家族性肥厚型心肌病致病突變檢測及基因型表型關聯(lián)分析

楊坤璂 董雪琪 肖嫣 張瑩 孟旭 范鵬 劉亞欣 盧超霞 張學 周憲梁

100037北京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院心內(nèi)科（楊坤璂、董雪琪、肖嫣、張瑩、孟旭、范鵬、劉亞欣、周憲梁）；100005北京，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室（盧超霞、張學）

家族性肥厚型心肌病致病突變檢測及基因型表型關聯(lián)分析

楊坤璂 董雪琪 肖嫣 張瑩 孟旭 范鵬 劉亞欣 盧超霞 張學 周憲梁

100037北京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院心內(nèi)科（楊坤璂、董雪琪、肖嫣、張瑩、孟旭、范鵬、劉亞欣、周憲梁）；100005北京，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室（盧超霞、張學）

目的 研究中國人家族性肥厚型心肌病的致病基因突變位點，分析其基因型與表型的關系。 方法 利用目標區(qū)域重測序技術，對一個中國肥厚型心肌病家系先證者的64個與遺傳性心肌病相關的基因進行篩查。Sanger測序驗證可疑突變位點并篩查家系成員8例和正常個體100例，同時分析家系突變攜帶者4例的臨床表型特點。 結(jié)果 本家系中包括先證者在內(nèi)的4例存活家系成員攜帶MYBPC3基因c.1377delC突變，在100例正常對照中未發(fā)現(xiàn)此突變。攜帶者中有2例確診為肥厚型心肌病，均表現(xiàn)為室間隔肥厚，另外2例為無癥狀攜帶者，心電圖和超聲心動圖均未見異常。家系中有3例猝死，4例有暈厥史，3例發(fā)病年齡小于40歲，2例在40歲后發(fā)病。 結(jié)論 基因檢測在肥厚型心肌病鑒別診斷和家系篩查中有重要的臨床意義。

心肌病，肥厚性； 目標區(qū)域重測序； MYBPC3基因； 基因型； 表型

肥厚型心肌?。╤ypertrophic cardiomyopathy，HCM）是最常見的單基因遺傳性心血管病，以左和（或）右心室不對稱肥厚為特征，室間隔最常受累，并以心肌細胞肥大和排列紊亂為主要病理特征。其在普通人群中的發(fā)病率為1／500［1?2］，是青少年和運動員發(fā)生心原性猝死的主要原因［3］。研究發(fā)現(xiàn)，約50%的HCM患者具有明顯的家族聚集傾向［4］，稱之為家族性肥厚型心肌病。HCM的臨床表現(xiàn)具有較強的異質(zhì)性，從無癥狀到暈厥、心律失常、心力衰竭、心原性猝死。其中，心力衰竭、心原性猝死和血栓栓塞性卒中是HCM患者死亡的常見原因。目前，已有超過25個與HCM相關的致病基因相繼被發(fā)現(xiàn)，大部分致病基因突變位于編碼肌小節(jié)的肌絲或Z盤蛋白。編碼心臟型肌球蛋白結(jié)合蛋白C的MYBPC3基因和編碼心臟β肌球蛋白重鏈的MYH7基因是HCM的主要致病基因，突變約占突變檢測陽性患者的70%［5］。最新歐洲心臟病學會（ESC）和美國心臟病學院基金會／美國心臟病協(xié)會（ACCF／AHA）的HCM診治指南推薦對所有HCM確診患者進行致病基因檢測［6?7］?；驒z測有助于HCM的鑒別診斷和家系篩查，但在危險預測與分層中的應用還十分有限，因為HCM基因型和表型具有明顯的異質(zhì)性，大多數(shù)已報道的致病突變局限于少數(shù)家系或散發(fā)病例中，基因型和表型的關系仍需進一步研究。本研究應用目標區(qū)域重測序技術對一個中國漢族HCM家系進行了遺傳篩查，發(fā)現(xiàn)MYBPC3基因移碼突變c.1377delC，并探討了該突變與臨床表型的關系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

入選2013年10月就診于中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院的中國漢族肥厚型心肌病1例，共4代8例參與本研究（圖1）。同時入選100例心電圖及超聲心動圖檢查未見明顯異常的無關個體作為正常對照。本研究經(jīng)中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院倫理委員會批準實施，所有研究對象均簽署知情同意書。先證者及其家系成員均進行體格檢查、心電圖、二維及多普勒超聲心動圖檢查。

