鈣離子、鋁離子及過氧化氫處理對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架影響的初步研究

馮振月，劉德福，崔玉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319，2.黑龍江省農(nóng)科院大慶分院）

鈣離子、鋁離子及過氧化氫處理對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架影響的初步研究

馮振月1，劉德福2，崔玉東1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319，2.黑龍江省農(nóng)科院大慶分院）

為了解植物細(xì)胞骨架在離子應(yīng)激及氧化損傷時細(xì)胞骨架變化情況，以洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料，使用0.05、0.1、0.15 mol·L-1CaCl2處理洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞 2 h；0.01、0.025、0.05 mol·L-1AlCl3處理 10 min；0.01、0.025、0.05 mol·L-1H2O2處理 2 h，觀察這三種因素處理后洋蔥細(xì)胞骨架變化情況。結(jié)果表明：隨著鈣離子濃度的升高，洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)骨架解聚，細(xì)胞核消失；鋁離子濃度越高，細(xì)胞質(zhì)骨架越少，受損越嚴(yán)重，并出現(xiàn)邊極化現(xiàn)象；隨過氧化氫濃度升高，細(xì)胞骨架解聚，低濃度的過氧化氫即可造成細(xì)胞骨架破壞。

鈣離子；鋁離子；過氧化氫；洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞；細(xì)胞骨架

細(xì)胞骨架（cell skeleton）是指真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)架體系，包括微管、微絲和中間絲等[1]。分為細(xì)胞質(zhì)骨架和細(xì)胞核骨架兩大類[2]。細(xì)胞骨架不僅在維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性中起著重要作用，還與物質(zhì)輸運(yùn)、細(xì)胞運(yùn)動、信息傳遞、能量轉(zhuǎn)化、細(xì)胞分裂和分化、細(xì)胞的凋亡和癌變等生命活動相互聯(lián)系[3-5]。植物的許多生理過程如極性生長、葉綠體運(yùn)動、保衛(wèi)細(xì)胞分化、卷須彎曲等都有細(xì)胞骨架的參與[6]。

細(xì)胞骨架的骨架纖維結(jié)構(gòu)是由不同的蛋白質(zhì)亞單位以特定的方式聚合形成的。三種細(xì)胞骨架成分在細(xì)胞內(nèi)始終處于動態(tài)裝配狀態(tài)，正是因?yàn)檫@種獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，決定了它對外界的離子作用異常敏感，而且細(xì)胞骨架有其特有的理化性質(zhì)，一些能使蛋白質(zhì)變性的化學(xué)試劑（如秋水仙素、SDS）及物理因素如離子濃度、pH值、溫度、紫外線和微重力等都可以使其發(fā)生變化。

以洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料，從形態(tài)上對洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞骨架在不同的離子濃度應(yīng)激下對細(xì)胞骨架的影響進(jìn)行了研究，并對這些影響因素進(jìn)行了分析，從形態(tài)學(xué)上分析不同離子條件下細(xì)胞骨架的變化，主要意義在于評估植物生長過程中，施肥和環(huán)境污染中的離子對其骨架的影響。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮洋蔥鱗莖內(nèi)表皮

1.2 試驗(yàn)試劑

M 緩沖液；1%Triton X-100，3% 戊二醛，0.2%考馬斯亮藍(lán) R250 染液，0.01 mol·L-1PBS（pH 6.8）；氯化鈣；氯化鋁；過氧化氫[7]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鈣離子處理

處理：以PBS做對照，分別加入 0.05、0.1、0.15 mol·L-1CaCl2溶液處理洋蔥鱗莖內(nèi)表皮2 h；抽提：吸去PBS或CaCl2溶液，加1%Triton X-100去垢劑溶液2 mL，使液體充分浸泡材料，室溫中處理25 min，M-緩沖液洗三次，每次5 min；固定：3%戊二醛固定30 min，倒去戊二醛，PBS洗三次，每次5 min；染色：吸去PBS緩沖液，滴幾滴0.2%考馬斯亮蘭R250染料，染色1 h；觀察：多功能顯微鏡20～400倍鏡下拍攝細(xì)胞骨架照片，用以分析。

1.3.2 鋁離子處理

（1）將AlCl3取代PBS做前期處理（以PBS做對照）：將洋蔥鱗莖內(nèi)表皮分別置于0.001 mol·L-1AlCl3，0.002 mol·L-1AlCl3，0.004 mol·L-1AlCl3溶液中浸泡10 min。

