應用無約束全身體積描記系統(tǒng)檢測小鼠肺功能

趙 瑋, 俞 冰, 張水娟, 賈永良, 謝強敏

(1. 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院, 浙江省中醫(yī)院, 杭州 310006;2. 浙江中醫(yī)藥大學藥學院, 杭州 310053; 3. 浙江大學呼吸藥物研究實驗室, 杭州 310058)

應用無約束全身體積描記系統(tǒng)檢測小鼠肺功能

趙 瑋1, 俞 冰2, 張水娟2, 賈永良3, 謝強敏3

(1. 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院, 浙江省中醫(yī)院, 杭州 310006;2. 浙江中醫(yī)藥大學藥學院, 杭州 310053; 3. 浙江大學呼吸藥物研究實驗室, 杭州 310058)

目的 建立Buxco無創(chuàng)肺功能儀檢測小鼠哮喘模型肺功能的方法。方法 雌性ICR小鼠20只隨機分為正常對照組和哮喘模型組，用卵白蛋白(OVA)氫氧化鋁凝膠皮下多點注射加腹腔注射致敏小鼠和反復吸入抗原攻擊建立哮喘模型。用乙酰甲膽堿(Mch)梯度濃度霧化吸入激發(fā)支氣管收縮反應，Buxco無創(chuàng)肺功能儀檢測和記錄激發(fā)過程中呼吸常規(guī)指標和氣道阻力參數(shù)-增強呼吸間歇(Penh)的變化。結果 與對照組比較，哮喘模型組小鼠隨Mch激發(fā)的霧化吸入濃度增大呼吸頻率(F)逐漸減慢、吸氣時間(Ti)和呼氣時間(Te)逐漸延長、Penh值顯著增加。結論 Buxco無創(chuàng)肺功能儀檢測Mch誘導的小鼠哮喘模型氣道高反應性(AHR)呈現(xiàn)出良好的量效關系，是一個測定氣道高反應的良好工具。

小鼠; 肺功能; 哮喘; 氣道高反應性(AHR); 無創(chuàng)肺功能儀; 無約束全身體積描記

氣道高反應性(airway hyperresponsiveness,AHR)、氣道炎癥和可逆的氣道阻塞是支氣管哮喘的特征[1]。AHR的發(fā)生與神經(jīng)源性異常和氣道炎癥有關[2]。動物模型開發(fā)在研究AHR發(fā)生與發(fā)病機制方面提供了一個方法，那些不合適或不可能在患者身上執(zhí)行的防治氣道炎癥和AHR的方法和受試藥物可以通過這些動物模型來實現(xiàn)[3,4]。

目前雖然已有電刺激離體氣管平滑肌收縮性，或通過靜脈注射乙酰甲膽堿(Mch)或5-羥色胺誘導支氣管收縮測定肺阻力和肺順應性、或測量氣道峰值開啟壓力等三種不同的測量小鼠氣道功能改變的方法[5]，但這些方法有其局限性，如整體試驗中麻醉藥物的影響，麻醉深淺和麻醉藥物對AHR的神經(jīng)源和氣道炎癥的影響，實驗人員手術操作技術上的要求和耗時，麻醉或手術后動物存活困難不能長期跟蹤研究等因素。無約束全身體積描記法(whole-body plethysmograph, WBP)可以對清醒自由活動的小動物進行肺功能及氣道反應相關的測試，避免了創(chuàng)傷性氣管切開術及麻醉的影響，使實驗過程簡便快捷，并適合長期跟蹤研究[6]。本研究采用本實驗室傳統(tǒng)方法，使用卵白蛋白(OVA)加佐劑氫氧化鋁凝膠皮下注射致敏小鼠和反復吸入抗原攻擊建立哮喘模型[7]。用Mch梯度濃度霧化吸入激發(fā)支氣管收縮反應，WBP系統(tǒng)(Buxco?）檢測和記錄激發(fā)過程中呼吸常規(guī)指標和氣道阻力的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級5周齡雌性ICR小鼠，體質量18～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2012-0002]，飼養(yǎng)于浙江大學實驗動物中心SPF級動物設施[SYXK(浙)2012-0178]，明暗各12 h，喂養(yǎng)常規(guī)飼料和高溫高壓滅菌水。

