基于GCBI平臺骨關(guān)節(jié)炎芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

盧云 梁江 邰灣 周靜 黃維琛 徐宇

基于GCBI平臺骨關(guān)節(jié)炎芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

盧云 梁江 邰灣 周靜 黃維琛 徐宇

目的從已知的GCBI公共基因芯片分析平臺著手初步探索骨關(guān)節(jié)炎的機制,尋找該病的關(guān)鍵性靶點基因,為今后的研究和治療指明方向。方法從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Expression Omnibus)選取GCBI平臺支持后期處理分析的人類骨關(guān)節(jié)炎組織全基因組RNA芯片(樣本為OA患者和正常人的滑膜及軟骨組織),下載芯片數(shù)據(jù),利用 GCBI 在線實驗室篩選出骨關(guān)節(jié)炎差異基因,分別對差異基因進行 GO 富集分析、KEGG通路分析以及參與生物功能的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果從符合研究納入條件的5 個基因表達芯片數(shù)據(jù)集最終得到648個差異性基因,查到PRKCA、ITGB3、PLCB1、ADCY4、PIK3R3、 NRAS 、ITPR1等7個功能性蛋白在OA疾病發(fā)展進程中意義重大,PI3K-AKT、MAPK 信號通路、細胞凋亡、粘附相關(guān)通路、Wnt通路、P53通路,VEGF通路共9條通路與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)。結(jié)論利用生物信息學(xué)有助于分析骨關(guān)節(jié)炎基因芯片數(shù)據(jù),探索參與OA進程的核心蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為探索治療靶點和發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

骨關(guān)節(jié)炎; 基因芯片; 生物信息分析; 滑膜; 軟骨

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是以一種常見慢性退行性疾病,可引起受累關(guān)節(jié)疼痛、活動受限并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙,據(jù)我國流行病學(xué)研究報道,中國人大于 40 歲的人群中,OA整體患病率約 46.3%[1],國外研究顯示,OA 患者的全球傷殘調(diào)整生命年在非傳染疾病中位居前十[2],既往觀點認為該病病理特征以關(guān)節(jié)軟骨進行性退變?yōu)橹?包含軟骨細胞凋亡、軟骨下骨重建、骨贅形成),但近年來發(fā)現(xiàn)低水平的炎癥參與了OA的進程(滑膜水腫增生、炎癥因子釋放)[3],因此此前有許多關(guān)于OA的研究聚焦于滑膜或軟骨標本差異性基因研究上,這類基因芯片研究數(shù)據(jù)相當一部分匯集于公共數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Expression Omnibus)上,而國內(nèi)GCBI生物信息分析平臺匯集了GEO在內(nèi)的多個數(shù)據(jù)庫及分析技術(shù)模塊,這為我們提供了綜合該病現(xiàn)有生物信息數(shù)據(jù)、進行病灶與正常組織差異性基因發(fā)掘的有利條件,使探索該病致病基因、信號通路甚至治療靶點的手段更為豐富。本研究利用公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(GEO)中的骨關(guān)節(jié)炎RNA基因芯片數(shù)據(jù),對該病的相關(guān)基因進行挖掘,并進行生物信息學(xué)分析,現(xiàn)報道如下:

1 資料與方法

1.1 資料來源

在GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載OA芯片數(shù)據(jù)。每個數(shù)據(jù)集均需符合以下條件:(1)數(shù)據(jù)集來自全基因組 RNA 表達芯片;(2)因OA病理核心表現(xiàn)與軟骨退變和滑膜炎癥相關(guān),因此選取差異性基因樣本研究來源于滑膜和軟骨,實驗使用人類骨關(guān)節(jié)炎滑膜或軟骨組織與正常滑膜或軟骨組織對照,每組樣本至少不小于3個。(3)GCBI平臺支持已獲取的芯片數(shù)據(jù)進行后期運算分析。

