應(yīng)用樹(shù)鼩對(duì)硫酸乙酰肝素佐劑的安全性初步評(píng)價(jià)

李彥涵, 李建芳, 孫 靜, 烏美妮, 王海璇, 胡云章

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所疫苗研究室云南省蟲(chóng)媒傳染病防控研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省重大傳染病疫苗工程技術(shù)研究中心, 昆明 650118)

應(yīng)用樹(shù)鼩對(duì)硫酸乙酰肝素佐劑的安全性初步評(píng)價(jià)

李彥涵, 李建芳, 孫 靜, 烏美妮, 王海璇, 胡云章

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所疫苗研究室云南省蟲(chóng)媒傳染病防控研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省重大傳染病疫苗工程技術(shù)研究中心, 昆明 650118)

目的 通過(guò)檢測(cè)佐劑硫酸乙酰肝素(HS)對(duì)樹(shù)鼩皮膚的刺激性反應(yīng)以及佐劑與甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)聯(lián)合免疫樹(shù)鼩后主要組織器官的病理分析，探討以樹(shù)鼩作為動(dòng)物模型進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的可行性。方法 根據(jù)給藥次數(shù)和皮膚是否完整將樹(shù)鼩隨機(jī)分組，采用樹(shù)鼩同體自身左右對(duì)比的方法進(jìn)行皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)。根據(jù)疫苗及佐劑種類將樹(shù)鼩隨機(jī)分組，采用皮下免疫方式，免疫后20周取主要組織器官制備病理切片，HE染色，觀察主要組織器官病理學(xué)特征。結(jié)果 佐劑HS單次及多次給藥對(duì)樹(shù)鼩完整皮膚組和破損皮膚組的受試部位均不產(chǎn)生紅斑、水腫等刺激性變化。與對(duì)照組相比， HepA-l免疫組以及HepA-l聯(lián)合HS免疫組的心、肝、脾、肺、腎及大腦組織病理觀察，均未見(jiàn)明顯異常。結(jié)論 證實(shí)了以樹(shù)鼩作為動(dòng)物模型進(jìn)行疫苗安全性評(píng)價(jià)的可行性，為以后疫苗及藥物評(píng)估平臺(tái)建設(shè)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

樹(shù)鼩; 硫酸乙酰肝素(HS); 甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l); 皮膚刺激性實(shí)驗(yàn); 病理分析;安全性評(píng)價(jià)

樹(shù)鼩(Tupaia belangeri, Tree shrew)是一種生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶地區(qū)的接近靈長(zhǎng)類動(dòng)物的小型哺乳類動(dòng)物，具有體型小、比較容易飼養(yǎng)及在生物進(jìn)化史上更接近人類等優(yōu)點(diǎn)，早在1970、1980年代就用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[1-3]。因此以樹(shù)鼩作為人類重大疾病研究的動(dòng)物模型[4-6], 在醫(yī)學(xué)生物學(xué)上已呈現(xiàn)出廣闊應(yīng)用前景[7-10]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)疫苗安全性評(píng)價(jià)大多選用大鼠、小鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，而以樹(shù)鼩作為動(dòng)物模型對(duì)疫苗進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)卻缺乏報(bào)道，制約了樹(shù)鼩作為標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物模型的建立。

本實(shí)驗(yàn)觀察佐劑硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)對(duì)樹(shù)鼩皮膚的刺激反應(yīng)，并將甲型肝炎減毒活疫苗(Hepatitis A virus attenuated live vaccine, HepA-l)與HS聯(lián)合對(duì)樹(shù)鼩進(jìn)行免疫，免疫后解剖樹(shù)鼩取主要組織器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，為樹(shù)鼩作為動(dòng)物模型進(jìn)行疫苗免疫或安全性評(píng)價(jià)提供病理學(xué)方面的指標(biāo)，并為樹(shù)鼩標(biāo)準(zhǔn)化模型的建立完善數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)成年雄性樹(shù)鼩, 體質(zhì)量130～160 g, 來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。所有相關(guān)操作均按照醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求進(jìn)行, 動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[SYXK(滇)K2014-0007]。

