米非司酮對Wistar大鼠窗口期子宮內(nèi)膜整合素和血管內(nèi)皮生長因子基因表達(dá)的影響

唐 彬, 黎福榮, 付新錄, 江國建, 趙 勇, 張 薇

(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心, 廣州510080)

米非司酮對Wistar大鼠窗口期子宮內(nèi)膜整合素和血管內(nèi)皮生長因子基因表達(dá)的影響

唐 彬, 黎福榮, 付新錄, 江國建, 趙 勇, 張 薇

(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心, 廣州510080)

目的 研究米非司酮對大鼠窗口期子宮內(nèi)膜整合素(αvβ3)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因表達(dá), 探討其對子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)的影響。方法 將36只Wistar大鼠分4組，1、2組妊娠1 d后分別服用5 mg/kg、10 mg/kg的米非司酮，3、4組為空白未妊娠組和空白妊娠組，4個組于4.5 d后麻醉取大鼠子宮內(nèi)膜組織，進(jìn)行透射電鏡觀察、ELISA檢測血清中雌激素、孕激素含量，同時運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，定量分析整合素αvβ3以及VEGF 基因在其子宮內(nèi)膜中的表達(dá)。結(jié)果 米非司酮能明顯抑制Wistar大鼠窗口期子宮內(nèi)膜αvβ3、VEGF基因的表達(dá)，同時能顯著降低窗口期孕激素的含量(P＜0.05)，其三者的下調(diào)及子宮內(nèi)膜的超微結(jié)構(gòu)的改變與米非司酮具有明顯的劑量依賴關(guān)系，對雌激素的含量沒有顯著影響(P＞0.05)。結(jié)論 米非司酮能在不同程度上降低大鼠整合素αvβ3、VEGF基因的表達(dá)及孕激素的含量，破壞子宮內(nèi)膜的超微結(jié)構(gòu).

米非司酮; 整合素(αvβ3); 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF); 雌激素; 孕激素

整合素 (integrins) 為細(xì)胞粘附分子家族的重要成員之一, 是一組廣泛分布于細(xì)胞表面由α及β兩個亞單位(αvβ3)組成的跨膜糖蛋白受體, 主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)之間的相互黏附 , 并介導(dǎo)細(xì)胞與 ECM 之間的雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 對細(xì)胞的黏附、增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡起著重要的調(diào)控作用[1-3]。同時，整合素αvβ3的表達(dá)在血管生成與重建過程中具有獨(dú)特的作用[4]。血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 是目前認(rèn)為作用最強(qiáng)、特異性最高的促血管生成因子，是新生血管形成定量分析的較可靠指標(biāo)。研究表明[5]，VEGF 的表達(dá)與血管生成明顯呈正相關(guān)，故 VEGF 能較好地反映新生血管生長的活躍程度，其在胚胎發(fā)育、骨骼生長和生殖等眾多生物學(xué)過程中起重要作用，且卵泡的生長和黃體的發(fā)育依賴于新生的毛細(xì)血管，而VEGF 對小鼠胚胎及新生鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和存活至關(guān)重要。VEGF 促進(jìn)血管生成，是促進(jìn)腫瘤血管生成的重要因子, 在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中起著不可或缺的作用[6,7]。αvβ3、VEGF是血管新生具有協(xié)同作用的重要因子，而新生血管的正常增生是促進(jìn)窗口期子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)的構(gòu)建并保持一種允許胚胎種植狀態(tài)的重要環(huán)節(jié)。

米非司酮臨床應(yīng)用在不斷被挖掘，但作用機(jī)理尚不夠深入，本研究在大鼠妊娠1 d后給予不同劑量的米非司酮，觀察妊娠4.5 d的大鼠胚胎種植窗口期αvβ3，VEGF基因在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，大鼠血清雌激素、孕激素的含量，以及對窗口期子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

米非司酮由深圳市資福藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號: 國藥準(zhǔn)字H20055518，批號: 141004。手提式高速分散器(中國, 寧波新芝, S10)、紫外可見分光光度計(jì)(中國, 上海奧譜勒儀器, UV-752P)、紫外透射分析儀(中國，Hema, UV-3A)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(中國，江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器，HH-4)、冷凍高速離心機(jī)(中國，Hema, TGL-16R)、基因擴(kuò)增儀(中國，Hema，Hema9600)、Real-time Quantitative PCR(美國，Bio-Rad，MiniOpticon)、Trizol(美國，MRC，TR118-500)、M-MLV Reverse Transcriptase(美國，Promega, M1705)、GoTaq?qPCR Master Mix(美國，Promega，A6002)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與環(huán)境

