補腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜PI3K/AKt通路Bcl-2及Bad的影響

張靜 李翔 汪偉 劉紅佶 李祥玉 李華宏 王泰 田夢瑤 楊鳳嬌

補腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜PI3K/AKt通路Bcl-2及Bad的影響

張靜1,2李翔1汪偉3劉紅佶4李祥玉4李華宏4王泰4田夢瑤4楊鳳嬌4

目的觀察補腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜Bcl-2及Bad的干預(yù)作用,探討其作用機理。方法選取30只SD大鼠,隨機分為對照組、給藥組及模型組,每組各10只。采用烙閉鞏膜上靜脈方法制作慢性高眼壓大鼠動物模型,每組連續(xù)灌胃8周后處死大鼠,觀察補腎活血法對EIOP大鼠眼壓、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞超微結(jié)構(gòu)和視網(wǎng)膜Bcl-2、Bad 表達的影響。結(jié)果SD大鼠造模后即刻直至造模后8周與造模前眼壓相比均升高,有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.01),造模后8周眼壓與造模后即刻相比,給藥組有降低趨勢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后8周,給藥組Bcl-2陽性表達最高,與對照組和模型組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),模型組Bcl-2表達多于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),模型組Bad陽性表達最高,與給藥組和對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),給藥組的Bad的表達多于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。給藥組RGCs超微結(jié)構(gòu)較模型組明顯改善。結(jié)論補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復(fù)方丹參片)能保護SD大鼠慢性EIOP模型視功能,主要表現(xiàn)為:上調(diào)Bcl-2的表達、下調(diào)Bad的表達、降低眼壓及改善RGCs超微結(jié)構(gòu)。

青光眼； 補腎活血中藥； 視網(wǎng)膜； 大鼠慢性高眼壓模型； 視神經(jīng)保護； Bad； Bcl-2

青光眼(glaucoma)為繼白內(nèi)障后的世界第二大不可逆的致盲性眼病。其以病理性的眼壓升高,進行性的視神經(jīng)(optic nerve,ON)損害和特征性視野缺損為特點[1]。青光眼的發(fā)病機制較復(fù)雜,諸多危險因素都可以導(dǎo)致青光眼的產(chǎn)生,而最危險的因素就是病理性眼壓(intraocular pressure,IOP)升高[2],所以青光眼的主要治療措施就是將眼壓控制到靶眼壓。但隨著對青光眼認識的不斷深入,發(fā)現(xiàn)部分青光眼患者即使將眼壓控制在正常范圍內(nèi)(10～21mmHg),也會發(fā)生進行性視野缺損和視力喪失,因此,青光眼視神經(jīng)損傷的發(fā)病機制和視神經(jīng)保護成為近年來研究的熱點。

本實驗采用烙閉上鞏膜靜脈法誘導(dǎo)產(chǎn)生高眼壓維持穩(wěn)定、持續(xù)時間較長的慢性高眼壓動物模型[3],通過觀察補腎活血中藥(杞菊地黃丸和復(fù)方丹參片合用)對EIOP大鼠眼壓及B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及Bcl-xl/bcl-2相關(guān)死亡啟動子(Bcl-associated death protein,Bad)的表達的影響,探討其保護視功能的作用機理,為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

標(biāo)準1級SD大鼠30只,雌雄不拘,8～12周齡,體重約150～200g,等價飼料飼養(yǎng),大鼠及飼料均由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)室溫20～25℃,空氣流通,相對濕度55%～75%,12小時光照維持,晝夜循環(huán)。自由攝食飲水。納入標(biāo)準:①無外眼疾??；②雙眼瞳孔直接對光反射和間接對光反射正常；③無歪頸。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方丹參片(批號7122426)、杞菊地黃丸(批號7072153)均購于北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠。Bcl-2抗體(批號BA0412),Bad抗體(批號BA0530)均購于武漢博士德公司。