圖1 HCM家系圖譜

HCM的診斷符合2014年ESC的HCM診治指南的診斷標準［7］。

1.2 基因組DNA提取

收集研究對象2 ml EDTA抗凝外周靜脈血，使用QIAamp DNA Blood Midi Kit（QIAGEN，德國）提取基因組DNA。

1.3 目標區(qū)域重測序

針對先證者，應用下一代半導體靶向測序技術，對64個已知與遺傳性心肌病相關的致病基因［8］進行目標區(qū)域重測序。首先使用在Life Technologies公司定制的Ion AmpliSeqTMInherited Cardiomyopathy Panel試劑盒及Ion AmpliSeqTMLibrary kit 2.0進行文庫構(gòu)建，對64個基因的所有外顯子序列進行擴增。然后，將上一步制備的文庫稀釋至15 pmol，每個庫等摩爾濃度混合，使用Ion OneTouchTM200 TemplateKit（LifeTechnologies，美國）在Ion OneTouch（Life Technologies，美國）上進行乳化PCR，并使用Ion OneTouch ES（Life Technologies，美國）完成掛有模板的磁珠顆粒（Ion Sphere Particles，IPS）的富集。最后，將富集后的磁珠顆粒應用Ion PGMTM200 Sequencing Kit（Life Technologies，美國）及Ion Torrent 318芯片在Ion Torrent PGM上測序。所有操作步驟按說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Ion Torrent Suite v3.2軟件進行Ion Torrent數(shù)據(jù)提取、序列比對及SNPs和Indels提取，得到的SNPs和Indels經(jīng)過SeattleSeq Variation Annomitation 138注釋，對注釋結(jié)果進行篩選（剔除非靶向區(qū)域的變異，以及頻率高于1%的常見變異），對篩選的候選變異利用基因可視化軟件Integrated Genomics Viewer（IGV，v2.1）進行測序質(zhì)量評估以剔除假陽性變異，并進行保守性分析和In silico蛋白功能受損情況預測。

1.5 Sanger測序驗證及家系和正常對照篩查

利用Sanger法測序，將篩選得到的可疑致病變異依次進行先證者驗證和家系共分離驗證，最終得到的陽性變異在正常對照人群中進行驗證。突變依據(jù)人類基因組變異學會命名原則命名（http：／／www.hgvs.org／mutnomen）。MYBPC3序 列 參 照NM＿000256.3。

2 結(jié)果

2.1 先證者臨床表現(xiàn)

先證者（Ⅲ?1）為49歲女性，因勞累后胸悶、氣短3年就診。11年前開始出現(xiàn)勞累后胸悶，心電圖顯示異常T波倒置，當?shù)蒯t(yī)院診斷為冠心病。近3年，出現(xiàn)勞累后憋悶、氣短，無胸痛及心力衰竭，曾暈厥1次。超聲心動圖顯示：非梗阻性HCM，室間隔增厚（25 mm），左心室后壁厚度9 mm，左心室射血分數(shù)72%（圖2A～C）。心電圖顯示：V1～V5導聯(lián)T波倒置，左前分支傳導阻滯（圖2D）。

2.2 基因突變分析

通過目標區(qū)域重測序，在先證者的MYBPC3基因發(fā)現(xiàn)移碼突變c.1377delC（p.L460Wfs?6）（圖3）。該突變位于MYBPC3基因第14號外顯子上，缺失堿基C，導致第459位氨基酸后出現(xiàn)移碼，同時在移碼后的6位提前引入終止密碼子，使編碼蛋白變?yōu)榻囟绦缘鞍?。該突變在外顯子組整合數(shù)據(jù)庫（Exome Aggregation Consortium，ExAC）中未見報道，在100例無關的正常漢族人中也未被檢測到。隨后對其家系進行該突變篩查，發(fā)現(xiàn)4例攜帶該突變，其中2例發(fā)病。

圖2 先證者的超聲心動圖和心電圖表現(xiàn)

