瘦素基因敲除小鼠模型的建立及表型分析

池 駿, 龔 慧, 何玥煒, 萬穎寒,, 費 儉 匡 穎

(1. 上海南方模式生物科技股份有限公司, 上海201203; 2. 同濟大學(xué), 上海200092;3. 上海南方模式生物研究中心，上海201203）

瘦素基因敲除小鼠模型的建立及表型分析

池 駿1,2, 龔 慧3, 何玥煒1,2, 萬穎寒2,3, 費 儉1, 匡 穎1

(1. 上海南方模式生物科技股份有限公司, 上海201203; 2. 同濟大學(xué), 上海200092;3. 上海南方模式生物研究中心，上海201203）

目的 建立瘦素(Lep)基因敲除小鼠模型并對相關(guān)表型進行分析，為肥胖和糖尿病相關(guān)研究和藥物研發(fā)提供動物模型。方法 采用小鼠胚胎干細和同源重組方法，建立Lep基因敲除小鼠模型，分別對Lep基因敲除三種基因型小鼠體質(zhì)量、血糖的變化情況，血清胰島素以及肝功能、腎功能、血脂等血液生化指標(biāo)變化情況進行比較分析；對純合子和野生型小鼠的肝臟、腎臟進行了病理學(xué)檢測。結(jié)果 對構(gòu)建的Lep基因敲除小鼠模型初步表型分析顯示，Lep基因敲除純合子小鼠表現(xiàn)出肥胖、高血糖、高胰島素、脂質(zhì)代謝紊亂、肝功能異常等表型; 病理學(xué)檢測顯示，Lep基因敲除小鼠肝腫大，并出現(xiàn)肝細胞空泡化等脂肪變性現(xiàn)象。結(jié)論 成功構(gòu)建Lep基因敲除小鼠模型，該模型或可用于肥胖和糖尿病發(fā)病機制及其藥物研發(fā)。

瘦素(Lep)基因; 基因敲除小鼠; 肥胖; II型糖尿病

瘦素(Leptin, Lep)是肥胖基因的產(chǎn)物, 自1994年利用定位克隆技術(shù)成功克隆小鼠肥胖(ob)基因以來[1]，一直為人們所廣泛關(guān)注。Lep主要由脂肪細胞分泌，另外在骨骼肌、胃黏膜、胎盤、卵巢、心臟、骨、軟骨等多個組織器官亦可少量分泌。除了作為一種激素調(diào)節(jié)體質(zhì)量的作用，瘦素及其調(diào)控分子在脂質(zhì)代謝[2]、造血[3]、胰島素的分泌與調(diào)節(jié)[4]、卵巢功能[5]、繁殖[6]、免疫功能[7]、交感神經(jīng)激活[8]、消化道功能[9]、大腦發(fā)育[10]、血管生成[11]、外周神經(jīng)病變[12]等諸多方面發(fā)揮重要作用。Lep基因自發(fā)性突變小鼠品系—ob/ob小鼠，是Ingalls 等[13]于1950年在Jackson實驗室近交系小鼠(C57BL/Ks)中發(fā)現(xiàn)的自發(fā)突變小鼠，該小鼠具有食欲旺盛、肥胖、血糖升高、胰島素抵抗等類似于人類II型糖尿病以及肥胖癥的表型。目前該小鼠已成為國際公認(rèn)的II型糖尿病以及肥胖癥小鼠模型，廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、發(fā)病機理以及相關(guān)并發(fā)癥的研究。

小鼠Lep基因位于6號染色體，編碼一種167氨基酸的蛋白(NP_032519.1)。Lep基因的轉(zhuǎn)錄本包含三個外顯子，從第二個外顯子起始編碼，終止于第三個外顯子，本研究將Lep基因的第二外顯子用新霉素抗性基因(Neo)取代，導(dǎo)致編碼Lep蛋白的起始密碼子ATG及編碼N端氨基酸序列的部分序列缺失，Lep的突變mRNA將不能被翻譯成蛋白，獲得全身性缺失Lep蛋白的小鼠模型。

