補(bǔ)精益視片對(duì)SD大鼠慢性高眼壓模型外側(cè)膝狀體尼氏小體的影響

柯欣怡 李翔 劉紅佶 袁銘悅 李祥玉 李華宏 王泰 田夢(mèng)瑤 楊鳳嬌

補(bǔ)精益視片對(duì)SD大鼠慢性高眼壓模型外側(cè)膝狀體尼氏小體的影響

柯欣怡1,2李翔1劉紅佶3袁銘悅3李祥玉3李華宏3王泰3田夢(mèng)瑤3楊鳳嬌3

目的觀察補(bǔ)精益視片對(duì)慢性高眼壓模型(elevated intraocular pressure EIOP)大鼠外側(cè)膝狀體中尼氏小體(nissl body)含量的影響,探討補(bǔ)精益視片視功能保護(hù)的作用機(jī)理。方法選取30只SD大鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組、給藥組及模型組,每組各10只。采用烙閉鞏膜上靜脈方法制作慢性高眼壓大鼠動(dòng)物模型,每組連續(xù)灌胃8周后處死大鼠,觀察補(bǔ)精益視片對(duì)EIOP大鼠眼壓、外側(cè)膝狀體(lateral geniculate nucleus LGN)尼氏小體含量的影響。結(jié)果相比造模前,從造模即刻開始至造模后8周,給藥組及模型組大鼠的眼壓均有明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);造模后8周與造模即刻相比,給藥組眼壓有降低趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而模型組眼壓無降低趨勢(shì);模型組尼氏小體總面積(55863.31±18427.166 S/μm2)及積分光密度(16084.76±6013.412)較對(duì)照組(114533.71±17849.482 S/μm2,35237.50±4626.313)及給藥組(108020.95±27719.546 S/μm2,31261.33±7800.446)明顯偏低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),給藥組尼氏小體總面積及積分光密度較對(duì)照組稍偏低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論補(bǔ)精益視片能提高慢性EIOP模型大鼠LGN尼氏小體含量,從而發(fā)揮視功能保護(hù)作用。

青光眼; 補(bǔ)精益視片; 視功能保護(hù); 大鼠慢性高眼壓模型; 尼氏小體; 外側(cè)膝狀體

青光眼(glaucoma)是以視神經(jīng)(optic nerve,ON)萎縮及視野損害為共同特征的一類眼病,高眼壓(elevated intraocular pressure,EIOP)為其主要危險(xiǎn)因素。它是目前世界第一位的不可逆性致盲眼病,發(fā)病率和致盲率在世界范圍內(nèi)都呈上升趨勢(shì)[1]。根據(jù)世界各地流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)資料來估算,2020年全球患者將上升至7960萬,雙眼失明人數(shù)也隨之上升為1120萬,病史在16年以上的青光眼患者至少有一只眼盲的概率約為28.6%,而2020年中國(guó)的青光眼患者人數(shù)將達(dá)到600萬[2]。青光眼對(duì)社會(huì)及家庭造成了極大的損失,探索青光眼視功能損害機(jī)制與保護(hù)是非常迫切而具有重大意義的一項(xiàng)課題。

本實(shí)驗(yàn)通過烙閉上鞏膜靜脈的方法[3]誘導(dǎo)產(chǎn)生眼壓維持穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的慢性高眼壓(elevated intraocular pressure EIOP)動(dòng)物模型,選取補(bǔ)精益視片作為干預(yù)藥物,通過觀察其對(duì)EIOP大鼠外側(cè)膝狀體中尼氏小體(nissl body)含量的影響來探討補(bǔ)精益視片視功能保護(hù)的作用機(jī)理,為補(bǔ)精益視片在青光眼治療的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄不受限,8～12周齡,體重約160～200g,并在裂隙燈下檢查見眼前節(jié)無異常,瞳孔對(duì)光反射正常,眼壓測(cè)定正常,無歪頸者共30只。飼養(yǎng)室溫20～25℃,空氣流通,相對(duì)濕度55%～75%,12小時(shí)光照維持,晝夜循環(huán)。自由攝食飲水。

1.1.2分組

以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字,將大鼠分為3組:給藥組、對(duì)照組及模型組,每組各10只。

1.2 藥品與試劑

補(bǔ)精益視片(批號(hào)20130215)購(gòu)于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。FFA固定液,由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1造模方法

選擇烙閉鞏膜上靜脈的方法進(jìn)行造模。模型組與給藥組在眼科手術(shù)顯微鏡下烙閉右眼上鞏膜靜脈進(jìn)行造模處理,對(duì)照組暴露鞏膜上靜脈后未行上鞏膜靜脈熱處理,為假烙閉。均對(duì)其右眼進(jìn)行造模,左眼不做處理。