SPF級Wistar近交系雌雄性大鼠各36只, 體質(zhì)量180～220 g，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(粵)2011-0029]，飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(北校)屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施[SYXK(粵)2012-0081]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 妊娠判斷 將25只雄鼠與25只雌鼠合籠，于第2日上午檢查陰栓，以在雌鼠陰道見到陰道栓或陰道分泌物涂片在光學(xué)顯微鏡下觀察到精子確定妊娠。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將妊娠Wistar大鼠分為3組, 1組服用5 mg/kg劑量的米非司酮(8只), 2組服用10 mg/kg的米非司酮(8只)，3組為空白妊娠組(9只)，另設(shè)空白未妊娠組(11只)，1、2組模型大鼠妊娠1d后分別服用米非司酮，在妊娠4.5 d麻醉取材觀察。

1.3.3 檢測方法 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%烏來糖溶液按0.6 mL/100 mg腹腔注射麻醉大鼠后，取子宮組織于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛中固定，在JEM-1400的透射電鏡下觀察，其血清用ELISA 方法進(jìn)行雌、孕激素的測定, 同時運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測αvβ3、VEGF基因在在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)，目標(biāo)基因的相對表達(dá)量計(jì)算公式為: 2-△△Ct= 2-[(△Ct)處理組 - (△ Ct)對照組], 其中, △△ Ct =(△ Ct)處理組- (△Ct)對照組, 表示處理組相對對照組進(jìn)行歸一化, 2-△△Ct表示處理組相對對照組的相對表達(dá)量。

引物分別為

VEGF正向: TTCATGGACGTCTACCAGCG;

VEGF 反向: CTTCATCATTGCAGCAGCCC;

αvβ3正向: CTGGACTGGCTACTACTGCA;

αvβ3反向: ATGTAGCTTTCCCCGGTTGA

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜透射電鏡觀察

空白未妊娠組子宮在位內(nèi)膜黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則均一致呈低柱狀 (圖1B)，排列整齊, 層次清晰，細(xì)胞核位于基底位，核質(zhì)分布均勻，高爾基體及線粒體散在分布于分泌細(xì)胞中; 上皮細(xì)胞間隙緊密, 黏膜上皮主要由少量纖毛細(xì)胞和大量分泌細(xì)胞組成，質(zhì)頂部可見電子致密顆粒，分泌細(xì)胞游離面可見短小微絨毛, 呈板層狀，排列整齊(圖1A)。空白妊娠組在位內(nèi)膜黏膜上皮細(xì)胞也呈低柱狀，且胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體，多為卵圓形; 基質(zhì)細(xì)胞長梭形，細(xì)胞核大，呈不規(guī)則長管狀，胞質(zhì)較少，核漿比例大; 細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量較多，體積較小，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體均較空白未妊娠組發(fā)達(dá)(圖1B)。

米非司酮5 mg/kg劑量組在位內(nèi)膜黏膜上皮細(xì)胞呈柱狀, 形態(tài)較規(guī)則, 基底膜完整, 較彎曲; 上皮細(xì)胞緊密連接，分泌細(xì)胞游離面微絨毛短小, 腺腔可見少量脫落的微絨毛; 胞質(zhì)內(nèi)電子致密顆粒散在分布、脂滴少; 胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富并具有一定的空泡化但無內(nèi)含物(圖1C); 細(xì)胞核較不規(guī)則,核膜可見大小不等的切跡，核染色質(zhì)均勻。

米非司酮10 mg/kg劑量組子宮在位內(nèi)膜黏膜上皮細(xì)胞呈高低不齊的柱狀，細(xì)胞排列不規(guī)則，基底膜彎曲; 上皮細(xì)胞縫隙連接，分泌細(xì)胞游離面微絨毛短小，腺腔可見大量脫落的微絨毛(圖1D); 胞質(zhì)內(nèi)電子致密顆粒少見，可見豐富脂滴(圖1E); 細(xì)胞核不規(guī)則,核膜內(nèi)陷核膜有缺裂,核質(zhì)周圍邊集化，呈鋸齒狀; 胞質(zhì)內(nèi)線粒體部分空泡化并有內(nèi)含物，且大部分脊已斷裂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯(圖1F)。

2.2 血清激素含量

雌激素含量四個組別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表1)。而米非司酮能夠下調(diào)妊娠大鼠孕激素含量, 且劑量效應(yīng)明顯(P＜0.05 或P＜0.01)(表1)。

2.3 子宮內(nèi)膜基因表達(dá)