1.2 儀器

無約束全身體積描記系統(tǒng)(Non-invasive whole-body plethysmograph system, WBPs)，購自美國Buxco Electronics, Inc. Troy, NY。系統(tǒng)包括: 全身體積描記器，相應數(shù)量的傳感器，偏流儀(每臺可供4只體描箱)，霧化給藥系統(tǒng)(每臺可同時向8只體描箱給藥)，主控儀及安裝在其插槽內(nèi)的前置放大器和USB數(shù)模轉換器，分析軟件(FinePointe，Buxco原裝工作軟件，版本號: 2.3.1.0)，及相關配件。帶有溫度和濕度探頭的傳感器，對實驗時體描箱內(nèi)的溫度濕度進行精確測定，可大為提高潮氣量等參數(shù)的精度。其特點為無須手術，動物清醒無約束，處于自然活動狀態(tài)；實驗結束后動物存活，是長期跟蹤研究的理想實驗方式; 可對多只動物同時測試，是進行篩選實驗的最佳選擇; 呼吸速率、潮氣量、呼氣峰值、吸氣峰值以及代表氣道阻力的參數(shù)-增強呼吸間歇(Penh)與經(jīng)典肺功能測試結果具有高度相關性。Pari Boy N霧化器: 購自德國百瑞有限公司，霧化粒徑平均中位直徑(MMD) 3.5 μm,68%粒徑＜5μm。

1.3 藥品

OVA(V級，美國Sigma公司，A5503-25G，批號: 076K7045)。Mch (美國Sigma公司，批號:MKBS3120V)。質量分數(shù)1%氫氧化鋁凝膠: 自行制備。將OVA溶解到質量分數(shù)1%的氫氧化鋁凝膠中，配成1g/L的OVA氫氧化鋁凝膠溶液。

1.4 建立小鼠哮喘模型

20只小鼠隨機分為2組，哮喘模型組小鼠注射1 g/L的OVA氫氧化鋁凝膠溶液，兩后腳掌、后腹股溝各注射0.025 mL; 頸部注射0.1 mL; 背部注射0.1 mL; 腹腔注射0.2 mL。首次注射后14日，腹腔注射相同濃度的OVA氫氧化鋁膠溶液0.2 mL加強致敏。第21日開始抗原攻擊，將致敏小鼠放置于密閉的有機玻璃盒內(nèi)，用Pari Boy N霧化器霧化吸入10 g/L OVA生理鹽水溶液30 min, 隔日1次，連續(xù)4周。正常對照組小鼠致敏和抗原攻擊與模型組相同，以注射無菌生理鹽水代替OVA和氫氧化鋁膠溶液。在小鼠12周齡時測定肺功能。

1.5 無創(chuàng)肺功能檢測

連接好WBPs (圖 1)后，進行呼吸校準，校準過程中通過對密閉腔體內(nèi)注入一定量的氣體，對流量和壓力進行校準。校準通過后，將4只清醒狀態(tài)小鼠分別放進4個體描箱中，密閉，打開氧氣閥，小鼠自主活動適應5 min。在此期間，打開電腦軟件Finepointe，選擇所需要的測定程序并創(chuàng)建文件夾、設置好程序中各步驟時間、測量參數(shù)、所需藥物劑量等參數(shù)，并設置實驗分組、組內(nèi)編號。待小鼠適應期結束后開始記錄小鼠呼吸的基礎值，包括呼吸頻率(F)、潮氣量(TV)、分鐘通氣量(MV)、吸氣時間(Ti)、呼氣時間(Te)、吸氣峰流速(PIF)、呼氣峰流速(PEF)、呼吸中斷(Tb)、呼氣松弛時間(Tr, 即呼氣相描記箱內(nèi)壓力衰減為最大壓力的36%所用時間)、中期流速(EF50,呼氣量達50%的流速)、呼吸間歇(Pause)和Penh，記錄時間為3 min。FinePointe間隔2 s自動選取波形讀出數(shù)據(jù)，實驗結束后，可直接導出3min內(nèi)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計值。

圖1 無約束全身體積描記系統(tǒng)Figure 1 Non-invasive whole-body plethysmograph system

1.6 支氣管激發(fā)試驗(BPT)

基礎值測定完成后, 將配置成不同濃度的Mch溶液(0 g/L、0.78 g/L、1.56 g/L、3.125 g/L、6.25g/L、12.5 g/L、25 g/L)由低到高霧化吸入，時間為2min，反應、記錄時間為3 min，恢復時間為1min。