1.3.2給藥方法

每天在16:00～18:00之間給大鼠進(jìn)行灌胃,連續(xù)灌胃8周.對(duì)照組、模型組每天予3ml生理鹽水灌胃。將補(bǔ)精益視片磨成粉狀,加入生理鹽水,每18g配置成100ml混懸液,濃度為0.18g/ml,給藥組混懸液灌胃1.8g/kg·d。實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)大鼠體重選取混懸液劑量,每只大鼠每天灌胃總量3ml,所需混懸液劑量不足3ml的用生理鹽水補(bǔ)足。每2周稱體重1次,根據(jù)大鼠體重調(diào)整給藥量。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物死亡7只。

1.3.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.3.1眼壓測(cè)量

采用TONO-PEN筆試眼壓計(jì)每日固定時(shí)間進(jìn)行眼壓測(cè)量。分別測(cè)量3組大鼠造模前、造模后即刻、造模后2周、造模后4周、造模后6周、造模后8周右眼的IOP。

1.3.3.2尼氏小體含量的測(cè)定

(1)取材及固定:給藥8周后處死大鼠,方法使用頸椎脫臼法。在顯微鏡下完整剝出大鼠腦組織,將剝下的腦組織置于固定液中固定72小時(shí)后,參照大鼠腦組織解剖圖譜,按大鼠中樞神經(jīng)解剖定位,根據(jù)鄰近核團(tuán)形狀判斷,切取LGN,梯度脫水、透明、浸蠟、包埋,常規(guī)切片4um,烘干備用。

(2)LGN切片Nissl染色(甲苯胺蘭染色法):組織切片甲苯胺蘭染色,低倍鏡下(10倍)定位LGN,20倍物鏡顯微鏡下標(biāo)Nissl小體成分。每只大鼠皆測(cè)定1張膝狀體切片(每張取5個(gè)視野)的Nissl小體含量,用 Mias-2000型圖形圖像分析儀測(cè)量Nissl小體總面積、積分光密度,求取每張切片5個(gè)視野的均值作為該切片的測(cè)量值,表示Nissl小體含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 眼壓

各組大鼠造模前后及組間眼壓比較見表1。由表1可見,造模前比較各組之間IOP,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P>0.05)。造模后即刻,對(duì)照組IOP較造模前略有升高,但前后比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);給藥組、模型組IOP較造模前升高明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);造模后即刻,給藥組、模型組與對(duì)照組IOP相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。造模后8周,給藥組及模型組IOP與造模前相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);造模后8周,與造模后即刻相比,給藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 補(bǔ)精益視片對(duì)慢性EIOP大鼠外側(cè)膝狀體尼氏小體含量的影響

結(jié)果見表2,圖1-3。由表2可見:各組以對(duì)照組尼氏小體總面積和積分光密度最高;給藥組尼氏小體總面積和積分光密度相較對(duì)照組稍有偏低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組尼氏小體總面積和積分光密度相較對(duì)照組及給藥組均明顯偏低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠組間及造模、用藥前后眼壓比較(單位:mmHg)

注：與對(duì)照組相比,▲P<0.01,△P<0.05;與治療組相比,★P<0.01

表2 每組大鼠LNG尼氏小體的比較

注：與對(duì)照組相比,▲P<0.01;與給藥組相比,★P<0.01

圖1 對(duì)照組 LGN 尼氏小體染色(× 200) 圖2 模型組LGN 尼氏小體染色圖(× 200) 圖3 給藥組 LGN 尼氏小體染色圖(× 200)

3 討論

作為目前世界第一位的不可逆性致盲眼病,青光眼的發(fā)病機(jī)制仍在進(jìn)一步研究中。正常視覺的形成主要與視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體(lateral geniculate nucleus,LGN)、視皮質(zhì)有關(guān)。視路中各級(jí)神經(jīng)元對(duì)視功能的維持都有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),青光眼的視功能障礙是從視網(wǎng)膜到中樞視覺系統(tǒng)廣泛區(qū)域發(fā)生損傷的過程,青光眼的神經(jīng)損害包括了整個(gè)視路,青光眼是一種中樞神經(jīng)退行變性疾病[4]。神經(jīng)退行性病變的特征是跨神經(jīng)元變性[5],RGCs的死亡對(duì)LGN、視皮質(zhì)等產(chǎn)生影響,損傷的LGN、視皮質(zhì)等又反過來對(duì)殘存的RGCs產(chǎn)生影響。中樞視覺系統(tǒng)的損害不僅僅作為一種結(jié)果,還在青光眼視功能損傷的進(jìn)展中起了重要作用。故僅僅將將眼壓控制到安全水平并不能完全阻止青光眼的繼續(xù)進(jìn)展[6],青光眼的治療還應(yīng)針對(duì)繼發(fā)性損害對(duì)視功能進(jìn)行保護(hù)。青光眼的視功能保護(hù)已成為青光眼研究的熱點(diǎn)難點(diǎn)問題。作為視路上直接接受視神經(jīng)纖維投射的重要中轉(zhuǎn)核團(tuán),外側(cè)膝狀體在中樞視覺系統(tǒng)損傷研究中倍受關(guān)注。而尼氏小體是神經(jīng)元的功能單位,能夠很敏感地反映神經(jīng)元是否受到損傷,尼氏小體的變化常常用來作為神經(jīng)元受損的標(biāo)志[7]。所以,選擇LGN 部位的尼氏小體的含量作為觀察指標(biāo)對(duì)說明視功能保護(hù)的機(jī)理具有一定的作用。