（2）抽提與觀察同1.3.1鈣離子處理。

1.3.3 過氧化氫（H2O2）處理

將H2O2取代PBS做前期處理（以PBS做對照）：將洋蔥鱗莖內(nèi)表皮分別置于0.01、0.02、0.04 mol·L-1H2O2處理2 h。抽提與觀察同1.3.1鈣離子處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+對洋蔥細(xì)胞骨架的影響

對照組經(jīng)PBS溶液處理的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架保持一種聚合狀態(tài)且大量的分布在細(xì)胞核周圍，骨架排列緊密（圖1A）；不同濃度的CaCl2溶液處理2 h后細(xì)胞骨架變化明顯：0.05 mol·L-1CaCl2處理洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架與對照組無明顯差異（圖1B）；0.1 mol·L-1CaCl2處理的洋蔥細(xì)胞細(xì)胞核趨邊且大部分由圓形變?yōu)椴灰?guī)則形狀（圖 1C）；0.15 mol·L-1CaCl2濃度處理的細(xì)胞核骨架解聚消失（圖1D）；由此可見，0.05 mol·L-1CaCl2溶液處理的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮幾乎不影響細(xì)胞骨架，而0.1 mol·L-1以上濃度CaCl2會影響細(xì)胞骨架，且濃度越高細(xì)胞骨架變化越明顯，特別是對細(xì)胞核骨架影響較大。

圖1 CaCl2處理對洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞的影響Fig.1 The effect of CaCl2on inner-epidermal cells of onion

2.2 Al3+對洋蔥細(xì)胞骨架的影響

分 別 以 PBS，0.001、0.002、0.004 mol·L-1AlCl3溶液處理洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞10 min，與PBS對照組相比：0.01 mol·L-1AlCl3濃度處理的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞質(zhì)骨架與對照（圖2A）相比出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞核骨架趨邊及變形且部分細(xì)胞核消失（圖2B）；0.02 mol·L-1AlCl3處理的細(xì)胞質(zhì)骨架聚縮且與0.01 mol·L-1AlCl3相比更多的細(xì)胞核消失（圖2C）；0.04 mol·L-1AlCl3濃度處理的細(xì)胞質(zhì)骨架劇烈聚集，幾乎全部的細(xì)胞核消失，細(xì)胞質(zhì)骨架大量解聚，沒有解聚的骨架也聚縮到細(xì)胞中央完全脫離了細(xì)胞膜（圖2D）；由此可見，AlCl3溶液處理的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮僅10 min對細(xì)胞質(zhì)骨架有明顯影響，且對細(xì)胞質(zhì)骨架和細(xì)胞核骨架影響都較大。

圖2 不同濃度AlCl3處理對洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞的影響Fig.2 The effect of AlCl3on inner-epidermal cells of onion

2.3 過氧化氫對細(xì)胞骨架的影響

分別以 PBS，0.01、0.02、0.04 mol·L-1H2O2處理洋蔥鱗莖內(nèi)表皮2 h，與PBS對照相比，0.01 mol·L-1H2O2處理2 h后細(xì)胞核骨架分裂成幾個顆粒狀（圖3B）；0.02 mol·L-1H2O2濃度處理 2 h 的細(xì)胞質(zhì)骨架邊緣部分解聚，造成與細(xì)胞膜的連接斷開（圖3C）；0.04 mol·L-1H2O2濃度處理2 h的細(xì)胞質(zhì)骨架解聚并聚集到細(xì)胞中央（圖3D）。由此可見，H2O2溶液在低濃度時對細(xì)胞核骨架影響劇烈，在高濃度下對細(xì)胞質(zhì)骨架影響大。

圖3 不同濃度H2O2處理對洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞的影響Fig.3 The effect of H2O2on inner-epidermal cells of onion

3 討論

細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)彈性框架結(jié)構(gòu)，對維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、保持細(xì)胞完整性及細(xì)胞功能的完善有著重大的意義，而細(xì)胞骨架本身容易受外界因素影響而發(fā)生變化的，如化學(xué)因素、物理因素都有可能會造成骨架蛋白的變性[7]。

細(xì)胞質(zhì)骨架主要由微管和微絲和中間絲組成，其中微管骨架是由微管蛋白和微管多種相關(guān)蛋白組成，它通過其解聚和聚合的動態(tài)變化完成對細(xì)胞生命活動的調(diào)節(jié)。微管執(zhí)行其正常的功能需要有一個精密有效的骨架調(diào)節(jié)系統(tǒng)。大量的研究結(jié)果表明，充當(dāng)?shù)诙攀沟腃a2+在其中發(fā)揮了作用[8]。微管解聚正常速率為每個微管末端100～400個每秒不等，當(dāng)Ca2+濃度大于1 mmol·L-1時，其解聚速率可增加10倍[9]。在豬腦提取物中，1 μmmol·L-1的 Ca2+即可以激發(fā)ATP 加速微管的聚合，而高濃度（10 mol·L-1）則抑制其聚合。這表明在體外Ca2+通過其濃度的變化對微管骨架進(jìn)行裝配水平的調(diào)節(jié)[10]。