1.7 統(tǒng)計學處理

Pause是一個計算值，Pause =(Te - Tr)/Tr; 代表氣道阻力的Penh也是一個計算值，Penh = Pause×(PEF/PIF)，具體測量和計算見圖 2[5]。結果以(x- ± s)表示，用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析。同組小鼠BPT前后呼吸數(shù)據(jù)的比較采用配對t檢驗分析，而模型組和正常組小鼠之間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BPT前后小鼠肺功能各測量值的變化

在應用Mch進行支氣管激發(fā)試驗的過程中, 隨著Mch濃度的增加, 正常對照組和模型組小鼠均逐漸出現(xiàn)張口呼吸、呼吸變慢、幅度加深、出現(xiàn)腹式呼吸等, 呼吸波形隨之改變, 模型組小鼠呼吸波變化更為明顯(圖 3)。激發(fā)試驗后(圖4), 模型組小鼠的肺功能測定值中Penh、EF50、TV、Pause值較正常對照組小鼠有明顯上升(P＜0.05), 其他數(shù)值無明顯變化。正常對照組小鼠用Mch進行激發(fā)前后比較, Penh、EF50、Pause和PEF值明顯升高(P＜0.05或P＜0.01), Tr值則明顯降低(P＜0.05)，其余肺功能測定值均無明顯變化。而哮喘模型組小鼠除MV、PIF無明顯變化外, 其余肺功能測定值均有顯著變化,其中Penh、EF50、TV、Pause、PEF、Te和Ti值明顯升高(P＜0.05或P＜0.01), F、Tr和Tb值明顯降低(P＜0.01)。

圖2 無約束全身體積描記系統(tǒng)的數(shù)據(jù)測量和計算方法Figure 2 Methods of data measurement and calculation from non-invasive whole-body plethysmograph system

2.2 小鼠氣道反應性的變化

由圖5可見，正常對照組和哮喘模型組小鼠氣道Penh值都呈逐步升高的趨勢，但哮喘模型組小鼠的氣道Penh值升高的幅度高于正常組小鼠，在Mch 6.25 g/L、12.5 g/L、25 g/L時的Penh值較正常組明顯增高(P＜0.01或P＜0.001)。

3 討論

圖3 支氣管激發(fā)試驗前后呼吸波形的變化Figure 3 The changes of respiratory waveform before and after bronchial provocation test

研究動物呼吸功能測定方法已有較長歷史。在早期的小動物肺功能測定中，通常采用呼吸流量換能器和生物信號采集系統(tǒng)相連，通過氣道內(nèi)氣流流速、潮氣量和跨肺壓計算得出動物的氣道阻力和肺順應性[8,9]。雖然采用此方法能準確測定出動物的氣道阻力和肺順應性，但是無法測定Ti、Te、PIF、PEF等參數(shù)，且此系統(tǒng)操作難度較大，不利于推廣使用。而Buxco公司和FlexiVent公司分別研發(fā)的無創(chuàng)小動物肺功能測定系統(tǒng)，可在非麻醉無創(chuàng)（清醒）條件下測定動物肺功能，所測得的肺功能參數(shù)Penh基本相似于麻醉有創(chuàng)條件下測得的氣道阻力。有創(chuàng)肺功能檢測需在麻醉、氣管插管的動物身上進行，系統(tǒng)能檢測標準和最大壓力-容積曲線，以得出相應的參數(shù)，如肺活量、肺順應性和肺阻力，此方法靈敏、具有特異性，但也存在眾所周知的缺點，即容易導致動物的死亡，尤其不利于動物的跟蹤研究。無創(chuàng)肺功能測定方法是將清醒動物放在體積描記盒內(nèi)，通過肺功能儀實時監(jiān)測多種指標, 包括F、TV、PEF、Penh等，對動物無損傷，可多次檢測。無創(chuàng)肺功能儀自應用以來，面臨著一些爭議，有學者認為無約束體積描記法在敏感性上不如有創(chuàng)肺功能檢測系統(tǒng)，其呼吸波形和Penh值受環(huán)境因素影響較大，尤其是描記箱內(nèi)溫濕度的變化，會對實驗結果產(chǎn)生較大的影響[10-15]。雖然存在爭議，但還是得到了多數(shù)人的認可，目前廣泛應用于哮喘模型AHR的測定[16-18]。

圖4 支氣管激發(fā)試驗前后肺功能指標的變化Figure 4 The changes of respiratory parameters before and after bronchial provocation test (BPT)

圖5 乙酰甲膽堿誘導小鼠哮喘模型AHR中Penh值的變化Figure 5 The changes of airway resistance (Penh) in methacholine-induced airway hyperresponsiveness in the asthmatic model of mice