中醫(yī)藥對(duì)視功能的保護(hù)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。青光眼屬中醫(yī)“五風(fēng)內(nèi)障”范疇,其視功能損害導(dǎo)致的特異性視神經(jīng)萎縮和視野缺損類似于“青盲”,主要病機(jī)是肝腎虛損、脈絡(luò)瘀滯,滋養(yǎng)肝腎、活血通絡(luò)是防治青光眼視功能損害的基本方法。以往的研究也證實(shí)補(bǔ)腎活血法(杞菊地黃丸和復(fù)方丹參片合用)對(duì)SD大鼠慢性EIOP模型視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、視中樞損傷及眼壓控制后青光眼視功能均有一定的保護(hù)作用[8-12]。以滋養(yǎng)肝腎、活血化瘀為主要功效的補(bǔ)精益視片(原名益視片)已在視功能的保護(hù)及改善方面取得了良好療效[13]。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察慢性EIOP 大鼠LGN 部位尼氏小體的含量,進(jìn)一步探討補(bǔ)腎活血中藥補(bǔ)精益視片對(duì)青光眼視功能保護(hù)的作用機(jī)理。結(jié)果表明:慢性高眼壓模型會(huì)造成LGN中尼氏小體含量的下降,使用補(bǔ)腎活血中藥補(bǔ)精益視片提高了LGN中尼氏小體的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示補(bǔ)精益視片能夠改善LGN細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,使其能盡可能發(fā)揮生理功能,從而發(fā)揮視功能保護(hù)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,補(bǔ)精益視片可作為臨床青光眼視神經(jīng)保護(hù)藥物推廣應(yīng)用。

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InfluenceofBuJingYiShitabletsonlateralgeniculate'sNisslbodiesinratmodelofchronicelevatedintraocularpressure

KEXin-yi1,2,LIXiang1,LIUHong-ji3,YUANMing-yue3,LiXiang-yu3,LIHua-hong3,WANGTai3,TIANMeng-yao3,YANGFeng-jiao3

(1.DepartmentofOphthalmology,TheTeachingHospitalofChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610072;2.LongquanyiDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicial,Chengdu,Sichuan,610100;3.ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveTo observe the effect of BuJingYiShi tablets on lateral geniculate nucleus'(LGN)Nissl body damage in rat model of chronic elevated intraocular pressure(EIOP),and explore the mechanism of it initially.MethodsThe rats were randomly divided into 3 groups:control group,model group and treatment group,10 rats in each group.The model of chronic EIOP was established by unilaterally cauterizing 3 episcleral vessels.After given BuJingYiShi tablets and normal saline for 8 weeks,killed the rats and taken out the brains.IOP,content of nissl bodies in lateral geniculate nucleus(LGN)were observed.ResultsImmediately modeling and 8 weeks after-modeling,IOP were highly significant different from before modeling(allP<0.01).There was a decreasing tendency in treatment group between 8 weeks after-modeling and immediately modeling(P<0.01).While model group was not statistically significant(P>0.05).The total area(55863.31±18427.166S/μm2)and integrated optical density(16084.76±6013.412)of Nissl body in model groups were lower than treatment group(114533.71±17849.482S/μm2,35237.50±4626.313)and control group(108020.95±27719.546S/μm2,31261.33±7800.446)(allP<0.01);Though total area and integrated optical density in treatment group were little lower than control group,there was no significant difference in statistics(P>0.05).ConclusionBuJingYiShi tablets can protect the visual function on the rat model of chronic EIOP by enhancing content of nissl bodies in LGN.

Glaucoma; BuJingYiShi tablets; Optic neuroprotection; The rat model of chronic elevated intraocular pressure; Nissl body; Lateral geniculate nucleus

國(guó)家自然科學(xué)基金(81373695/H2713);成都中醫(yī)大學(xué)科技發(fā)展基金(030018024)

1.610072,四川成都,成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院;2.610100,四川成都,龍泉驛區(qū)中醫(yī)醫(yī)院; 3.610075,四川成都,成都中醫(yī)藥大學(xué)

李翔,教授,E-mail:jeannelxiang@126.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.007

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