1.2 疫苗及佐劑

HepA-l, 甲型肝炎病毒(HAV)抗原滴度256 EU/mL,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供；HS(1 mg/mL)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取健康樹(shù)鼩16只, 隨機(jī)分為單次給藥組和多次給藥組, 每組各8只, 其中單次給藥完整皮膚組、單次給藥破損皮膚組、多次給藥完整皮膚組以及多次給藥破損皮膚組各4只。

1.3.2 樹(shù)鼩皮膚準(zhǔn)備 各組樹(shù)鼩在實(shí)驗(yàn)前24 h采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%硫化鈉水溶液脫毛，去除樹(shù)鼩背部脊柱兩側(cè)毛發(fā)，每側(cè)脫毛面積為20 cm2左右，脫毛后觀察皮膚是否有損傷，若無(wú)損傷則作為完整皮膚組繼續(xù)實(shí)驗(yàn); 破損皮膚組用滅菌針尖將去毛消毒皮膚劃破，以見(jiàn)有滲血為度[11,12]。

1.3.3 單次皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 根據(jù)分組每只樹(shù)鼩采用同體自身左右對(duì)比，背部去毛區(qū)左側(cè)涂HS 50 μg，右側(cè)涂0.5 mL生理鹽水作為對(duì)照，給藥部位用一層油紙外加兩層紗布包裹固定，6 h后用溫水去除殘留涂抹物，之后1h、24 h、48 h、72 h肉眼觀察，記錄給藥部位紅斑及水腫情況，按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判斷刺激強(qiáng)度。

1.3.4 多次給藥皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 按單次皮膚刺激實(shí)驗(yàn)方法, 6 h后去除固定, 每日給藥1次, 連續(xù)1周,末次去除涂抹物后1 h、24 h、48 h、72 h肉眼觀察，記錄給藥部位紅斑及水腫情況，按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判斷刺激強(qiáng)度。

1.3.5 皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 以皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫等為評(píng)價(jià)指標(biāo)。無(wú)紅斑分值為0，輕度紅斑分值為1，中度紅斑分值為2，重度紅斑分值為3，紫紅色紅斑到輕度焦痂形成分值為4。無(wú)水腫分值為0，輕度水腫分值為1，中度水腫分值為2，重度水腫分值為3，嚴(yán)重水腫分值為4。并根據(jù)紅斑和水腫的積分制計(jì)算皮膚刺激強(qiáng)度, 公式為: 每組動(dòng)物平均分值=Σ紅斑和水腫積分/每組動(dòng)物數(shù)[11-13]。

1.4 樹(shù)鼩經(jīng)疫苗及佐劑免疫后的組織病理學(xué)檢查

1.4.1 疫苗與佐劑使用劑量及制備 本實(shí)驗(yàn)室前期以小鼠為模型摸索出單獨(dú)免疫HepA-l合適使用劑量是18EU, HS合適使用劑量是100 μg[14]。將疫苗與佐劑混合后, 在漩渦振蕩儀上劇烈震蕩混勻, 備用。

1.4.2 動(dòng)物分組及免疫 將24只成年健康雄性樹(shù)鼩分為HepA-l免疫組、HepA-l聯(lián)合佐劑HS組以及空白對(duì)照組，免疫途徑為皮下免疫，每組8只，免疫后20周取材進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。檢測(cè)前樹(shù)鼩禁食禁水12～14 h，戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，股動(dòng)脈放血處死。立即解剖取腦、肝臟、腎臟、心、肺等各組織標(biāo)本用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液固定72 h以上。用全自動(dòng)脫水機(jī)脫水透明，常規(guī)石蠟包埋，全自動(dòng)染色機(jī)HE染色、封片[15]。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1 佐劑HS對(duì)樹(shù)鼩皮膚刺激