圖3 MYBPC3基因c.1377delC突變Sanger測序圖

2.3 家系臨床資料分析

家系成員中突變攜帶者臨床資料詳見表1。家系中包括先證者在內(nèi)共有4例HCM確診患者（Ⅱ?1，Ⅱ?5，Ⅲ?1，Ⅲ?3），其中，2例患者發(fā)病年齡 ＜40歲（Ⅱ?1，Ⅱ?5），另外兩例患者分別于46歲（Ⅲ?1）和44歲（Ⅲ?3）發(fā)病。3例患者有暈厥史（Ⅱ?1，Ⅱ?5，Ⅲ?1），2例患者發(fā)生心原性猝死（Ⅱ?1，Ⅱ?5），其中先證者小姨（Ⅱ?5）25歲時猝死。

先證者外祖母（Ⅰ?1）年輕時（＜40歲）有暈厥史，未系統(tǒng)診治，60歲左右死亡。先證者外祖父（Ⅰ?2）體健，90歲以后去世。據(jù)此推斷，先證者外祖母為HCM患者，并攜帶致病突變。

先證者弟弟（Ⅲ?3），46歲，勞累后胸悶、憋氣2年，心前區(qū)聽診未發(fā)現(xiàn)雜音，心電圖示V1～V4導聯(lián)T波由低平變?yōu)榈怪貌⒓由睢３曅膭訄D檢查：非梗阻性HCM，室間隔增厚（19 mm），心肌回聲增強，呈斑點樣改變，運動幅度減低。

其余家系成員無類似主訴，心電圖和超聲心動圖檢查均未見明顯異常。

3 討論

MYBPC3基因編碼心臟型肌球蛋白結(jié)合蛋白C（cMBP?C）。cMBP?C是細胞內(nèi)免疫球蛋白超家族成員，由8個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和3個Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域組成，主要作用是結(jié)合肌球蛋白重鏈參與肌小節(jié)和肌絲的組裝，并通過磷酸化等調(diào)節(jié)橫橋循環(huán)參與心肌的收縮和舒張［9］。 此外，cMBP?C還可以通過影響肌絲蛋白對鈣離子的敏感性來調(diào)節(jié)心肌的收縮［9］。自1995年發(fā)現(xiàn)MYBPC3基因是HCM的致病基因以來［10?11］，目前已發(fā)現(xiàn)超過600種突變可致HCM，約占突變檢測陽性患者的35%［5］，MYBPC3基因已被證實是HCM最主要的致病基因之一。大部分MYBPC3基因已知致病突變?yōu)榻囟掏蛔儯?＞60%）［9］，包括無義突變、插入或缺失、剪接位點突變，與MYH7基因突變絕大部分為錯義突變有明顯區(qū)別。

本研究在一個中國HCM家系中發(fā)現(xiàn)MYBPC3基因移碼突變c.1377delC，位于第14號外顯子，缺失一個堿基C，導致第459位脯氨酸后出現(xiàn)移碼，并提前終止。MYBPC3基因第14號外顯子編碼免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域C2，并且14號外顯子后的核苷酸序列編碼纖連蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域，包含肌聯(lián)蛋白和肌球蛋白結(jié)合位點。我們推測，發(fā)生移碼突變的序列可能翻譯生成截短蛋白或者表達的蛋白被迅速降解，造成cMYBP?C蛋白的結(jié)構(gòu)和功能缺陷，難以發(fā)揮捆扎粗肌絲的作用，影響肌小節(jié)的功能，從而引起HCM。研究表明，單倍劑量不足是MYBPC3基因雜合截短突變致病的主要機制，突變等位基因的表達受無義介導的mRNA降解、泛素蛋白酶系統(tǒng)或溶酶體自噬通路調(diào)節(jié)［12?13］。

表1 攜帶MYBPC3基因c.1377delC突變家系成員臨床資料

MYBPC3基因突變引起的臨床表型一般有發(fā)病時間晚，多在中年后發(fā)病，心肌肥厚程度輕，病程進展緩慢等特點［14?15］。 而且MYBPC3基因截短突變和雙突變導致的臨床表型通常重于單個錯義突變［15］。在本研究的家系中，3例患者在40歲以前發(fā)病，4例患者有暈厥史，3例患者發(fā)生心原性猝死。這與以往的報道相符。王繼征等［16］在100例HCM患者中篩查到的2例攜帶MYBPC3基因移碼突變的患者于中青年發(fā)病，并且均有暈厥史。

