裸鼴鼠血清中免疫球蛋白的分離純化及含量的檢測

程繼帥, 袁 征, 楊文靜, 李壘辰, 叢 薇, 孫 偉, 柏曉松, 崔淑芳

(1. 第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心, 上海200433; 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 北京100850;3. 上海市市東醫(yī)院檢驗科, 上海200438)

裸鼴鼠血清中免疫球蛋白的分離純化及含量的檢測

程繼帥1, 袁 征2, 楊文靜1, 李壘辰1, 叢 薇1, 孫 偉1, 柏曉松3, 崔淑芳1

(1. 第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心, 上海200433; 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 北京100850;3. 上海市市東醫(yī)院檢驗科, 上海200438)

目的 利用Protein A親和層析法分離純化裸鼴鼠血清免疫球蛋白(Ig), 并檢測正常的裸鼴鼠血清中三種Ig(IgG、IgA、IgM)的含量。方法 采集裸鼴鼠外周血血清, 用Protein A親和層析法純化血清Ig，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白的純度，測定其重鏈、輕鏈的分子量;利用ELISA試劑盒檢測成年裸鼴鼠血清中IgG、IgA、IgM的含量。結(jié)果 純化后的裸鼴鼠血清Ig，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其重鏈和輕鏈的相對分子質(zhì)量分別為55 000和25 000。雄性成年裸鼴鼠血清中IgG、IgA、IgM含量分別為: 0.153±0.021 mg/mL、0.015±0.003 mg/mL和0.021±0.005 mg/mL; 雌性分別為0.156±0.019 mg/mL、0.012±0.001 mg/mL和0.028±0.001 mg/mL。結(jié)論 運用Protein A親和層析法成功分離純化裸鼴鼠血清Ig，并測定了血清中三種Ig含量。

裸鼴鼠; 免疫球蛋白(Ig); 分離純化; 含量

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是指具有抗體活性或者無抗體活性而在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似的球蛋白，存在于動物的血液、組織液及外分泌液中。Ig在動物的免疫和生理調(diào)節(jié)過程中有著重要的作用。當(dāng)機(jī)體收到病原微生物或毒素入侵時，Ig能夠與相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合、激活補(bǔ)體、結(jié)合細(xì)胞并產(chǎn)生多種生物學(xué)表達(dá)、通過胎盤傳遞免疫力等, 進(jìn)而避免外源物對機(jī)體造成的損傷[1]。裸鼴鼠是一種常年生活在地下的嚙齒類動物, 多分布于非洲肯尼亞、埃塞俄比亞等地。Jarvis教授于1967年首次將裸鼴鼠引進(jìn)實驗室進(jìn)行封閉飼養(yǎng)，并將其用于科學(xué)研究[2]。近半個世紀(jì)以來，國內(nèi)外專家學(xué)者針對裸鼴鼠開展了一系列的研究，這些研究多集中于抗腫瘤、長壽、耐低氧、耐疼痛等方面，對其免疫系統(tǒng)的研究報道甚少[3-13]。本中心自2011年由非洲引入裸鼴鼠后，對其開展了大量的研究工作，為我國學(xué)者進(jìn)行裸鼴鼠的各種研究工作提供了動物資源及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)等便利條件[14-19]。

本文選用Protein A親和層析法分離純化裸鼴鼠血清中Ig并測定其分子量，同時采用ELISA法檢測成年裸鼴鼠血清中三種Ig的含量[20]，為進(jìn)行裸鼴鼠體液免疫的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

12～16月齡普通級裸鼴鼠30只，雌雄各半，均由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[SCXK(滬)-2012-0003]繁殖，飼養(yǎng)于模擬其野外生存環(huán)境的普通級屏障設(shè)施內(nèi)。