2.1.1 單次刺激 佐劑HS 對(duì)樹(shù)鼩單次給藥完整皮膚組和破損皮膚組的受試部位均無(wú)紅斑、水腫等刺激性變化，除破損皮膚組1 h的平均分值為0.25外其余均為0，表明佐劑HS單次給藥對(duì)樹(shù)鼩的皮膚沒(méi)有刺激性(表1)。

2.1.2 多次刺激 佐劑HS 對(duì)樹(shù)鼩多次給藥完整皮膚組和破損皮膚組的受試部位均無(wú)紅斑、水腫等刺激性變化, 除完整皮膚組1 h的平均分制為0.25以及破損皮膚組1 h的平均分值為0.5外，其余均為0，表明佐劑HS多次給藥對(duì)樹(shù)鼩的皮膚無(wú)明顯刺激性(表 2)。

2.2 樹(shù)鼩經(jīng)疫苗及佐劑免疫后的組織病理學(xué)檢查

實(shí)驗(yàn)期間各組樹(shù)鼩體質(zhì)量、毛色均正常，未出現(xiàn)蜷縮、豎毛、搔鼻、抽搐、痙攣、水腫及休克等異常反應(yīng)，各組樹(shù)鼩注射部位均未出現(xiàn)紅腫、結(jié)節(jié)，進(jìn)食、水、糞便和精神等均正常。

樹(shù)鼩經(jīng)HepA-l以及HepA-l聯(lián)合佐劑HS免疫后，主要組織器官的病理切片與空白對(duì)照組相比，未見(jiàn)明顯異常的病理學(xué)改變，說(shuō)明甲肝疫苗聯(lián)合佐劑免疫樹(shù)鼩具有良好的安全性(圖1)。

3 討論

樹(shù)鼩是在進(jìn)化中處于食蟲(chóng)類和靈長(zhǎng)類之間，接近靈長(zhǎng)類的小型哺乳動(dòng)物。由于其具有體型小、壽命較長(zhǎng)等特點(diǎn)，在生理機(jī)能、生化代謝和基因組的相似性方面比大鼠、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更接近于人，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究[16-18]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于疫苗評(píng)價(jià)大多選用小鼠或者靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，各種檢測(cè)技術(shù)都比較成熟，但目前還尚未有樹(shù)鼩作為動(dòng)物模型進(jìn)行疫苗安全性評(píng)價(jià)的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以樹(shù)鼩為動(dòng)物模型，觀察佐劑HS對(duì)樹(shù)鼩皮膚的刺激反應(yīng)，并將HepA-l疫苗與HS聯(lián)合對(duì)樹(shù)鼩進(jìn)行免疫，免疫后解剖樹(shù)鼩分析各主要組織器官的病理學(xué)切片，完成佐劑安全性的初步評(píng)價(jià)。

表1 佐劑HS單次給藥對(duì)樹(shù)鼩皮膚刺激的測(cè)定結(jié)果(n=4)

表2 佐劑HS多次給藥對(duì)樹(shù)鼩皮膚刺激的測(cè)定結(jié)果 (n=4)