目前我國所使用的Lep基因功能缺失小鼠模型—ob/ob小鼠，大多來自美國Jackson實驗室，該小鼠模型在應(yīng)用于藥物研發(fā)時會受到知識產(chǎn)權(quán)方面的限制。為了避免知識產(chǎn)權(quán)問題對我國Lep基因功能缺失小鼠模型應(yīng)用的限制，本課題組通過小鼠胚胎干細胞基因打靶的策略將Lep-001轉(zhuǎn)錄本2號外顯子敲除，成功構(gòu)建了Lep基因敲除小鼠模型，初步的表型分析表明，與已有文獻報道類似，該小鼠模型表現(xiàn)出肥胖、高血糖、胰島素抵抗、脂代謝異常等II型糖尿病表型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J等實驗動物均由上海南方模式生物科技股份有限公司提供[SCXK(滬)2014-0002]，所有實驗動物均飼養(yǎng)于SPF級動物設(shè)施[SCXK(滬)2013-0035], 飼養(yǎng)環(huán)境維持恒溫(21～22 ℃)恒濕(55%～65%),并給予12 h明暗光照循環(huán)。所有動物實驗方案都經(jīng)過上海南方模式生物科技股份有限公司實驗動物倫理委員會的審核和批準(zhǔn)。

1.2 細菌人工染色體、質(zhì)粒和細胞

含Lep的細菌人工染色體(BAC)購自 Source Bioscience Ltd.公司(英國)，BAC 編號: bMQ275a16。pBR322-2S質(zhì)粒為上海南方模式生物科技股份有限公司改建。SCR012 胚胎干細胞(ES細胞)來源于129S6/SVEV品系小鼠，購自Chemicon公司(美國),由上海南方模式生物科技股份有限公司保存。

1.3 試劑

常規(guī)化學(xué)試劑購自Sigma公司(美國)和上海化學(xué)試劑公司; 載體構(gòu)建所需限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA polymerase及PCR相關(guān)試劑均購自TaKaRa公司(日本); 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司(德國)。ES細胞培養(yǎng)所需的DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及相關(guān)試劑購自Gibco BRL公司(美國)、Sigma公司(美國)和 Chemicon 公司(美國)。胰島素測定試劑盒購自Millipore公司(美國)。

1.4 引物

所有引物采用primer 5.0軟件包根據(jù)序列資料自行設(shè)計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物終濃度配置為10 μmol/mL。ES細胞基因型鑒定用引物I，II，III，IV位置如圖1A所示，序列分別為:

P1: 5'-TCGGACAGAAAGAAAAATAAGACAC -3';

P2: 5'-AGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTA -3';

P3: 5'-CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGAGCAAAG -3';

P4: 5'-AATGACAGTCTTTGATAGTCCCACA -3'。

后續(xù)小鼠基因型鑒定用引物P5，P6，P7，序列分別為:

P5: 5'-CCTTGAAGTACGCAACAAAGCCCC-3';

P6: 5'-GGAACCGACACAGGGGTCTCCA-3';

P7: 5'-CTGGGGCTCGACTAGAGCTTGC-3'

1.5 Lep基因敲除小鼠模型的建立

Lep基因序列信息源自Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://www.ensembl.org/index.html)，根據(jù)基因組序列設(shè)計構(gòu)建打靶載體，基因敲除小鼠模型的打靶策略如圖1A所示，兩個重組同源臂分別為：2.2 kb(5'同源臂)和4.3 kb(3'同源臂)，藥物抗性基因分別是正篩選基因Neo和負(fù)篩選基因單純皰疹病毒胸苷激酶基因(TK), 用Neo取代Lep基因的外顯子2 (exon2)。通過ET克隆技術(shù)構(gòu)建同源重組打靶載體，獲得Lep-KO-pBR322-2s質(zhì)粒，并經(jīng)酶切和測序驗證正確。通過ES細胞打靶同源重組的方式將Lep基因的exon2用Loxp-FRT-pGK-Neo-polyA-FRT片段取代。該片段的替換理論上將破壞內(nèi)源Lep基因的正常轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯，造成Lep基因功能性缺失。打靶載體經(jīng)線性化后通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入ES細胞，通過G418和Ganciclovoir抗性篩選獲得抗性克隆。抽提抗性克隆基因組，通過PCR對抗性克隆是否發(fā)生同源重組進行初步鑒定。5'同源臂重組陽性ES細胞鑒定的PCR引物(P1和P2)分別位于5'同源臂上游臂外和Neo基因上，陽性ES細胞克隆可獲得2.8 kb的PCR產(chǎn)物，陰性ES細胞克隆無PCR產(chǎn)物;3'同源臂重組陽性ES細胞鑒定的PCR引物(P3和P4)分別位于Neo基因上和3'同源臂下游臂外, 陽性ES細胞克隆可獲得5.3 kb的PCR產(chǎn)物, 陰性ES細胞克隆無PCR產(chǎn)物。PCR鑒定陽性的克隆的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序確認(rèn)正確后, 選取同源重組陽性的ES細胞克隆進行擴增, 經(jīng)囊胚注射到C57BL/6J小鼠囊胚中發(fā)育獲得嵌合鼠, 嵌合鼠與C57BL/6J野生型小鼠交配，獲得F1代可穩(wěn)定遺傳的Lep基因敲除小鼠，F(xiàn)1代小鼠的PCR鑒定方法與鑒定同源重組ES細胞相同, 兩側(cè)同源臂均為陽性的為F1代雜合子小鼠。