1.2 主要試劑與儀器

主要儀器：高速低溫離心機(jī)(22R Centifuge，Beckman，美國)、電泳儀(PowerPacTM, Bio-rad，美國)、KODAK凝膠成像分析系統(tǒng)(Gel Logic 4000PRO，Carestream Health，加拿大)、洗板機(jī)(ELX50, BioTek, 美國)、酶標(biāo)儀(Eon, Biotech, 美國);主要試劑：預(yù)染蛋白Marker購自于美國Thermo公司，IgA(E99-103)、IgM(E99-101)、IgG(E99-131)ELISA檢測試劑盒均購自美國Bethyl公司; Protein A柱(732-4201)購自美國Bio-rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清樣本的收集 眼眶靜脈采血, 37 ℃靜置1～2 h，8 000 r/min離心10～20 min，收集上清即為血清。血清樣品-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Ig的分離純化 配制平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl, pH8.0)和洗脫緩沖液(0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液, pH3.0)。ddH2O 5CV(Protein A柱的體積)洗掉柱內(nèi)20%乙醇, 控制流速為1 mL/min; 平衡緩沖液5CV(柱體積)平衡柱子, 控制流速為1 mL/min; 平衡緩沖液稀釋血清樣品后上樣, 控制流速為1 mL/min,收集濾過液; 平衡緩沖液2CV洗滌柱子，控制流速為1 mL/min; 洗脫緩沖液2CV洗脫蛋白，控制流速為1 mL/min，收集蛋白樣4管，每管預(yù)先加入150 μL的1 mol/L Tris堿。收集每一步獲得的濾液或蛋白樣品, 加入4×上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)，100 ℃加熱10～15 min使蛋白變性。使用SDSPAGE膠試劑盒配制濃度為10%的分離膠和濃縮膠，膠凝后上樣。所用蛋白Marker標(biāo)準(zhǔn)分子量為10 000、15 000、25 000、35 000、45 000、55 000、70 000、100 000、130 000、170 000。90 V恒壓條件下電泳30 min，使蛋白樣品被壓縮;調(diào)整電壓至120 V繼續(xù)電泳, 使蛋白樣品分離, 待溴酚藍(lán)染料到達(dá)膠底部停止電泳。電泳后考馬斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE膠30～60 min, 脫色液(甲醇∶ 水∶乙酸=5∶4∶1)洗脫染料, 待脫色至本底清晰后拍照, 分析步驟中哪步獲得的為分離純化后的Ig。1.3.3 Ig分子量測定 收集分離純化后得到的Ig樣品，加入4×上樣緩沖液，100℃加熱10～15 min使蛋白變性。配制SDS-PAGE膠，其中分離膠濃度為12% (丙烯酰胺的總質(zhì)量與膠總體積的質(zhì)量體積比)，蛋白變性后上樣。SDS-PAGE膠電泳過程同上一步。待SDS-PAGE膠脫色至本底清晰后拍照，分析蛋白變性后所得到蛋白的分子量分布情況，確定裸鼴鼠Ig重鏈和輕鏈的分子量。

1.3.4 IgG、IgA、IgM含量檢測 按照試劑盒說明書操作，標(biāo)準(zhǔn)樣品及待測血清稀釋后分別加100 μL到96孔檢測板中，室溫孵育1 h后洗板，再加入100 μL的檢測抗體，室溫孵育1h后洗板，再加入100 μL 辣根過氧化物酶 (HRP)溶液A，室溫孵育30 min后洗板，再加入100 μL TMB顯色液，避光室溫孵育30 min，加入100 μL終止液終止反應(yīng)，在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序檢測各孔的吸光度值。采用ELISA Calc軟件由標(biāo)準(zhǔn)樣檢測結(jié)果擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后并計算待測樣品中IgG、IgA、IgM的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ig分離純化

采用Protein A親和層析柱對裸鼴鼠血清進(jìn)行分離純化后, SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示。血清稀釋液過柱后得到的濾液、平衡緩沖液洗滌親和層析柱后得到的濾液均存在較多的蛋白帶，相較于裸鼴鼠血清, 只是去除了部分蛋白; 第一次洗脫液中蛋白量很少, 后三次洗脫液中蛋白帶多集中于兩處，則后三次洗脫液收集的即為純化后的免疫球蛋白。

2.2 Ig分子量的確定

免疫球蛋白在變性過程中被β-巰基乙醇還原，降解為重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈) 2個亞單位，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳，電泳結(jié)果如圖2所示。親和層析純化后的免疫球蛋白圖譜均可見分子量約為55 000和25 000的兩條主要蛋白帶，他們分別代表裸鼴鼠血清Ig的H鏈和L鏈，除了H鏈和L鏈外，還存在少量的蛋白條帶。