Penh是一個無單位的計算值，反映氣道阻力的大小。統(tǒng)計Penh變化百分比的計算方法為：(Mch激發(fā)的Penh值 - NS激發(fā)的Penh值)/ NS激發(fā)的Penh值×100%。本研究通過應用Mch進行激發(fā)實驗后測得的參數(shù)表明, Penh、EF50、TV、Pause與正常組比較有差異，其中Penh值變化尤其明顯，隨著Mch濃度的升高，小鼠氣道反應性逐步升高，Penh值也隨之逐步增高，與小鼠哮喘模型AHR呈現(xiàn)出良好的量效關系，是一個測定AHR的良好指標。本研究得到的Penh變化結果也同文獻報道一致[11,19,20]。

根據(jù)作者對儀器的使用體會，在檢測中需注意以下問題: 在每次測試前均需進行機器的呼吸定標，保證機器的良好狀態(tài)。實驗室應保持安靜，小鼠放入描記箱后要給予足夠的適應時間，消除由于小鼠恐慌、煩躁帶來的呼吸變化，而且在檢測過程中盡量減少實驗人員的走動，降低對小鼠的影響。其主要原因在于無創(chuàng)肺功能的指標是在完全清醒的動物中測量的，動物運動會引起波形基線的波動,影響實驗結果。雖然無創(chuàng)肺功能儀新設計的防噪系統(tǒng)和計算機軟件可以過濾部分干擾，但還是要創(chuàng)造安靜的檢測環(huán)境，以減少參數(shù)的波動。在進行Mch激發(fā)支氣管高反應性的過程中，需要注意Mch的起始濃度，動物的品系不同其氣道反應性不盡相同，盡量選擇較低的濃度開始。在正式試驗前，應該進行預試驗。此外，每次實驗完成后，用生理鹽水霧化來清洗霧化裝置，消除霧化裝置中的藥物殘留，并清潔描記箱內(nèi)部，消除殘留藥物后再進行下一只動物的實驗。

綜上所述，無創(chuàng)肺功能檢測儀使用方便有效，可以持續(xù)檢測，觀察動態(tài)變化過程; 可應用于大規(guī)模的動物實驗和藥物篩選，尤其適合檢測需要跟蹤研究的慢性肺部疾病模型動物的肺功能變化。本研究表明，Penh值在檢測Mch誘導的小鼠哮喘模型高反應性時呈良好的量效關系，是一個可以很好地反映AHR的動物肺功能指標。

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Measurement of Lung Function by Using Non-invasive Whole-body Plethysmograph System in Mice

ZHAO Wei1, YU Bing2, ZHANG Shui-juan2, JIA Yong-liang3, XIE Qiang-min3
(1. Zhejiang Provincial Hospital of TCM, Hangzhou 310006, China;2. College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;3. Zhejiang Respiratory Drugs Research Laboratory, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

ObjectiveTo establish a method for testing pulmonary function by Buxco’s non-invasive whole-body plethysmography (WBP) in mice.MethodsTwenty female ICR mice were randomly divided into control group and asthmatic model group. Each mouse in model group was subcutaneously injected (multisites) and intraperitoneally injected (one site) with ovalbumin (OVA) which was dissolved in aluminium hydroxide adjuvant. OVA-sensitized mice were challenged by inhalation of antigen. For bronchial provocation test, various concentration of methacholine (Mch) aerosolized by a jet nebulizer.Respiration parameters and lung resistance, showed as the value of enhanced pause (Penh) were measured by the WBP before and after Mch challenge.ResultsCompared with control group,bronchial challenge of Mch dose-dependently induced significant deceleration of frequency of breathing(F) and increases of inspiration time (Ti), expiration time (Te) and the value of Penh in OVA-sensitized mice.ConclusionsThe results proved that the WBP of pulmonary function presented a dose-dependent on testing Mch-challenged airway hyperresponsiveness (AHR) in mice. It may be a potential testing method for AHR.

Mice; Pulmonary function; Asthma; Airway hyperresponsiveness;Non-invasive lung function detector; Whole-body plethysmography

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0383-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.008

2017-04-20

浙江省公益性技術應用研究計劃(實驗動物)項目(No.2015C37087)

趙 瑋(1977-), 女, 碩士, 研究方向: 抗炎免疫藥理學。E-mail: 13216701316@163.com

張水娟(1980-), 女, 博士, 實驗師, 研究方向: 抗炎免疫藥理學。E-mail: zsj@zcmu.edu.cn