不同動物源生產(chǎn)用多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H基因序列分析

李偉杰，魏財文，豈曉鑫，田 野，蔣 穎，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

不同動物源生產(chǎn)用多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H基因序列分析

李偉杰，魏財文，豈曉鑫，田 野，蔣 穎，蔣桃珍*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為了解國內(nèi)不同動物源生產(chǎn)用多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H基因的變異情況，采用PCR方法對16株不同動物源生產(chǎn)用多殺性巴氏桿菌的ompH基因進(jìn)行擴增測序和分析。結(jié)果顯示：16株菌株的ompH基因開放閱讀框在1002～1056 bp之間；信號肽為N端20個氨基酸殘基，成熟蛋白氨基酸殘基數(shù)量在313～331 aa之間，氨基酸同源性為82.1%～100%；基于OmpH氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹中雞源菌株(莢膜A型)、豬源和牛源菌株(莢膜B型)分別在不同的分支。序列分析結(jié)果表明，ompH基因序列差異與莢膜型之間存在相關(guān)性，而與毒力大小無相關(guān)性。

多殺性巴氏桿菌；ompH基因；序列分析

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)是引起畜禽巴氏桿菌病的病原體，主要使動物發(fā)生出血性敗血病或傳染性肺炎，如牛出血性敗血癥、豬肺疫、禽霍亂、兔巴氏桿菌病、豬萎縮性鼻炎等[1]。多殺性巴氏桿菌的外膜蛋白在病原與宿主的互作以及宿主對感染的免疫應(yīng)答中扮演著重要的角色[2]。其中OmpH是外膜蛋白的主要結(jié)構(gòu)成分，同時也是主要的保護(hù)性抗原，屬于跨膜非特異性孔蛋白，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[3]。Lee將ompH基因在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用BALB/c小鼠進(jìn)行免疫保護(hù)試驗，結(jié)果表明全長OmpH蛋白具有與全菌相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)率[4]。本試驗選擇我國不同動物源的16株生產(chǎn)用多殺性巴氏桿菌的ompH基因作為研究對象，以期了解其在遺傳進(jìn)化上的關(guān)系，為開展基于OmpH蛋白的檢測與研究新型高效疫苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株 多殺性巴氏桿菌CVCC 428、1765、44401(豬源，莢膜B型)，CVCC 44801、44802、44808、2082(雞源，莢膜A型)，CVCC 44502(黃牛源，莢膜B型)，44701、44702、44703(牦牛源，莢膜B型)，CVCC 44601、44602、44603(水牛源，莢膜B型)，CVCC 44501、44507(牛源，莢膜B型)，以上16株生產(chǎn)用菌株均由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 采用熱裂解法[5]提取細(xì)菌基因組DNA，將凍干菌種用TSB肉湯溶解后，劃線接種含5%馬血清的TSA瓊脂平皿，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取菌落加入100 μL無菌蒸餾水中，沸水浴10 min，立即冰浴5 min，12000 r/min離心1 min，取上清作為DNA擴增模板。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照文獻(xiàn)[6]的報道，由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成多殺性巴氏桿菌ompH基因擴增的引物，預(yù)期的PCR產(chǎn)物包含了ompH基因完整的開放閱讀框，引物信息見表1。

表1 引物信息Tab 1 The information of primers

1.4 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)體系：10×Ex Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，ompH-F(10 μmol/ L)1 μL，ompH-R(10 μmol/ L)1 μL，模板2 μL，Ex Taq 酶(5 U/μL)0.25 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物測序由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成。

1.5 序列分析 應(yīng)用Mega7軟件和Lasergene 7軟件中的MegAlign對菌株的ompH基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對，分析各菌株之間的同源性及變異程度，并采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。SignaIP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/)分析信號肽。ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測氨基酸的相對分子質(zhì)量、等電點、穩(wěn)定性指數(shù)等理化性質(zhì)。用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測蛋白潛在的跨膜域。

2 結(jié)果與分析

2.1 多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H基因的擴增及序列分析 應(yīng)用特異性引物擴增多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H基因，經(jīng)電泳檢測，16株菌株均在1.5 kb處有1條電泳條帶，結(jié)果與預(yù)期相符(圖1)。利用Contig CExpress軟件進(jìn)行序列拼接，然后提交到GenBank進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16個菌株的ompH基因開放閱讀框在1002 bp～1056 bp之間，其中CVCC 44801、44802、44808、2082為1056 bp，CVCC 428、1765、44401、CVCC 44601、44602、44603、44501、44507為1008 bp，CVCC 44701、44702、44703、CVCC 44502為1002 bp。16株菌株ompH基因核苷酸同源在83.0%～100%之間(圖2)。