1.3 造模方法

SD大鼠購回后,適應(yīng)性喂養(yǎng)3天,進行眼壓測量,正常眼壓區(qū)間估計,取平均眼壓在9～18mmHg者,隨機分為對照組、模型組、給藥組,模型組和給藥組進行單眼(右眼)造模,左眼不做處理。方法如下:大鼠稱重及固定后,用3%戊巴比妥鈉按1.5ml/kg體重行左下腹腔注射全身麻醉,同時術(shù)眼予0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液角結(jié)膜表面麻醉,于10點至2點鐘位距角鞏膜緣1～2mm剪開上方球結(jié)膜,分離筋膜,暴露角鞏膜緣后3～4mm近赤道部10點、12點和1點處3支上鞏膜靜脈并烙閉,整復(fù)球結(jié)膜,術(shù)眼涂金霉素眼膏,待大鼠蘇醒后放回籠內(nèi),0.25%氯霉素眼液滴眼,2次/日,連續(xù)6天。對照組右眼眼科手術(shù)止血器不開開關(guān)而不起烙閉作用,其余操作相同。因為灌胃等原因動物死亡4只。

1.4 分組與給藥方法

對照組、模型組大鼠給予每天3ml生理鹽水灌胃。將復(fù)方丹參片合杞菊地黃丸磨成粉狀,加入生理鹽水,每60片(18g)配置成100ml懸混液,濃度為0.18g/ml,給藥組混懸液灌胃1.8g/kg.d。實驗中,根據(jù)大鼠體重選取混懸液劑量。每只大鼠每天灌胃總量均3ml,所需混懸液劑量不足3ml的用生理鹽水補足。每天下午17:00灌胃1次,連續(xù)灌胃8周。每2周稱體重1次,依據(jù)體重調(diào)給藥量。

1.5 眼壓檢測

每日固定時間13:00～16:00測量眼壓,采用TONO-PEN筆試眼壓計,分別測量3組大鼠造模前、造模后即刻、造模后二周、造模后四周、造模后六周、造模后八周右眼的IOP。

1.6 免疫組化檢測

以頸椎脫臼法于造模8周后處死大鼠,立即取出眼球后,暴露視神經(jīng)并保留足夠長的視神經(jīng),勿牽拉及損傷視神經(jīng),自球后1mm剪斷視神經(jīng),立即將其放入FAA液中固定48小時,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚4um,干燥后備用。免疫組織化學(xué)染色,詳細操作步驟如下:取已切好的石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。3%雙氧水室溫孵育10 min。蒸餾水沖洗,PBS浸泡 5min。甩去多余液體,切片上滴加10%山羊血清封閉液,室溫孵育10min,傾去血清,不洗,滴加稀釋的Bcl-2抗體、Bad抗體(均為1:100),放入冰箱內(nèi)4℃下孵育過夜。次日取出,PBS沖洗3次,每次5min。滴加生物素標(biāo)記二抗工作液,濕盒內(nèi)37℃水浴箱孵育30min,PBS沖洗3次,每次5min。滴加試劑辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP),濕盒內(nèi)37℃水浴箱孵育20min,PBS沖洗3次,每次5min。配置DAB顯色液,在顯微鏡下掌握顯色程度。蘇木素復(fù)染,自來水沖洗4min,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果及拍片。 陰性對照:用PBS替代一抗,其余步驟同上。結(jié)果判定:隨機選取高倍鏡(×200)下6個視野進行觀察,Bcl-2、Bad陽性表達為棕黃色染色,共36個視野,用Mias-2000型圖形圖像分析儀測量,求取每張切片6個視野的染色面積總和、積分光密度總和、平均黑度。

1.7 電鏡下RGCs超微結(jié)構(gòu)觀察

各組隨機選定1只大鼠,處死后立即剝離眼球,3%戊二醛浸泡預(yù)固定,1%四氧化鋨再固定,丙酮逐級脫水,環(huán)氧樹脂Epon812包埋,半薄切片光學(xué)定位,超薄切片,醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色,日立H-600IV型透射電鏡下觀察RGCs細胞形態(tài)、核、胞膜及細胞器等,在四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院病理電鏡室完成。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 慢性EIOP大鼠IOP

各組大鼠組間及造模、用藥前后眼壓比較(見表1):

由表1可見:造模前對照組、給藥組及模型組IOP無明顯差異(為P>0.05)；造模后即刻,對照組上升不明顯,前后比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),給藥組、模型組上升明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且與對照組差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；造模后八周,給藥組及模型組與造模前相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；給藥組造模后八周與造模后即刻相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),模型組造模后八周與造模后即刻相比,無明顯差異(P>0.05)。

表1 各組造模前、造模后即刻及造模后8周眼壓比較(單位:mmHg)