圖1 大鼠子宮組織超微結(jié)構(gòu)觀察

表1 各組大鼠血清雌、孕激素含量

與空白妊娠組比較, 5 mg/kg米非司酮組αvβ3基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 10 mg/kg米非司酮能夠明顯下調(diào)妊娠大鼠αvβ3基因表達(dá)(P＜0.05)。5 mg/kg、10mg/kg米非司酮組均可下調(diào)妊娠大鼠VEGF基因表達(dá)，劑量效應(yīng)明顯(P＜0.05或P＜0.01)(表 2)。

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜αvβ3、VEGF基因相對表達(dá)

3 討論

本研究中10 mg/kg劑量的米非司酮能同時下調(diào)Wistar大鼠窗口期孕激素含量、αvβ3以及VEGF表達(dá), 嚴(yán)重?fù)p害子宮內(nèi)膜的超微結(jié)構(gòu)。5 mg/kg劑量的米非司酮對孕激素、VEGF有下調(diào)作用, 但對αvβ3的作用不明顯, 對子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)有輕微損害, 其三者的下調(diào)及子宮內(nèi)膜的超微結(jié)構(gòu)的改變與米非司酮具有明顯的劑量依賴關(guān)系。米非司酮對VEGF、αvβ3的影響, 前者較后者敏感, 而本研究中 Wistar大鼠窗口期的雌激素水平?jīng)]有出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象。

子宮內(nèi)膜在接受胚胎種植的窗口期, 要發(fā)生充血、增厚、上皮增生、子宮腺體分泌逐漸增強(qiáng)等變化，促使窗口期子宮內(nèi)膜變化的因素主要有子宮母體激素、子宮內(nèi)膜容受性、胚泡激素、胚激肽等。孕激素具有促使子宮內(nèi)膜分泌，以利受精卵植入; 米非司酮與子宮內(nèi)膜中的孕激素受體高親和力結(jié)合，其影響子宮內(nèi)膜的孕激素受體表達(dá)[8], 競爭性阻斷了孕激素的作用，其作用機(jī)制為米非司酮與孕激素受體結(jié)合后, 并不阻斷受體與熱休克蛋白的解離，也允許受體二聚化并與DNA結(jié)合, 但米非司酮不能激活孕激素受體的激素結(jié)合區(qū)( HBD) 上的轉(zhuǎn)錄活化因子，因而不發(fā)揮黃體酮的活性效應(yīng)[9-11]，從而競爭性抑制孕激素的作用，這樣使孕激素減少。本研究中5 mg/kg、10 mg/kg劑量的米非司酮均導(dǎo)致大鼠孕激素含量下降，且隨著劑量的增加下降越明顯，大鼠胚胎種植期的子宮內(nèi)膜增生失去孕激素的支持。

最近研究表明[12], VEGF和整合素αvβ3是參與子宮內(nèi)膜血管生成的重要生長因子，其中，VEGF可以通過受體VEGFR2 /KDR 刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化，降解基底膜使內(nèi)皮細(xì)胞增殖形成新的血管。而整合素αvβ3位于細(xì)胞膜，作為一種信號受體能夠誘導(dǎo)蛋白酪氨酸磷酸化以傳遞細(xì)胞信號，參與VEGF 誘導(dǎo)的血管生成進(jìn)一步支持血管生成[8]。二者在血管生成的過程中起著協(xié)同作用。在子宮內(nèi)膜中，血管中的血液起著輸送營養(yǎng)以及各種生物信號肽的作用，一旦整合素αvβ3以及VEGF 基因的表達(dá)量下降，會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜血管生成受阻，影響窗口期子宮內(nèi)膜組織正常形態(tài)變化。本研究中米非司酮有下調(diào)子宮內(nèi)膜 VEGF、αvβ3的表達(dá)作用, 與趙軒等[13]臨床報道的米非司酮有抑制VEGF產(chǎn)生，抑制內(nèi)膜螺旋動脈的血管生長等作用相吻合。