1.2 方法

在GEO下載的原始芯片數(shù)據(jù),導(dǎo)入GCBI(http://www.gcb.com.cn)在線平臺。在該平臺實驗室內(nèi),創(chuàng)建一個分析基因芯片差異基因的實驗方案,平臺自動按設(shè)計的方案為導(dǎo)入的芯片數(shù)據(jù)分組如下,按照GCBI生物信息分析模塊構(gòu)建如圖分析路線圖(圖1),獲得多個研究中正常組織和患者組織的差異基因并取得交集差異基因(若差異基因少于10,則取并集),依次針對差異基因的功能和生物過程進行 Gene Ontology 功能富集分析(GO 分析),信號通路富集分析(KEGG分析)、趨勢分析,String網(wǎng)站(https://string-db.org)上進行差異基因蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(PPI并繪制網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,)以上分析取前20項最顯著的條目,不足20條者羅列全部條目。

2 結(jié)果

2.1 納入芯片匯總資料(共5塊芯片)

圖1 基于GCBI平臺構(gòu)建的模塊分析路線圖

表1

2.2 差異基因

GCBI平臺對上傳的原始芯片數(shù)據(jù),首先進行芯片信號值的預(yù)處理與預(yù)過濾,然后使用差異分析方法 SAM法,依次對所納入的 5套芯片數(shù)據(jù)進行差異基因的篩選?；吮窘M:差異基因的篩選條件為:Q 值 < 0.05,差異倍數(shù)≥1.5倍,其中從GSE55235中獲得差異性基因1804個,表達上調(diào)的基因有884個,下調(diào)的基因920個;從GSE82107中獲得差異性基因1342個,表達上調(diào)的基因有693個,下調(diào)基因649個;從GSE12021中獲得差異性基因1150個,表達上調(diào)的基因有10個,下調(diào)基因1140個;3個差異性基因數(shù)據(jù)集取交集得53個差異基因。軟骨標本組,2塊芯片:差異基因的篩選條件為:Q 值 <0.05,差異倍數(shù)≥1.2倍,因樣本量少,取交集得差異基因較少,僅11個,考慮OA同時有滑膜增生和軟骨退變,為避免遺漏差異性基因,我們將滑膜來源的差異性基因交集(53個)與軟骨來源的差異基因并集(606個)合并,得648個差異基因,進行進一步的生物信息學(xué)分析。

2.3 GO富集分析

取并集后的 648個差異基因,用 GCBI平臺自帶的GO分析模塊分別作生物學(xué)進程和分子功能 GO 富集分析(FDR<0.01),結(jié)果顯示這些基因富集在膠原蛋白生成代謝、血管新生等生物學(xué)進程和細胞外基質(zhì)構(gòu)成、相關(guān)受體結(jié)合、金屬離子、部分細胞因子(生長因子為主)結(jié)合或活化等分子功能上。見表 2。

表2 GO 富集分析生物過程的結(jié)果

表3 GO富集分析分子功能的結(jié)果

續(xù)表3

GO編號注釋基因數(shù)FDR值GO：0048407血小板源生長因子結(jié)合65．46E?07GO：0005102受體的結(jié)合196．03E?06GO：0005178整合素的結(jié)合116．15E?06GO：0004867西林類肽鏈內(nèi)切酶抑制劑的活性111．55E?05GO：0002020蛋白酶綁定91．55E?05GO：0008083生長因子活性141．55E?05GO：0043184血管內(nèi)皮生長因子受體2結(jié)合41．82E?05GO：0042802同源蛋白結(jié)合204．48E?05GO：0005096鳥苷三磷酸酶的激活124．61E?05GO：0070492低聚糖的結(jié)合30．000211125GO：0004222金屬內(nèi)肽酶的活化100．000232253

2.4 通路分析

取并集后的 648 個差異基因,用 GCBI平臺自帶的Pathway分析模塊作通路分析,共獲得富集通路107條,最顯著的20條通路結(jié)果顯示,這些基因顯著富集于細胞外基質(zhì)構(gòu)建、補體系統(tǒng)與凝血、黏著斑以及免疫炎癥相關(guān)的PI3K-Akt 信號通路、MAPK信號通路,與某些特殊感染、癌癥相關(guān)疾病通路也有密切聯(lián)系。(P值<0.05)。在此基礎(chǔ)上對這107條通路做信號通路間功能方面互相作用網(wǎng)絡(luò)分析,得到46條顯著互相作用的信號通路,其中交互作用最顯著9條的核心通路為MAPK 信號通路、細胞凋亡、粘附以及鈣離子相關(guān)通路、Wnt通路、P53通路,VEGF通路,與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān),見表 3。