注：與造模前相比,△P<0.01；與對照組相比,▲P<0.01；與造模后即刻相比,☆P<0.01

2.2 補腎活血中藥對EIOP大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2表達的影響(見表2、圖1-3)

由表2可見:檢測指標(biāo)為總面積、積分光密度及平均黑度,如上表所示各項指標(biāo)中以給藥組Bcl-2表達最多,給藥組的總面積、積分光密度與對照組與模型組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；模型組總面積、積分光密度多于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；給藥組平均黑度與模型組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 Bcl-2在視網(wǎng)膜的表達

注：與對照組相比,▲P<0.01；與給藥組相比,★P<0.01

2.3 補腎活血中藥對EIOP大鼠視神經(jīng)Bad表達的影響(見表3,圖4-6)

由表3可見:檢測指標(biāo)為總面積、積分光密度及平均黑度,如上表所示各項指標(biāo)中以模型組Bad表達最多,其總面積,積分光密度與對照組及給藥組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；給藥組的總面積、積分光密度多于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；給藥組平均黑度與模型組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 杞菊地黃丸和復(fù)方丹參片對慢性EIOP大鼠RGCs超微結(jié)構(gòu)的影響(圖7-9)

正常大鼠RGCs細胞核(N)呈圓形或卵圓形,核膜清晰,染色質(zhì)均勻,細胞器豐富、線粒體(Mi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)形態(tài)正常(圖7)。造模后RGCs損傷明顯,表現(xiàn)為細胞核(N)呈圓形或卵圓形,輪廓極不規(guī)則,核膜清晰可見,核內(nèi)染色質(zhì)固縮,胞漿空泡化,核糖體明顯減少,殘存線粒體(Mi)高度膨脹、破裂,部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)擴張,呈空泡狀(圖8)。而給予補精益視片后大鼠RGCs損害較模型組輕,其部分細胞核(N)呈圓形或卵圓形,形態(tài)欠規(guī)則,核膜清晰可見,核內(nèi)染色質(zhì)呈聚集趨勢,線粒體(Mi)輕度腫脹、變形,部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)擴張,胞漿中細胞器種類、數(shù)量均有減少,分布較稀疏(圖9)。

圖1 對照組Bcl-2染色(200×) 圖2 模型組Bcl-2染色(200×) 圖3 給藥組Bcl-2染色(200×)