HS是一類廣泛分布于細(xì)胞外基質(zhì)的糖胺聚糖，當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生炎癥或損傷時(shí)，降解為可溶性低分子量HS[19]。HS作為免疫佐劑能增強(qiáng)以小鼠為動(dòng)物模型的體液免疫應(yīng)答，并且對(duì)于以乙型肝炎病毒亞單位為抗原的體液免疫增強(qiáng)效應(yīng)優(yōu)于鋁佐劑或與鋁佐劑相當(dāng)[20]。以佐劑HS作為涂抹物檢測(cè)樹(shù)鼩完整皮膚和破損皮膚的刺激性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，佐劑HS 對(duì)樹(shù)鼩單次及多次給藥完整皮膚組和破損皮膚組的受試部位均無(wú)紅斑、水腫等刺激性變化。另外, 本實(shí)驗(yàn)對(duì)樹(shù)鼩進(jìn)行HepA-l以及HepA-l聯(lián)合HS免疫后，分別于末次免疫后的4周、8周、12周、16周和20周尾靜脈采血，用ELISA法檢測(cè)了樹(shù)鼩血清中的特異性IgG抗體水平。研究結(jié)果表明，除空白對(duì)照組外，其余組均在末次免疫的第四周檢測(cè)到抗-HAV抗體，并且抗體水平隨著免疫時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，于第12周達(dá)到峰值，此后逐漸下降[21]。說(shuō)明以樹(shù)鼩作為動(dòng)物模型進(jìn)行疫苗檢測(cè)是可行的，樹(shù)鼩可以對(duì)疫苗產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，體液免疫效果復(fù)合研究預(yù)期[21]。甲型肝炎減毒活疫苗HepA-l自1992年在我國(guó)大規(guī)模推廣應(yīng)用至今已有10余年，為預(yù)防甲型肝炎的傳播發(fā)揮了巨大的作用。文獻(xiàn)報(bào)道[22,23]以獼猴等靈長(zhǎng)類為動(dòng)物模型進(jìn)行HepA-l的安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在接種免疫后，無(wú)接種部位和全身異常反應(yīng)，肝組織在觀察全程無(wú)病理改變，尸檢均未見(jiàn)甲肝病變。 本實(shí)驗(yàn)以樹(shù)鼩作為動(dòng)物模型進(jìn)行HepA-l免疫后， HepA-l免疫組以及HepA-l聯(lián)合HS免疫組的心臟、肝臟、脾、肺、腎及大腦病理切片與對(duì)照組相比，均未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變，研究結(jié)果與用靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)得出的結(jié)果一致。

研究表明, HS作為佐劑具有良好的安全性, 并且結(jié)果提示以樹(shù)鼩作為動(dòng)物模型進(jìn)行疫苗及佐劑的安全性評(píng)價(jià)是可行的。綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了以樹(shù)鼩作為動(dòng)物模型進(jìn)行疫苗評(píng)價(jià)的可行性, 為以后疫苗及藥物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)平臺(tái)的建設(shè)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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圖1 樹(shù)鼩主要器官組織病理學(xué)觀察

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Safety Evaluation on Adjuvant Heparan Sulfate in Tree Shrew

LI Yan-han, LI Jian-fang, SUN Jing, WU Mei-ni, WANG Hai-xuan, HU Yun-zhang
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical College and Peking Union Medical College,Yunnan Key Laboratory of Prevention & Control on Insect Infectious Disease, Yunnan Research Center of Engineering Technique for Vaccines against Severe Infectious Diseases, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo explore the feasibility of tree shrew as an animal model for safety evaluation,through the detection of adjuvant heparan sulfate (HS) of the tree shrew skin irritation and adjuvant with Hepatitis A virus attenuated live vaccine (HepA-l) combined with immune pathological analysis of main organs on tree shrews.MethodsAccording to the dose frequency and skin integrity, the tree shrews were randomly divided into two groups, the skin irritation test performed by tree shrew own left and right contrast. According to the vaccine and adjuvant type the tree shrews randomly divided, subcutaneous immunization. Twenty weeks after immunization, major organs are harvested to make pathological slice and perform HE staining analysis.ResultsThe skin irritation test of adjuvant HS on tree shrews were no erythema, edema and other irritating changes of single and multiple dosing group on integrity skin or damaged skin. There is no significant pathological change between HepA-l and HepA-l combined with HS group on heart, liver, spleen, lung and kidney and the brain biopsy.ConclusionThe experiment proved that the tree shrew as an animal model for vaccine safety evaluation is feasible, provide the basical data for future vaccine and drug evaluation platform.

Tree shrew; Heparan sulfate(HS); Hepatitis A virus attenuated live vaccine(HepA-l);Skin irritation test; Pathological analysis; Safety evaluation

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0390-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.009

2017-03-09

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAI01B01); 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC1202305)

李彥涵(1982-), 女, 碩士, 助理研究員, 研究方向: 疫苗研發(fā)。E-mail: 110393273@qq.com

胡云章(1962-), 男, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事病毒疫苗方面的研究。E-mail: huyunzhangym@126.com