本研究通過透射電鏡對米非司酮組窗口期子宮內(nèi)膜的觀察，顯示米非司酮明顯破壞子宮內(nèi)膜的超微結(jié)構(gòu)功能，子宮位內(nèi)膜組織有著不同程度的損傷改變, 5 mg/kg劑量組損害較輕，僅表現(xiàn)為少量絨毛脫落，線粒體少量空泡化，胞質(zhì)有少量脂滴；10 mg/kg劑量組胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯，核膜內(nèi)陷有缺裂、核質(zhì)著周圍邊集化，胞質(zhì)有脂滴增多等等，子宮內(nèi)膜的改變除VEGF 基因的表達(dá)量下降，導(dǎo)致新生血管生成困難外，另一原因可能源于米非司酮對內(nèi)膜的抗增殖作用, 以減少內(nèi)膜的血管生成及子宮血流下降, 使內(nèi)膜動脈萎縮,內(nèi)膜變薄妊娠困難。有學(xué)者報道[14]，米非司酮可增加內(nèi)源性前列腺素(PG)的合成，而PG具有強(qiáng)大的收縮子宮平滑肌和血管平滑肌的作用，使子宮肌及血管收縮。同時，米非司酮還可通過阻斷孕激素受體,降低血液中-氧化氮(NO)、腎上腺髓質(zhì)素(ADM)、降鈣素基因相關(guān)膚(CGRp)這三種具有強(qiáng)大擴(kuò)管作用的血管活性物質(zhì)的合成[14]，從而減弱孕激素?cái)U(kuò)血管作用,使子宮血管收縮，最終導(dǎo)致在位子宮內(nèi)膜的超微結(jié)構(gòu)的改變[15]。本研究表明，αvβ3、VEGF以及孕激素是大鼠子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和維持的重要影響因子，三者的下調(diào)，在雌激素沒有顯著變化情況下，仍能引起大鼠子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)的改變。推測在雌激素不變的前提下，孕激素的降低，導(dǎo)致雌孕激素比列的失調(diào)也可能是影響子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)改變的重要原因。

VEGF 是許多腫瘤血管生成的核心，主要由多種組織細(xì)胞分泌，分布廣泛，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、淋巴道轉(zhuǎn)移等過程中起著至關(guān)重要的作用。腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟是新生血管的形成。整合素可以加快腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成[16,17]，Hosotani 等[18]研究顯示αvβ3整合素的高表達(dá)有促進(jìn)胰腺癌侵襲生長及遠(yuǎn)處遷徙轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，二者對促進(jìn)腫瘤組織新生血管形成起到協(xié)同作用。

目前, 米非司酮作為孕激素的受體拮抗藥物, 婦產(chǎn)科臨床治療應(yīng)用廣泛, 如: 終止早期妊娠[19]、緊急避孕和功能性子宮出血[20]、子宮內(nèi)膜異位癥[21]、子宮肌癌[22]、腦膜瘤[23,24]等疾病的治療，但其治療子宮肌癌、腦膜瘤等疾病作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證尚不深入。米非司酮對子宮肌瘤的治療，主要觀點(diǎn)認(rèn)為米非司酮是雌性激素的競爭性抑制劑，可以與孕酮受體結(jié)合[25], 然而本研究表明, 米非司酮不僅僅是降低孕激素, 5 mg/kg劑量的米非司酮能降低子宮內(nèi)膜組織VEGF的表達(dá)，10 mg/kg劑量的米非司酮能同時降低VEGF、αvβ3整合素的表達(dá)，阻止了子宮內(nèi)膜新生血管的生成，可能是其治療子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、腦膜瘤的重要作用機(jī)理之一。而米非司酮對VEGF、αvβ3的下調(diào)作用，是否可成為阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Mifepristone on Expression of Integrin αvβ3and Vascular Endothelial Growth Factor in Wistar Rats at Implantation Window Phase

TANG Bin, LI Fu-rong, FU Xing-Lu, JIANG Guo-Jian, ZHAO Yong, ZHANG Wei
(Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China)

ObjectiveTo investigate the effect of mifepristone on the expression of integrin αvβ3and vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, and the effect on ultrastructure of endometrium at implantation window phase in Wistar rats.MethodsThirty-six Wistar rats were divided to four groups,the rats of two experimental groups were orally administered with 5 mg/kg, 10 mg/kg of mifepristone respectively one day after conception. The endometrium was collected 4.5 days after mate both in two experimental groups and two control groups. Ultrastructure of the endometrium were observed by transmission electron microscope, and the expression of integrinαvβ3andVEGFgene in endometrial were tested by RT-PCR method, meantime, the contents of estrogen and progesterone in serum were detected by ELISA technique.ResultsMifepristone can inhibits the expression of integrin αvβ3, VEGF and progesterone, and increase the content of estrogen (P＞0.05). The down-regulation of the three factors and the changes of the ultrastructure of endometrium has obvious dose-response relationship with mifepristone.ConclusionThe expression of integrinαvβ3andVEGFgene were decreased differently by mifepristone as well as the content of progesterone, eventually it will affect the ultrastructure of endometrium.

Mifepristone; Integrin αvβ3; Vascular endothelial growth factor (VEGF); Estrogen;Progesterone

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0399-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.011

2017-04-20

廣東省科技基礎(chǔ)條件建設(shè)項(xiàng)目(No. 2012B060300015)

唐 彬(1989-), 男, 碩士, 主要從事實(shí)驗(yàn)動物研究。E-mail: 761284837@qq.com

張 薇(1964-), 女, 碩士, 高級實(shí)驗(yàn)師, 從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)動物研究工作。E-mail: zwygqj@163.com