1.6 Lep基因敲除純合子小鼠的獲得

Lep F1代雜合子小鼠在與C57BL/6J回交5代后所獲得的雜合子小鼠再進行互交，小鼠出生14 d剪尾，抽提基因組DNA，用后續(xù)基因型鑒定引物(P5, P6和P7)通過PCR方法對基因型進行鑒定。

1.7 Lep基因敲除小鼠模型體質(zhì)量及血糖分析

取野生型(WT)和Lep基因敲除雜合子(He)及純合子(Ho)小鼠雌雄各6只，從3周起，每周稱體質(zhì)量。取Lep基因敲除WT、He和Ho雌雄各6只，尾靜脈取血，通過拜安康血糖儀(德國拜耳)和血糖試紙測定禁食12 h后小鼠的空腹血糖水平，觀測周期為3～18周。

1.8 Lep基因敲除小鼠模型生化指標(biāo)分析

分別取18周齡和38周齡的WT、He和Ho, 禁食過夜, 小鼠麻醉后摘眼球取血，室溫靜置2～3 h，800×g離心15min, 取上清。通過希森美康(Sysmex)CHEMIX-180動物專用的血生化儀分別檢測: 血糖(GLU)、胰島素(INS)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、總膽固醇(TCHO)、三酰甘油(TG)等血脂生化指標(biāo); 尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(UA)等腎功能指標(biāo); 以及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)等肝功能評價指標(biāo)。

1.9 Lep基因敲除小鼠模型組織病理學(xué)分析

取18周齡和38周齡的Ho和WT各2只，脫頸椎處死，取肝臟和腎臟，用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，常規(guī)方法制備石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用GraphPad Prism6.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用x-± s表示，使用t檢驗方法統(tǒng)計并作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lep基因敲除小鼠模型的獲得

構(gòu)建的Lep基因敲除同源重組載體經(jīng)線性化、ES細胞打靶和藥物壓力篩選后共獲得96個抗性克隆；經(jīng)PCR鑒定，共獲得4個正確同源重組的ES細胞克隆。ES細胞陽性克隆PCR鑒定策略和引物位置如圖1A所示。 5'和3'同源臂正確重組陽性克隆PCR鑒定結(jié)果代表性電泳圖如圖1B和C所示，5'同源臂重組陽性克隆擴增獲得2.8 kb PCR產(chǎn)物條帶，陰性克隆無PCR產(chǎn)物，3'同源臂重組陽性克隆擴增獲得5.3 kb PCR產(chǎn)物條帶，陰性克隆無PCR產(chǎn)物。通過ES細胞的囊胚注射和胚胎移植，陽性ES細胞克隆共注射48枚囊胚，移植3只受體，出生小鼠17只，其中嵌合率大于50%的雄鼠5只。將嵌合雄鼠與C57BL/6J雌鼠進行交配，后代小鼠經(jīng)PCR鑒定獲得Lep基因敲除F1代He。

Lep F1代He在與C57BL/6J回交5代后所獲得的He間互交獲得WT、He、Ho三種基因型小鼠，其基因型鑒定電泳代表圖如圖1D所示(WT僅可擴增獲得351 bp產(chǎn)物條帶；He可擴增獲得351 bp和184 bp產(chǎn)物條帶; Ho僅可獲得184 bp產(chǎn)物條帶)。繁育過程中共獲得小鼠157只, 其中Ho 39只(占25%), He 84 只(占 53%)，WT 34 只(占 22%)，比例符合孟德爾遺傳規(guī)律；157只小鼠中雌鼠84只，雄鼠73只，雌雄比接近1∶1。

2.2 Lep基因敲除小鼠模型的體質(zhì)量

3周齡Lep基因敲除Ho雄鼠體質(zhì)量與同窩He和WT無顯著性差異，但自7周齡開始Ho體質(zhì)量顯著高于同窩He和WT，并且這種體質(zhì)量差異隨著年齡的增長顯著性增強(圖2A)，到18周時Ho雄鼠體質(zhì)量均值達51.8 g，是He與WT的1.9倍(圖2C);Lep基因敲除Ho雌鼠體質(zhì)量的變化趨勢與雄鼠相近(圖2B)，4周起Lep基因敲除Ho雌鼠體質(zhì)量較WT顯著性增高(P＜0.01), 18周時純合子體質(zhì)量均值達57 g, 是WT的2.96倍(圖2D)。以上結(jié)果顯示，Lep基因敲除小鼠具有和Jax的B6.Cg-Lep ob/J相類似的肥胖表型, 但總體體質(zhì)量略輕。

