶液配制的不確定度分量

吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品效價為1462 U/mg，根據(jù)矩形分布，置信概率為95%，按B類不確定度計算。

100 mL容量瓶經(jīng)檢定為A級，容量允差為±0.10 mL，根據(jù)矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)品溶液的不確定度為，

3.3.2.2 供試品溶液的不確定度分量 同3.3.2.1項的方法計算。供試品的稱量，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.4 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

uc(y)=0.0034×1636.2 U/mg=5.56 U/mg。

3.5 擴展不確定度 取包含因子k，P=95%，則擴展不確定度為U=2×5.56 U/mg=11.1 U/mg。報告吉他霉素含量測定結(jié)果可表示為：(1636.2±11.1)U/mg(k=2)。

4 小 結(jié)

通過對管碟法測定吉他霉素含量結(jié)果的不確定度評定，可知該方法測定結(jié)果的不確定度的主要來源是溶液的制備過程。提示實驗人員應(yīng)規(guī)范實驗操作過程，保證天平、玻璃量具等的穩(wěn)定和可靠，控制實驗條件，如環(huán)境溫度；并且注意，在溶液配制過程中，盡量減少稀釋次數(shù)和避免采用小體積量器進行量取和定容。該實驗過程中需要尤為注意的是，在吉他霉素母液配制時，經(jīng)乙醇溶解后加入滅菌水定容的過程中，應(yīng)避免液體溫度升高導(dǎo)致溶劑體積變大而影響定容的準(zhǔn)確性，應(yīng)在適量加入滅菌水后，待溶液溫度降至室溫后再定容至刻度線。通過吉他霉素含量不確定度評定，能夠更加清楚影響測定結(jié)果準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素，幫助判斷結(jié)果的準(zhǔn)確度，改進實驗方法，提高檢驗工作的質(zhì)量。

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Commission of Chinese Veterinary Pharmacopoeia. People's Republic of China Veterinary Pharmacopoeia (2015) [M]. Beijing：China Agricul Ture Press,2016.

UncertaintyEvaluationintheAssayofKitasamycinbyDiffusionMethod

XU Yuan，HAN Ning-ning，YU Li-na，DAI Qing，ZHAO Hui，YANG Xiu-yu*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl，Beijing100081，China)

YANGXiu-yu,E-mail：yangxiuyu@ivdc.org.cn

A procedure for the evaluation in the assay of kitasamycin by diffusion method was developed. A mathematical model of uncertainty evaluation was established which was used to analyze the sources of uncertainty and to evaluate every component in the determination procedure by the application of theory of evaluation and expression of the uncertainty of measurement. The expanded uncertainty was calculated and the uncertainty report was submitted. The result of content determination can be expressed as(1636.2±11.1)U/mg(k=2). The main sources of uncertainty came from preparation of solutions.

kitasamycin；diffusion method；uncertainty

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.10

2017-04-06

A

1002-1280 (2017) 12-0052-05

S859.2

徐 嫄，碩士，從事獸藥檢驗工作。

楊秀玉。E-mail：yangxiuyu@ivdc.org.cn

(編輯：侯向輝)