HCM是一種臨床表型具有高度異質(zhì)性的遺傳性心肌病。本研究家系中3例發(fā)生猝死的患者發(fā)病年齡都小于40歲，而先證者和其弟弟在40歲以后才發(fā)病。雖然攜帶致病突變，但先證者妹妹和女兒的心電圖和超聲心動圖均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。Lin等［17］在一個小家系中報道了攜帶該突變的兩名患者，先證者于24歲診斷為HCM，10年超聲心動圖隨訪未發(fā)現(xiàn)心肌肥厚進展，而先證者母親59歲才發(fā)現(xiàn)心肌肥厚，并且沒有明顯臨床癥狀。盡管表型存在明顯異質(zhì)性，對HCM患者進行致病基因檢測，有助于家系成員的突變篩查和早期診斷，尤其是發(fā)現(xiàn)尚未出現(xiàn)表型的突變攜帶者。由于HCM外顯具有年齡依賴性的特點［7］，通過遺傳篩查，對家系中無表型的年輕突變攜帶者定期檢查，有助于早期干預和治療。而對于突變陰性的家系成員，則可以減少不必要的檢查，并減輕其精神負擔。本研究家系中先證者的女兒和妹妹攜帶致病突變，存在患病風險，因此和先證者一樣，需要定期進行心電圖和超聲心動圖檢查。

綜上所述，本研究利用目標區(qū)域重測序技術在一個中國HCM家系發(fā)現(xiàn)MYBPC3基因移碼突變c.1377delC，突變攜帶者的臨床表型具有異質(zhì)性。對HCM患者進行基因檢測不僅能夠明確疾病的遺傳原因，而且有助于家系篩查，對家系成員的早期診斷以及突變攜帶者的早期干預治療具有重要的臨床意義。

利益沖突：無

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Identification of pathogenic mutations in familial hypertrophic cardiomyopathy and analysis of genotype?phenotype

Yang Kunqi，Dong Xueqi，Xiao Yan，Zhang Ying，Meng Xu，F(xiàn)an Peng，Liu Yaxin，Lu Chaoxia，Zhang Xue，Zhou Xianliang

Department of Cardiology，F(xiàn)uwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100037，China（Yang KQ，Dong XQ，Xiao Y，Zhang Y，Meng X，F(xiàn)an P，Liu YX，Zhou XL）；National Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100005，China（Lu CX，Zhang X）

s：Liu Yaxin，Email：liuyaxin163＠163.com；Lu Chaoxia，Email：rosy.lu＠126.com

Objective To identify the mutations of pathogenic gene of familial hypertrophic cardiomyopathy（HCM）in China，and analyze the genotype?phenotype correlation. Methods A Chinese family with HCM was investigated.Targeted resequencing was performed in the proband based on a custom AmpliSeq panel which includes 64 candidate pathogenic genes for cardiomyopathies.Sanger sequencing was used to validate suspicious mutation sites and screened family members in 8 cases and 100 normal individuals，and analyzed the clinical phenotype of 4 cases of mutant carriers.The genotype?phenotype relationship in the family was analyzed. Results A frameshift mutation，c.1377delC，was identified in the MYBPC3 gene in four alive family members，including the proband，which was not detected in 100 normal controls.Two mutation carriers were diagnosed with HCM，with the involvement of ventricular septum.The other two asymptomatic mutation carriers were found without positive finding in electrocardiogram and echocardiogram.In this pedigree，sudden cardiac death occurred in 3 family members，while syncope was presented in 4 members.Onset age less than 40 was observed in three members，while two members were diagnosed HCM after the age of 40. Conclusions Genetic test is very important in the differential diagnosis and pedigree screening of HCM.

Cardiomyopathy，hypertrophic； Targeted resequencing； MYBPC3； Genotype；Phenotype

Fund programs：CAMS Innovation Fund for Medical Sciences（2016?I2M?1?002）；National Natural Science Foundation of China Youth Fund Project（81600305）；Beijing Municipal Science and Technology Commission（Z151100003915078）；Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China（20131106120009）

劉亞欣，電子信箱：liuyaxin163＠163.com；盧超霞，電子信箱：rosy.lu＠126.com

注：楊坤璂和董雪琪為并列第一作者

10.3969／j.issn.1007?5410.2017.06.006

中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程經(jīng)費資助項目（2016?I2M?1?002）；國家自然科學基金青年基金項目（81600305）；北京市科技計劃項目（Z151100003915078）；高等學校博士學科點專項科研基金項目（20131106120009）

2017?04?12）

周白瑜）