2.3 Lep基因敲除小鼠模型的血糖

3周齡Lep基因敲除Ho雄鼠血糖顯著高于同窩He和WT，且該表型至18周齡時仍然存在, 血糖變化趨勢急速升高后逐漸下降(圖3A)。Lep基因敲除Ho雌鼠血糖變化趨勢與雄鼠相近，3周齡起Lep基因敲除Ho雌鼠血糖顯著高于同窩He和WT, 且該表型至18周齡時仍然存在(圖3B)。38周齡時Ho雌鼠血糖與同窩He和WT相比已無明顯差異，但Ho雄鼠血糖表型仍然存在(表2)。

2.4 Lep基因敲除小鼠模型生化指標(biāo)

18周齡時Lep基因敲除小鼠生化指標(biāo)性別間并沒有顯著差異(表1), Ho的GLU及INS的含量均顯著高于WT和He, 表現(xiàn)出高血糖, 高胰島素表型。Lep基因敲除Ho血脂指標(biāo)也檢測到顯著變化, TCHO、HDL-C和LDL-C均顯著性高于野生型, 而TG顯著性低于WT和He(P＜0.05), 結(jié)果顯示基因敲除Ho脂質(zhì)代謝異常。

對18周齡Ho血清中肝、腎功能相關(guān)評價指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，血清中GLOB、D-BIL和T-BIL以及血清中UA等指標(biāo)未見明顯異常，但在Ho血清中AST(P＜0.01)和ALT較WT顯著升高(P＜0.05)。

在18周齡時與Ho無明顯性別差異不同的是，He在GLOB、ALT、AST、HDL-C、LDL-C、TCHO幾方面存在明顯的性別差異，且38周齡時HDL-C、TCHO的性別差異仍然存在。

38周齡時Ho在INS、ALT、AST、HDL-C、LDL-C、TCHO、TG仍然存在顯著差異(表2)。

圖1 Lep基因敲除小鼠構(gòu)建策略及鑒定Figure 1 Lep gene knockout strategy and identification

圖2 Lep基因敲除小鼠體質(zhì)量變化Figure 2 Change of body weight in Lep gene knockout mice

圖3 Lep基因敲除小鼠血糖變化Figure 3 Lep gene knockout mice blood glucose change

表1 18周齡Lep基因敲除小鼠血液生化指標(biāo)Table 1 Biochemical index in Lep gene knockout mice at 18 weeks

表2 38周齡Lep基因敲除小鼠血液生化指標(biāo)Table 2 Biochemical index in Lep gene knockout mice at 38 weeks

2.5 Lep基因敲除小鼠模型的肝臟及腎臟病理分析

18周齡的Lep基因敲除Ho較He和WT可觀察到明顯的體內(nèi)脂肪堆積；肝臟明顯增大, 組織稱重顯示，Ho的肝臟重量顯著增加(圖4A, P＜0.001); 腎臟重量無顯著性差異。進一步的病理切片分析表明，與WT相比，Lep基因敲除Ho肝臟可見明顯的空泡變性(圖4B)，但腎臟無顯著性差異(圖4B)。上述表型在38周齡時仍然存在(數(shù)據(jù)未列出)。

圖4 18周齡Lep基因敲除小鼠肝臟、腎臟病理分析Figure 4 Pathological changes of liver and kidney in Lep gene knockout mice at 18 weeks

3 討論

隨著物質(zhì)生活水平的提高、人口數(shù)量的不斷增加以及老齡化的加劇，我國II型糖尿病患病率大幅增長。全國調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2010年我國成年人糖尿病估測患病率約為11.6%，預(yù)計有近1.139億成人患病[14]，我國已成為全球糖尿病患者最多的國家。因此對于糖尿病的研究以及藥物研發(fā)對于我國人民健康具有非常重要的現(xiàn)實意義。

在糖尿病的發(fā)病機制機理研究以及藥物篩選方面，糖尿病小鼠模型扮演了非常重要的角色。目前常用的糖尿病小鼠模型主要有自發(fā)突變小鼠模型、實驗性小鼠模型和基因修飾小鼠模型。瘦素基因自發(fā)突變小鼠模型—ob/ob小鼠品系是目前國際公認(rèn)的II型糖尿病小鼠與肥胖癥模型，尤其是在糖尿病發(fā)病機理以及糖尿病腎病、肝病等并發(fā)癥發(fā)生的研究方面發(fā)揮了重要作用[15-17]。目前關(guān)于瘦素基因已有2種該基因自發(fā)突變小鼠模型和6種基因修飾小鼠模型(來自MGI-Mouse Genome Informatics,http://www.informatics.jax.org/)。