表4

續(xù)表4

編號注釋基因數(shù)P值5146阿米巴病141．74106E?094270血管平滑肌收縮146．26743E?095200癌癥相關(guān)通路214．83776E?084066HIF?1信號通路111．01875E?064540縫隙連接101．60154E?064726含血清素的神經(jīng)突觸通路112．12086E?064912促性腺激素信號通路102．18308E?064010MAPK信號通路163．86923E?064730抑郁癥相關(guān)85．52384E?065166人類T淋巴細胞細胞性病毒感染165．72222E?065210結(jié)腸直腸癌相關(guān)87．11345E?064380破骨細胞分化111．11713E?055144瘧疾71．46051E?054970唾液分泌91．507E?05

圖2 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖注:圖中每個圓圈代表一個蛋白,連線代表兩個蛋白直接有相互作用關(guān)系。一個蛋白與多個蛋白之間有線相連,代表與多個蛋白有相關(guān)作用關(guān)系,連線代表該蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要

2.5 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

取并集后的 648個差異基因,用 GCBI平臺自帶的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析模塊分析其單一基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò),最終得到88個作用顯著的蛋白,將這些蛋白帶入蛋白分析數(shù)據(jù)平臺STRING(https://string-db.org/)進行蛋白互相作用分析,作圖結(jié)果如圖2可見:其中最核心的蛋白包括PRKCA 、ITGB3 、PLCB1 、ADCY4、PIK3R3、 NRAS 、 ITPR1,這些蛋白與周圍蛋白的關(guān)系數(shù)目均大于10(稱之為度,即圓圈所示某一蛋白的外周連線數(shù)目超過10,表示該蛋白直接聯(lián)系的上下游基因數(shù)目總和)。

3 討論

基于公共基因芯片數(shù)據(jù)庫的挖掘性生物信息分析是目前關(guān)注度較熱的一種預(yù)測性研究方法[4],這種方法可以協(xié)助研究者從自己關(guān)注的領(lǐng)域和角度出發(fā),在前人基因芯片研究數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上探索病理組織與正常組織差異性基因,找到潛在的罪犯基因或信號通路,為接下來的研究方向提供指導(dǎo)依據(jù),但國內(nèi)骨關(guān)節(jié)炎方面的此類研究尚較少報道。