2.3 血清中IgG、IgA、IgM含量的檢測

用ELISA試劑盒檢測不同性別成年裸鼴鼠血清中3種Ig含量(表1)，結(jié)果表明雄性和雌性裸鼴鼠血清Ig含量無明顯差異(均P＞0.05)。

圖1 SDS-PAGE電泳結(jié)果圖

圖2 SDS-PAGE電泳結(jié)果圖

表1 裸鼴鼠血清中Ig含量測定值 g/L

3 討論

野外生活的裸鼴鼠終年生活于地下洞穴，洞穴環(huán)境陰暗潮濕且通風(fēng)不良，各種微生物病原菌滋生，盡管生活于這樣不利的環(huán)境中，裸鼴鼠的壽命可長達(dá)20～30年。此外有研究表明，裸鼴鼠細(xì)胞對多種有害物質(zhì)具有很好的抗性[5,21]。推測這可能與其免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能相關(guān)。

根據(jù)種系和個體免疫系統(tǒng)的進(jìn)化、發(fā)育和免疫效應(yīng)機(jī)制和作用特征，通常把免疫分為固有免疫和適應(yīng)性免疫兩種類型。適應(yīng)性免疫是機(jī)體獲得性、抗原特異性、抗病原微生物感染的高效防御機(jī)制。根據(jù)其參與成分和功能，適應(yīng)性免疫應(yīng)答可分為兩種類型: 體液免疫和細(xì)胞免疫[22]。體液免疫即以B細(xì)胞產(chǎn)生抗體來達(dá)到保護(hù)目的的免疫機(jī)制。體液免疫的關(guān)鍵在于產(chǎn)生高效而短命的漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞分泌抗體清除抗原。因此，Ig的分離純化是研究體液免疫的基礎(chǔ)手段，而其含量的檢測將為體液免疫的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

Ig分子量很大, 結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 但其單體結(jié)構(gòu)非常類似，由兩種不同的多肽鏈組成。Ig單體由兩條相同的分子量較小的輕鏈和兩條相同的分子量較大的重鏈組成，重鏈和輕鏈由二硫鍵連接形成一個四肽鏈分子, 其構(gòu)象與英語大寫字母Y形狀類似。分離純化后的裸鼴鼠Ig經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明:裸鼴鼠的Ig分子量重鏈為55 000, 輕鏈為25 000, 推算可知裸鼴鼠Ig的單體分子量為160 000。裸鼴鼠Ig具體結(jié)構(gòu)的證實以及基因的克隆都還有待于進(jìn)一步研究。

血清Ig的測定是檢查體液免疫功能最常用的方法。由于病原體可能在身體的各個部位出現(xiàn)，那么Ig也必須存在于各個部位以對抗病原體。IgG在血液和組織液的含量很高，IgM主要存在于血液中，黏膜表面主要的免疫球蛋白是IgA，目前還沒有發(fā)現(xiàn)由IgD和IgE缺陷所致疾病，所以通常檢測IgG、IgM、IgA，這三類Ig就可以代表血清Ig的水平[23]。在本實驗中，采用ELISA檢測法檢測成年裸鼴鼠血清中IgG、IgM、IgA的含量，結(jié)果顯示成年裸鼴鼠血清中IgG的含量性別間沒有差異。有報道[24]，成年BALB/c鼠血清中IgG的含量約為5.5 g/L，IgA的含量約為0.27 g/L，IgM的含量約為0.74 g/L。對比BALB/c小鼠可知，裸鼴鼠血清中Ig含量低。鑒于裸鼴鼠對多種有害物質(zhì)的抗性，推測在受到抗原刺激時，裸鼴鼠或許能夠快速產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答, 分泌大量的抗體，進(jìn)而清除抗原，保護(hù)機(jī)體免受損傷，這一推測有待進(jìn)一步驗證。

本實驗首次用親和柱層析分離純化裸鼴鼠血清中的Ig，建立了一種裸鼴鼠血清Ig分離純化的方法，并對其分子量及含量進(jìn)行了測定，為進(jìn)行裸鼴鼠體液免疫的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Q95-33

B

1674-5817(2017)05-0414-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.014

2017-03-18

國家科技支撐計劃(2015BAI09B02)與上海市科委基金(15140900200、16140900100、17140900200)聯(lián)合資助

程繼帥(1991-), 女, 碩士生, 研究方向: 實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化及人類疾病動物模型研究。E-mail: handsome_91@163.com

共同第一作者: 袁征(1972-), 男, 研究方向: 實驗動物資源開發(fā)。E-mail: 1390115025@126.com

崔淑芳, 教授, 研究方向: 實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化及人類疾病動物模型研究。E-mail: youngstar_sf@163.com