已有報道[18,19]顯示, ob小鼠的表型與遺傳背景密切相關(guān)，本課題研究中獲得的Lep基因敲除小鼠模型，與ob/ob小鼠類似，Lep基因功能缺失，只是遺傳背景為C57BL/6J與129S3的雜合。ob/ob小鼠在不同的遺傳背景中均表現(xiàn)出較為嚴(yán)重的糖尿病,只是在不同的細微表型上存在差異。不同背景突變小鼠在3～4周齡時均表現(xiàn)為血糖升高，只是在C57BL/6J背景的突變小鼠會產(chǎn)生胰島β-細胞的代償性增生，導(dǎo)致胰島素水平升高, 從而使得3～4月齡后的小鼠血糖逐漸恢復(fù)正常，而在其它的遺傳背景下血糖升高將維持?；谏鲜鲈?，作者對本研究建立的Lep基因敲除小鼠模型的血糖、胰島素、及肝腎功能指標(biāo)等進行了分析, 從目前的數(shù)據(jù)看，本課題組自主研發(fā)的小鼠模型表型與ob/ob小鼠基本一致—3周即表現(xiàn)出肥胖癥的表型，并且隨著年齡的增長而不斷加重；小鼠成年后表現(xiàn)出高血糖、高胰島素、高血脂的表型，以及肝功能障礙，并且這些表型在性別上無明顯差異; 38周齡時，雄性Ho仍然呈現(xiàn)出高血糖、高胰島素的表型而雌性Ho血糖已無明顯差異。但該小鼠模型與已報道的ob/ob小鼠不同的是: 純合子小鼠血清中甘油三酯的含量始終低于同窩的野生型小鼠，這種細微表型上的差異推測可能與小鼠的遺傳背景有關(guān)，其詳細的分子機制還有待進一步的研究。

綜上所述，通過基因修飾技術(shù)建立的Lep基因敲除小鼠模型具有自發(fā)性發(fā)病、表型穩(wěn)定、重復(fù)性高等特點。該模型表現(xiàn)出II型糖尿病的表型如：肥胖、高血糖、胰島素抵抗等，并且觀察到血脂代謝異常、肝損傷等糖尿病并發(fā)癥。Lep基因敲除小鼠模型的建立為我國針對肥胖、糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥發(fā)病機理的研究、臨床診斷與治療以及藥物篩選提供了較為理想的動物模型。

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Generation and Phenotyping Analysis of Lep Gene Knockout Mice

CHI Jun1,2, GONG Hui3, HE Yue-wei12, WAN Ying-han2,3, FEI Jian1, KUANG Ying1
(1. Shanghai Model Organisms Center Inc, Shanghai 201203, China;2. Tongji University, Shanghai 200092, China;3. Shanghai Research Center for Model Organisms, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo provide mouse models for obesity and diabetes research and drug development, the Leptin (Lep) gene knockout mouse model was established and analyzed.MethodsThe Lep gene knockout mouse model was established by using embryonic stem cell and homologus recombination technology. Body weight and plasma glucose were measured, and the three genotypes of Lep gene knockout mice were sacrificed for detection of the serum biochemistry parameters. All the data generated from Lep gene knockout mice were compared with age-matched heterozygote(He) and wild type (WT) mice in statistics. Pathological changes of hepatic and kidney tissues between Lep gene knockout and WT mice were observed under microscope.ResultsThe Lep gene knockout mouse model was established. Preliminarily phenotypic analysis show that Lep gene knockout mice develop obesity and hyperinsulinemia, hyperglycemia, lipid metabolism disorder,liver dysfunction .From the pathological analysis, the hepatocyte swelling and macro vacuolar steatosis were observed.ConclusionThe Lep gene knockout mouse model was established and it could be used for obesity and diabetes research and drug development.

Leptin (Lep) gene; Gene knockout mice; Obesity; Type 2 Diabetes

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0344-08

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.002

2017-03-31

上海市科委項目資助(14140900400, 15DZ2290800)

池 駿(1982-), 男, 工程師。E-mail: jun.chi@shmo.com.cn

匡 穎(1965-), 女, 碩士, 研究員。E-mail: ying.kuang@shmo.com.cn