表3 Bad在視網(wǎng)膜的表達

注：與對照組相比,▲P<0.01,△P<0.05；與給藥組相比,★P<0.01

圖4 對照組Bad染色 圖5 模型組Bad染色 圖6 給藥組Bad染色

3 討論

青光眼是眼科常見的不可逆的致盲性眼病。青光眼的致病特點就是視野缺損和視神經(jīng)損傷,發(fā)病隱匿,病因復(fù)雜,發(fā)病機制至今尚未完全明了,已往青光眼的治療主要是通過藥物或者手術(shù)方式將眼內(nèi)壓控制在適當(dāng)范圍,而部分青光眼患者即使經(jīng)藥物或手術(shù)降低了眼壓,但RGCs的凋亡、視神經(jīng)的損傷仍繼續(xù)發(fā)展,甚至導(dǎo)致視力喪失[4],因此在控制眼壓的同時,阻斷或降低RGCs的凋亡和增加RGCs的存活能力,已成為青光眼治療的研究方向[5-6]。國外已有實驗證明PI3K/Akt信號通路在RGCs的凋亡過程中起到抑制作用[7],但具體作用機理仍然不清楚近年來,PI3K/Akt信號通路(磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,phosphatidylinositol 3-kinase pathway/protein kinase B,PI-3K/Akt)已成為凋亡基因調(diào)控?zé)狳c,PI3K/Akt信號通路促進神經(jīng)元存活的作用已經(jīng)得到許多研究的證實[ 8-10 ]。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,普遍存在于機體內(nèi)各類細胞中,Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是PI3K的活化物質(zhì),主要負責(zé)由PI3K始動的生物信息的傳導(dǎo),生長因子等胞外因子通過與其相應(yīng)的酪氨酸激酶受體結(jié)合后,引導(dǎo)PI3K移動至附近的漿膜,活化的PI3K催化產(chǎn)生PI一3,4-P2和PIP3,后者誘導(dǎo)無活性的Akt和磷脂酰肌醇依賴的激酶一l(PI)K一1)轉(zhuǎn)位至漿膜內(nèi)表面,從而實現(xiàn)Akt的激活,發(fā)揮抗凋亡作用,激活后的Akt通過直接磷酸化凋亡機器組件或間接改變編碼凋亡機器組件的基因表達水平,來控制凋亡過程,如:通過磷酸化抑制前凋亡蛋白Bad的活性；Bad引起細胞凋亡,與Bcl-2和Bcl-xL在線粒體外膜處結(jié)合形成異源二聚體有關(guān)。D’Agata等[11]對正常的剛剛出生、生后15d及成年大鼠眼組織研究結(jié)果證明,大鼠脈絡(luò)膜叢上皮細胞、神經(jīng)節(jié)細胞中均有Bad表達。吳紅色等[12]研究發(fā)現(xiàn),大鼠視神經(jīng)鉗夾傷后3d,Bad開始高水平表達,5d達到高峰,7d開始下降,Bad高水平表達促進了RGCs繼發(fā)性的死亡,直到傷后14d Bad表達水平明顯下降,使RGCs數(shù)目維持于穩(wěn)定狀態(tài)。Burne等[13]的研究顯示切斷軸索后,bcl-2轉(zhuǎn)基因的表達保護了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞免于凋亡。因此說Bad作為細胞凋亡基因的代表,Bcl-2作為細胞生存基因的代表,兩者之間表達水平的平衡結(jié)果,決定了細胞是生存還是凋亡。楊柳等[14]發(fā)現(xiàn)高表達的Bcl-2能夠促進小鼠視神經(jīng)損傷后的再生,并且再生的神經(jīng)軸突在4d后長入腦內(nèi)的靶組織。

圖7 透射電鏡觀察 對照組RGCs(×12000)。細胞核(N)呈圓形或卵圓形,核膜清晰,染色質(zhì)均勻,細胞器豐富、線粒體(Mi)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)形態(tài)正常 圖8 透射電鏡觀察 模型組RGCs(×20000)。細胞核(N)呈圓形或卵圓形,輪廓極不規(guī)則,核膜清晰可見,核內(nèi)染色質(zhì)固縮,胞漿空泡化,核糖體明顯減少,殘存線粒體(Mi)高度膨脹、破裂,部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)擴張,呈空泡狀 圖9 透射電鏡觀察 給藥組RGCs(×20000)。部分細胞核(N)呈圓形或卵圓形,形態(tài)欠規(guī)則,核膜清晰可見,核內(nèi)染色質(zhì)呈聚集趨勢,線粒體(Mi)輕度腫脹、變形,部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)擴張,胞漿中細胞器種類、數(shù)量均有減少,分布較稀疏

青光眼是一類以特異性視神經(jīng)損害和視野缺損為共同特征的眼病,類似中醫(yī)“五風(fēng)內(nèi)障”及“青盲”,屬瞳神疾病,五風(fēng)內(nèi)障(青光眼)基本病機為氣血失和、玄府閉阻的中醫(yī)理論以及病久則肝腎兩虧,神光衰微甚至泯滅、不睹三光而成“青盲”(青光眼視功能損害而視神經(jīng)萎縮)的病理過程,提出肝腎虛損、脈絡(luò)瘀滯是青光眼視神經(jīng)病理改變的主要病機,滋養(yǎng)肝腎、活血通絡(luò)是防治青光眼視神經(jīng)損害的基本方法,故本實驗選取杞菊地黃丸和復(fù)方丹參片合用共奏滋補肝腎、活血化瘀之功,通過動物實驗,來進一步闡述補腎活血中藥在青光眼治療方面的作用機制,拓展臨床思路。我們的前期研顯示[15-17]杞菊地黃丸合復(fù)方丹參片可以抑制EIOP大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer,RNFL)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層(retinal ganglion cells layer,RGCL)變薄,改善RGCs超微結(jié)構(gòu),防止RGCs和RNFL損害,有助于多焦視網(wǎng)膜電圖(multifocal electroretinogram,mfERG)總波及1、2、3、4環(huán)P1波反應(yīng)密度、總波P1波峰潛時、2環(huán)及3環(huán)N1波反應(yīng)密度,3環(huán)、4環(huán)N1波峰潛時的恢復(fù),上調(diào)RGCs抗凋亡基因Bcl-2、抑制凋亡促進基因Bax[18],并可修復(fù)初級視皮質(zhì)(primary visual cortex,PVC)及外側(cè)膝狀體(lateral geniculate nucleus,LGN)的損傷,提高EIOP大鼠PVC及LGN的BDNF表達[19-22]。臨床觀察[23]也發(fā)現(xiàn)杞菊地黃丸與復(fù)方丹參片治療眼壓控制后青光眼視功能的臨床療效良好。