試驗(yàn)雖然沒有深入研究Ca2+對微管影響的分子機(jī)制，但從形態(tài)學(xué)的結(jié)果可以看到Ca2+對細(xì)胞骨架影響嚴(yán)重：0.01 mol·L-1AlCl3處理洋蔥細(xì)胞與PBS相比很多細(xì)胞核消失（圖2C）；0.04 mol·L-1AlCl3濃度處理，幾乎全部的細(xì)胞核消失，細(xì)胞質(zhì)骨架劇烈聚集，沒有解聚的骨架聚縮到細(xì)胞中央完全脫離了細(xì)胞膜。

植物細(xì)胞骨架可能是鋁毒害的細(xì)胞作用部位Ryan、Sasaki[10，11]。鋁毒害有短期反應(yīng)（鋁處理幾分鐘，甚至幾秒鐘即可發(fā)生）和長期反應(yīng)。鋁可通過直接作用于細(xì)胞骨架的元素或間接通過鈣信號系統(tǒng)來改變細(xì)胞骨架系統(tǒng)[8]。Macdonald等研究表明[13]，在細(xì)胞體外Al3+強(qiáng)烈促進(jìn)微管蛋白亞基聚合形成微管，Grabski和Schindler也報道，Al3+會誘導(dǎo)大豆根懸浮細(xì)胞肌動蛋白網(wǎng)硬化[14]。但有研究卻表明，鋁脅迫會導(dǎo)致微管和微絲的解聚。Blancaflor等發(fā)現(xiàn)[15]，3 h的鋁處理就會誘導(dǎo)根的伸長區(qū)微管僵硬性的增加。試驗(yàn)從形態(tài)學(xué)上表明Al3+確實(shí)可以在短時間內(nèi)，低濃度下對洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架造成劇烈影響。

H2O2很容易通過細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞中，外源性H2O2作用引起細(xì)胞內(nèi)Ros升高從而引起細(xì)胞骨架變化[16]。實(shí)驗(yàn)中，H2O2在低濃度時對細(xì)胞核骨架影響劇烈，在高濃度下對細(xì)胞質(zhì)骨架影響大0.01 mol·L-1H2O2處理24 h后。細(xì)胞發(fā)生聚集、邊緣化和區(qū)域化。實(shí)驗(yàn)通過Ca2+，Al3+，H2O2對洋蔥細(xì)胞骨架的影響進(jìn)行了形態(tài)學(xué)初步的研究，使我們對離子應(yīng)激條件下植物細(xì)胞骨架的形態(tài)學(xué)變化有一個初步的了解，為進(jìn)一步對不同應(yīng)激環(huán)境對細(xì)胞骨架影響的分子機(jī)制研究打下了一定的基礎(chǔ)。

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Preliminary Study On the Influence of Ca2+，Al3+and H2O2Treatments for Cytoskeleton from Onion Inner-epidermal Cell

Feng Zhenyue1，Liu Defu2，Cui Yudong1
（1.College of Llife Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences）

The onion was used as the experimental material to understand the change of the plant cytoskeleton in ion stress and ox idative damage.Theinner-epidermal cell of onion was treated with 0.05，0.1，0.15 mol·L-1CaCl2for 2 h，0.01，0.025，0.05 mol·L-1AlCl3for 10 min and 0.01，0.025，0.05 mol·L-1H2O2for 2 h，and then the cytoskeleton of onion was observed after treatment with these three factors.The results showed that with the increase of the concentration of calcium ion that the cytoplasm skeleton depolymerization and nucleus disappear，the higher the concentration of aluminum ions less cytoplasmic skeleton was observed and the more serious damage of cells，side polarization appeared.With the increase of the concentration of H2O2，Cytoskeleton was depolymerized in Cytoplasm and could cause the destruction of the cytoskeleton with low concentration of H2O2.

calcium;aluminum;H2O2;Onion epidermal cells;Cytoskeleton

Q245

A

1002-2090（2017）06-0024-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.007

2016-03-21

大腸桿菌ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)體yddA功能的初步研究（XZR2015-11）。

馮振月（1977-），女，講師，西南大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)從事細(xì)胞生物學(xué)及大腸桿菌基因功能的理論與實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作。

崔玉東，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：1016856109@qq.com。