骨關(guān)節(jié)炎的進程中存在滑膜增生水腫以及軟骨退行性變,本研究從GEO數(shù)據(jù)庫下載5套骨關(guān)節(jié)炎RNA基因芯片數(shù)據(jù)(3塊芯片滑膜組織來源研究、2塊芯片來自軟骨標本),利用GCBI生物信息分析平臺進行數(shù)據(jù)挖掘與分析,因滑膜來源芯片數(shù)據(jù)多,而軟骨組織來源芯片數(shù)據(jù)少,為減少遺漏,我們選擇取滑膜來源數(shù)據(jù)芯片交集,軟骨組織來源芯片數(shù)據(jù)取并集,以上二者再取并集得到差異性基因648個,在此基礎(chǔ)上進行差異性基因功能歸類注釋(GO分析)、信號通路富集分析(Pathway分析)以及蛋白之間、信號通路之間的交互作用網(wǎng)絡(luò)分析以求探索導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的核心功能基因和信號通路,研究結(jié)果顯示:相對于正常組織,OA組差異性基因主要表現(xiàn)在膠原蛋白生成代謝、血管新生等生物學(xué)進程和細胞外基質(zhì)構(gòu)成方面,這與骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變、含水率下降,滑膜一定程度上水腫增生的病理表現(xiàn)相符。我們發(fā)掘出差異顯著的基因RGS2、IER3、RAM1、AP-1在后續(xù)的研究文獻溯源查閱中得到了一定的證實,如:RGS2(G蛋白信號調(diào)節(jié)因子2)是一個蛋白編碼基因,既往發(fā)現(xiàn)RGS2與高血壓、焦慮癥及肥胖相關(guān)[5],但近期的研究證實:RGS2可以協(xié)同RGS5,RGS7 RGS10促進軟骨細胞發(fā)育分化,而RGS4可抑制軟骨細胞分化,與NOTCH炎癥通路導(dǎo)致的軟骨退變也有關(guān)聯(lián)[6],而目前這方面的研究報道尚少。而AP-1是明確參與了骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的明星分子,且有報道[7]發(fā)現(xiàn)黃芩素這一中藥單體成分通過在轉(zhuǎn)錄水平上抑制κc-fos和AP-1的活性從而阻斷了滑膜的慢性炎癥,保護了軟骨的降解,其相關(guān)途徑包括MAPK、RET信號等通路。而經(jīng)過pathway分析,這些差異基因顯著富集的MAPK 信號通Wnt通路、VEGF通路、P53通路都是近10年來與骨關(guān)節(jié)炎炎癥發(fā)生、滑膜水腫增生密切相關(guān)的通路,而細胞凋亡、粘附以及鈣離子相關(guān)通路也與軟骨變性、破壞相關(guān)。蛋白交互作用作網(wǎng)絡(luò)分析中我們發(fā)現(xiàn)了88個作用顯著的蛋白,其中(PRKCA、ITGB3、PLCB1、ADCY4、PIK3R3)是最顯著的5個核心蛋白,文獻溯源[8]提示:PRKCA(Protein kinase C alfa,蛋白激酶C-a)參與了細胞粘附、細胞轉(zhuǎn)化、細胞周期和細胞體積變化等多種生物過程,是激活MAPK炎癥信號通路的重要激酶,對OA的炎癥發(fā)生有重要意義。而ITGB3(integrin,beta 3,整合素beta-3)是細胞黏附分子家族的重要成員之一[9],主要介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互黏附,并介導(dǎo)細胞與 ECM 之間的雙向信號傳導(dǎo),參與了血管生成,侵襲轉(zhuǎn)移、炎癥、傷口愈合和凝血等生理和病理過程,在PI3K炎癥相關(guān)通路中扮演重要角色,參與了OA滑膜炎癥的的發(fā)生,目前以整合素為治療靶點的含精-甘-天冬序列的多肽,(Arg-Gly-Asp,RGD)[10]能抑制破骨細胞之間、破骨細胞與基質(zhì)之間的黏附,阻止破骨細胞的增殖、遷移、分化,從而促進骨組織的再生。ADCY4(adenylate cyclase 4,腺苷酸環(huán)化酶4)[11]廣泛分布于哺乳動物的細胞膜中,催化ATP生成cAMP并釋放焦磷酸,對軟骨細胞的能量代謝、老化凋亡有重要意義,這些蛋白在軟骨組織滑膜組織中含量較多,提示了潛在的致病機理和成為治療靶點的可行性,部分研究已經(jīng)進展至相應(yīng)的靶向藥物,為未來臨床治療用藥指出了方向。