M:DL2000 DNA Maker；1-16：CVCC 428、1765、44401、44801、44802、44808、2082、44502、44701、44702、44703、44601、44602、44603、44501、44507；CK:陰性對照M:DL2000 DNA Maker；1-16：CVCC 428、1765、44401、44801、44802、44808、2082、44502、44701、44702、44703、44601、44602、44603、44501、44507；CK: Negative control圖1 多殺性巴氏桿菌ompH基因PCR產(chǎn)物Fig 1 PCR products of ompH gene of P.multocida

圖2 多殺性巴氏桿菌ompH基因同源性Fig 2 Percent identity based on ompH gene of P.multocida

2.2 多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H氨基酸的序列分析 16株菌株根據(jù)ompH基因推導(dǎo)的氨基酸同源性在82.1%～100%之間(圖3)，比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)CVCC 44801、44802、44808、2082(雞源，莢膜A型)氨基酸序列完全相同，CVCC 428、1765、44401(豬源，莢膜B型)氨基酸序列完全相同，CVCC 44601、44602、44603(水牛源，莢膜B型)和CVCC 44501、44507(牛源，莢膜B型)氨基酸序列完全相同，CVCC 44701、44702、44703(牦牛源，莢膜B型)和CVCC 44502(黃牛源，莢膜B型)的氨基酸序列完全相同；雞源菌株的氨基酸序列與豬源、牛源菌株的氨基酸序列同源性相對較低，在82.1%～83.2%之間，在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成一個單獨的分支(圖4)；豬源菌株間、牛源菌株間以及二者之間的氨基酸序列同源性較高，均在98%以上，在系統(tǒng)發(fā)育樹上在同一分支(圖4)。

圖3 多殺性巴氏桿菌OmpH蛋白同源性Fig 3 Percent identity based on OmpH protein of P.multocida

圖4 多殺性巴氏桿菌OmpH蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 4 Phylogenetic tree based on amino acid of the OmpH protein of P.multocida

SignaIP 4.1預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16株菌株的信號肽均為N端20個氨基酸殘基，且序列完全相同，因此推斷菌株的成熟蛋白氨基酸殘基數(shù)量分別為313、315和331。利用ProtParam軟件對OmpH蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示成熟蛋白理論分子質(zhì)量在33.79～36.46 ku之間，且雞源(莢膜A型)菌株蛋白的分子質(zhì)量較大；等電點為6.55～9.12，不穩(wěn)定系數(shù)為12.94～14.94，說明蛋白較穩(wěn)定。TMHMM Server v. 2.0沒有發(fā)現(xiàn)潛在的跨膜區(qū)域。對雞源(莢膜A型)、豬源(莢膜B型)和牛源(莢膜B型)菌株的OmpH成熟蛋白的氨基酸進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)存在缺失和變異，蛋白長度有所差異，在70～80和200～210處氨基酸屬于高變區(qū)(圖5)。

圖5 多殺性巴氏桿菌OmpH成熟蛋白氨基酸序列Fig 5 Sequence alignment of OmpH mature protein of P.multocida

3 討 論

已有的研究表明，OmpH蛋白是致病因子，在對宿主的感染與致病過程中發(fā)揮重要的作用[7-8]。同時OmpH蛋白研究表明也是一種主要的保護(hù)性抗原，Tan在大腸桿菌M15中對多殺性巴氏桿菌1710的ompH基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，BALB/c小鼠保護(hù)試驗表明腹腔免疫、攻毒，保護(hù)率為100%，皮下免疫、腹腔攻毒，保護(hù)率為80%[9]；恩特馬克·布拉提白對CVCC458的ompH基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，結(jié)果顯示免疫組小鼠對同源菌株和異源菌株的保護(hù)率分別為100%和80%[10]?；趏mpH基因非常穩(wěn)定地存在于不同莢膜型的多殺性巴氏桿菌的基因組中，因此有望成為一種對所有莢膜型產(chǎn)生保護(hù)的候選抗原。

本試驗對16株生產(chǎn)用多殺性巴氏桿菌的ompH基因進(jìn)行擴增和序列分析發(fā)現(xiàn)，不同動物源、不同莢膜型的多殺性巴氏桿菌的ompH基因大小存在差異，雞源菌株(莢膜A型)較豬源、牛源菌株(莢膜B型)的ompH基因多48～54個堿基；但不同動物源、不同莢膜型的多殺性巴氏桿菌ompH基因推導(dǎo)的氨基酸同源性較高，在82.1%～100%之間。以上結(jié)果提示OmpH作為亞單位疫苗使用可能提供同源和異源保護(hù)，但還有待于進(jìn)一步研究。試驗中還發(fā)現(xiàn)莢膜A型與莢膜B型菌株在基于OmpH蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中位于不同的分支，說明兩者之間存在相關(guān)性；分離自豬源的3株不同毒力的多殺性巴氏桿菌中，弱毒株CVCC 1765、CVCC 428和強毒株CVCC 44401，盡管毒力相差很大，但它們之間ompH基因同源性為100%，說明ompH基因與毒力大小無相關(guān)性。

[1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 第5版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.