本研究通過觀察補腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜PI3K/AKt通路凋亡相關(guān)因子Bcl-2及Bad的干預(yù)作用及對EIOP大鼠視網(wǎng)膜RGCs超微結(jié)構(gòu)的影響,進一步探討補腎活血中藥對青光眼視功能保護的作用機理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復(fù)方丹參片)用于SD大鼠慢性EIOP模型,能降低眼壓,上調(diào)Bcl-2的表達及下調(diào)Bad的表達、改善RGCs超微結(jié)構(gòu)來抑制細胞凋亡,最終發(fā)揮對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜的保護作用。杞菊地黃丸為經(jīng)典古方,為滋補肝腎明目的代表方劑,復(fù)方丹參片活血化瘀通絡(luò),兩者均為《中國藥典》載入藥品、非處方用藥,可作為臨床青光眼視神經(jīng)保護藥物推廣應(yīng)用。

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EffectsoftraditionalChinesemedicineofBuShenHuoXueonritinalBcl-2andBadofPI3K/AKtpathwayinratmodelofelevatedintraocularpressure

ZHANGJing1,2,LIXiang1,WANGWei3,LIUHong-ji4,LiXiang-yu4,LIHua-hong4,WANGTai4,TIANMeng-yao4,YANGFeng-jiao4

(1.DepartmentofOphthalmology,TheTeachingHospitalofChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610072;2.YanglingDemonstrationZoneHospital,Xianyang,Shanxi,712100 ;3.TraditionalChineseMedicineHospitalAffiliatedtoSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan,646000;4.ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveTo observe the effect of traditional Chinese medicine (TCM) of BuShenHuoXue on retinal BCL-2 and Bad in SD rat model of chronic elevated intraocular pressure,and explore it’s initial mechanism.MethodsThe rats were randomly divided into 3 groups:control group,model group and treatment group,10 rats in each group.The model of chronic EIOP was established by unilaterally cauterizing 3 episcleral vessels.After given TCM of BuShenHuoXue or normal saline for 8 weeks,the rats were put to death.The effect of intraocular pressure(IOP),expression of retinal BCL-2 and Bad,ultrastructure of RGCs were observed.ResultsCompared with pre-operation,IOP in treatment group and model group at model building until postoperation 8 weeks were increased(allP<0.01).There was obviously reduce in treatment group between postoperation 8 weeks and models building (P<0.01),While model group was not statistically significant(P>0.05).8 weeks after-modeling,the Immunohistochemical detection of retina showed that the treatment group’s expression on Bcl-2 was the highest,compared with the control group and modle group,there were statistically differences(allP<0.01),model group’s expression on Bad was the highest,compared with the treatment group and control group,there were statistically differences(allP<0.01).The ultrastructure of RGCs in the treatment group was significantly improved compared with model group.ConclusionTCM of BuShenHuoXue (QijuDihuang pills and DaShen tablets)can protect the visual function on the rat model of chronic EIOP.It mainly manifested as follows:up-regulated the expression of retinal Bcl-2,dwonregulated the expression of retinal Bad,reduced IOP slightly and improved the ultrastructure of RGCs.

Glaucoma; TCM of BuShenHuoXue(QijuDihuang pills and DaShen tablets); Retina; The rat model of chronic elevated intraocular pressure; Visual function protection; Bcl-2; Bad

國家自然科學(xué)基金(81373695/H2713);成都中醫(yī)大學(xué)科技發(fā)展基金(030018024)

1.610072,四川成都,成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；2.712100,陜西咸陽,楊凌示范區(qū)醫(yī)院；3.646000,四川瀘州,西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院；4.610075,四川成都,成都中醫(yī)藥大學(xué)

李翔,E-mail:jeannelxiang@126.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.006

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