本研究尚存在一些缺陷和問題:①GCBI生物信息分析平臺雖然整合了GEO數(shù)據(jù)庫,KEGG數(shù)據(jù)庫,STRINBG數(shù)據(jù)庫及分析平臺的部分資源和功能,較大程度實現(xiàn)了數(shù)據(jù)共享、一次進行多種方法和角度分析,迅速顯示結(jié)果的需求,但并不能完全涵蓋所有數(shù)據(jù),即使是GEO數(shù)據(jù)庫內(nèi)的RNA芯片數(shù)據(jù)也不能全部支持匹配分析,因此納入數(shù)據(jù)有一定局限性。②同一差異性基因存在多個別名,各大網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫難以涵蓋所有別名,為研究帶來困難,③目前國內(nèi)大量的生物信息研究通常是在GEO數(shù)據(jù)庫平臺找到目的芯片數(shù)據(jù)進行找到差異性基因,分別帶入DAVID網(wǎng)站進行GO分析、KEGG網(wǎng)站進行pathway 分析,STRING網(wǎng)站進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)化分析,較少有直接利用國內(nèi)GCBI一站式完成所有數(shù)據(jù)獲取和分析的研究,且更缺乏同一對象同時利用上述多網(wǎng)站平臺分析和GCBI一站式分析的對比分析,以評價哪種研究遺漏數(shù)據(jù)較多、偏倚性如何,這是今后必須關(guān)注的方向。④不同研究的芯片數(shù)據(jù)或因為樣本本身存在個體化差異,或因為芯片設(shè)計(如探針敏感性特異性有差異)導(dǎo)致同一基因在A研究中疾病組表現(xiàn)為表達上調(diào),而在B研究中表現(xiàn)為下調(diào)或差異不明顯,多個研究數(shù)據(jù)差異基因的交集難以確認表達量情況,導(dǎo)致后期篩選出來的差異基因必須進行浩繁的文獻回溯驗證才能使結(jié)論更加嚴謹。⑤生物信息分析畢竟只是對既往研究數(shù)據(jù)的歸納整理,與真實世界的基因表達尚存在距離,尤其現(xiàn)有文獻無報道的情況下,找到的顯著差異性基因可能與發(fā)病本身無關(guān),因此有必要進行進一步的實驗驗證,如再獲取標本進行免疫組化分析或細胞層面上的基因表達量研究。雖然有問題和缺陷,GCBI整合國際上多個權(quán)威基因數(shù)據(jù)庫和分析平臺,構(gòu)建一站式獲取、分析的國內(nèi)生物信息分析平臺的思路是值得肯定的,該平臺的營運技術(shù)人員也擴大支持分析的芯片類型和數(shù)據(jù)資源,積極完善分析計算模塊的功能,提高其分析精度,數(shù)據(jù)資源的局限性、不同類型或格式芯片數(shù)據(jù)的歸一化、多平臺分析的兼容性這些問題是有望得到解決的。而本研究選出的潛在致病信號通路和關(guān)鍵基因經(jīng)現(xiàn)階段文獻查閱驗證大多存在合理性,我們將在接下來的實際標本免疫組化及細胞實驗中進一步驗證這些潛在靶點。

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BioinformaticsanalysisofosteoarthritisgenemicroarraybasedonGCBIdatabase

LUYun,LIANGJiang,TAIWan,ZHOUJing,HUANGWei-chen,XUYu

(GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,MiaoMedicineCollaborativeInnovationCenter,Guiyang,Guizhou,550000)

ObjectiveTo explore the mechanism of osteoarthritis(OA)and search the key genes as new treating target for future research.MethodsGene microarray profiles on osteoarthritis(samples of synovial membranes or cartilage tissues came from osteoarthritis patients and healthy donors)were download from GEO(Database of Gene Expression Omnibus),then different expressed genes were identified through lab data analytics platform named GCBI,then key functions,pathways and Internal relations between these genes were explored through three methods include gene oncology(GO),KEGG pathway and protein-protein interaction analysis(PPI).Results648 different expressed genes were got from 5 gene expression data sets met the inclusion criteria,7 genes(PRKCA、ITGB3、PLCB1、ADCY4、PIK3R3、 NRAS 、ITPR1)may play important roles in OA,9 bio-pathways appeared to be important in OA,including PI3K-AKT signaling pathway、MAPK signaling pathway、cell apoptosis and adhesion pathway,P53 signaling pathway,VEGF pathway.ConclusionBioinformatics analysis may be helpful to research OA gene microarray data and study key proteins and signaling pathways for treating targets or pathogenesis.

Osteoarthritis; Gene microarray; Bioinformatics analysis; Synovial membrane; Cartilage

基金編號:1)貴州省重大基礎(chǔ)研究專項資助項目;項目編號:黔科合J重大字[2015]2002;2)貴州省自然科學(xué)技術(shù)基金資助項目:黔科合J字[2013]2074號,3)國家自然基金(地區(qū)基金):項目批準號 81560817

550000,貴州貴陽,貴陽中醫(yī)學(xué)院 苗族醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心

梁江,E-mail:165372999@qq.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.008

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