Lu C P. Veterinary microbiology[J]. The fifth edition. Beijing: China Agriculture Press, 2012.

[2] Hatfaludi T, Al-Hasani K, Boyce J D，etal. Outer membrane proteins ofPasteurellamultocida[J]. Veterinary Microbiology, 2010, 144(1/2)：1-17.

[3] Luo Y, Glisson J R, Jackwood M W,etal. Cloning and characterization of the major outer membrane protein gene (ompH) ofPasteurellamultocidaX-73[J]. Journal of Bacteriology, 1997, 179(24): 7856-7864.

[4] Lee J, Kim Y B, Kwon M. Outer membrane protein H for protective immunity againstPasteurellamultocida[J]. Journal of Microbiology, 2007, 45(2): 179-184.

[5] 李偉杰，田 野，豈曉鑫，等. 禽源多殺性巴氏桿菌多位點序列分型研究[J]. 中國獸藥雜志，2017，51(2)：1-6.

Li W J, Tian Y, Qi X X,etal. Multi-locus sequence typing ofPasteurellamultocidaisolated from avian[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2017, 51(2):1-6.

[6] 李偉杰，魏財文，田 野，等. 豬源多殺性巴氏桿菌莢膜分型及外膜蛋白H基因序列分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2015，42(1)：0032-0037.

Li W J, Wei C W, Tian Y,etal. Capsular typing and sequencs analysis of theompHgene ofPasteurellamultocidafrom swine[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2015, 42(1): 0032-0037.

[7] Khamesipour F, Momtaz H, Azhdary Mamoreh M. Occurrence of virulence factors and antimicrobial resistance inPasteurellamultocidastrains isolated from slaughter cattle in Iran[J]. Front Microbio, 2014, 5:536.

[8] 韋 東，吾魯木汗·那孜爾別克，段世雄，等.禽多殺性巴氏桿菌C48-3株外膜蛋白H的致病作用[J]. 中國生物工程雜志，2014，34(6)：31-39.

Wei D, Wulumuhan N, Duan S X,etal. Role of outer membrane protein in the pathogenesis of avianPasteurellamulticidastrain C48-3[J]. China Biotechnology, 2014, 34(6):31-39.

[9] Tan H Y, Nagoor N H, Sekaran S D. Cloning, expression and protective capacity of 37 kDa outer membrane protein gene (ompH) ofPasteurellamultocidaserotype B∶2[J]. Tropical Biomedicine, 2010, 27(3): 430-441.

[10] 恩特馬克·布拉提白，彭清忠，嚴(yán) 芳，等.禽多殺性巴氏桿菌粘附蛋白Cp39的交叉免疫保護(hù)作用[J]. 微生物學(xué)報，2010，50(3)：360-366.

Entomack B, Peng Q Z, Yan F,etal. Cross-protective effect of the Cp39 adhesive proteins against avianPasteurellamulticidain mice[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2010, 50(3):360-366.

SequencesAnalysisonompHGeneofPasteurellamultocidaIsoltatedfromDifferentAnimalsforProducingVaccine

LI Wei-jie, WEI Cai-wen, QI Xiao-xin, TIAN Ye, JIANG Ying, JIANG Tao-zhen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

JIANGTao-zhen，E-mail:jiangtaozhen@ivdc.org.cn

In order to understand the variation of outer membrane protein H gene，theompHgene of 16P.multocidastrains were examined and analysed by PCR method. The results showed that the open reading frames of ompH gene were from 1002 to 1056 bp. The predicted mature proteins were composed of 313 to 331 amino acids except the signal peptide including 20 amino acid residues in N terminal. The alignment data indicated that the homology of amino acid were from 82.1% to 100%. The phylogenetic tree constructed by the OmpH protein showed that the strains isolated from avian (capsular type A), swine and cattle (capsular type B) were in different branches. The relationship were found between the sequence divergence ofompHgene and the capsular type, but not with the virulence.

Pasteurellamultocida;ompHgene; sequence analysis

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.02

2017-03-29

A

1002-1280 (2017) 12-0007-06

S852.61

國家微生物資源平臺(NIMR-5)

李偉杰，副研究員，從事獸醫(yī)微生物與獸用生物制品研究。

蔣桃珍。E-mail：jiangtaozhen@ivdc.org.cn

(編輯：李文平)