上海市某三甲醫(yī)院幽門螺桿菌耐藥性和毒力與其生物膜形成能力的相關(guān)性研究

趙付菊，胡玢婕，王小飛，孫啟娟，項(xiàng)平，張艷梅，瞿滌，趙虎

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040； 2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院胃鏡室，上海 200040

上海市某三甲醫(yī)院幽門螺桿菌耐藥性和毒力與其生物膜形成能力的相關(guān)性研究

趙付菊1，胡玢婕1，王小飛2，孫啟娟1，項(xiàng)平3，張艷梅1，瞿滌2，趙虎1

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040； 2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院胃鏡室，上海 200040

為探討復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱本院)分離培養(yǎng)的幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)的耐藥性、毒力和感染特征與其生物膜形成能力的相關(guān)性，收集2014年12月—2015年6月于本院消化內(nèi)鏡中心的胃活檢組織標(biāo)本及相應(yīng)臨床病例資料，分離培養(yǎng)獲得幽門螺桿菌，分析菌株的耐藥性、毒力基因型、臨床病例特征。結(jié)果顯示，從胃活檢組織樣本中共分離培養(yǎng)28株幽門螺桿菌，對(duì)左氧氟沙星(levofloxacin，LEV)、甲硝唑(metronidazole，MTZ)和克拉霉素(clarithromycin，CLA)的耐藥率分別為32%、75%和11%，未發(fā)現(xiàn)阿莫西林(amoxicillin，AMX)耐藥。單一藥物耐藥17株(17/28，61%)，雙重耐藥10株(10/28，36%)。毒力基因cagA、oipA和vacAs1檢出率為100%，未檢出vacAs2?；蛐蛌acAs1m1占39%(11/28)，vacAs1m2占61%(17/28)；iceA1占54%(15/28)，iceA2占21%(6/28)，iceA1A2占25%(7/28)；dupA+占36%(10/28)。28株菌株均能形成生物膜，但能力不盡相同。單因素及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析顯示，45～59歲、iceA1+dupA-基因型和甲硝唑敏感菌株形成生物膜的能力較強(qiáng)。結(jié)果提示，本院分離的幽門螺桿菌對(duì)甲硝唑耐藥率最高，雙重耐藥不容忽視。菌株主要毒力基因型為cagA、oipA、vacAs1m2。幽門螺桿菌的生物膜形成能力與患者年齡有關(guān)，45～59歲組較強(qiáng)；攜帶毒力基因iceA1的菌株生物膜形成能力強(qiáng)；dupA基因型及甲硝唑耐藥與菌株生物膜形成呈負(fù)相關(guān)。

幽門螺桿菌；生物膜形成；耐藥；毒力基因

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種革蘭陰性微需氧菌，感染后能長(zhǎng)期定植于胃腸道，與慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1-3]。1994年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO) /國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將幽門螺桿菌定為Ⅰ類致癌原[4]。全世界近一半人口感染幽門螺桿菌，其中發(fā)展中國(guó)家占80%，我國(guó)感染率為40%～80%[5-7]。感染者中只有部分發(fā)病，且患病類型及轉(zhuǎn)歸不盡相同。除宿主和飲食因素外，重要原因之一是菌株攜帶的毒力因子不同。目前發(fā)現(xiàn)的主要毒力基因包括細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(cytotoxin-associated gene A，cagA)、空泡細(xì)胞毒素A基因(vacuolating cytotoxin A，vacA)、外膜炎性蛋白A基因(outer inflammatory protein A，oipA)、十二指腸潰瘍基因啟動(dòng)因子A(duodenal ulcer promoting gene A，dupA)、上皮細(xì)胞接觸誘導(dǎo)基因(induced by contact with epithelium，iceA)等，它們不同程度地與胃萎縮、腸上皮化生及其他嚴(yán)重病變有關(guān)，成為預(yù)測(cè)感染后臨床風(fēng)險(xiǎn)的重要因素[8-9]。另一原因是幽門螺桿菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)峻，根除失敗引起持續(xù)感染或反復(fù)感染，研究證實(shí)其生物膜形成在很大程度上導(dǎo)致了耐藥菌株增加[10-11]。本研究收集復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱本院)消化內(nèi)鏡中心的胃活檢組織標(biāo)本，培養(yǎng)獲得28株幽門螺桿菌，對(duì)其耐藥性、毒力基因型及感染病例特征進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討與菌株生物膜形成相關(guān)的可能因素，以輔助臨床進(jìn)行及時(shí)有效的幽門螺桿菌根除治療及預(yù)防控制耐藥菌株的傳播和流行。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)準(zhǔn)菌株：幽門螺桿菌ATCC 43504購(gòu)自上海北連生物科技有限公司。M-H血瓊脂培養(yǎng)基為上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品，E-test 紙條購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃生物診斷公司，抗菌藥物(萬(wàn)古霉素、三甲氧氨芐嘧啶、多黏菌素B、兩性霉素B)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，12孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌的分離、鑒定與藥敏分析收集2014年12月—2015年6月本院消化內(nèi)鏡中心的胃活檢組織標(biāo)本，經(jīng)研磨后接種于含萬(wàn)古霉素、三甲氧氨芐嘧啶、多黏菌素B、兩性霉素B的選擇性培養(yǎng)基中，37 ℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)，3～5 d后觀察菌落形態(tài)。經(jīng)革蘭染色鏡檢，氧化酶、尿酶及觸酶試驗(yàn)，16S RNA和ureC基因測(cè)序，證實(shí)為幽門螺桿菌。

用無(wú)菌棉簽刮取平板中培養(yǎng)3 d后的適量菌落，用0.45% NaCl 溶液調(diào)成2.0麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，均勻涂布于M-H血瓊脂培養(yǎng)基中，無(wú)菌鑷子取克拉霉素(clarithromycin，CLA)、甲硝唑(metronidazole，MTZ)、阿莫西林(amoxicillin，AMX)和左氧氟沙星(levofloxacin，LEV)的E-test 紙條(法國(guó)生物梅尼埃生物診斷公司)，分別貼于平板中央。將平板置于37 ℃微需氧環(huán)境(10% CO2，5% O2，85% N2)孵育3 d。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2013年版及有關(guān)文獻(xiàn)的判讀標(biāo)準(zhǔn)[12]：克拉霉素≥1 μg/mL，阿莫西林≥0.5 μg/mL，甲硝唑≥8 μg/mL，左氧氟沙星≥1 μg/mL 判定為耐藥。

1.2.2幽門螺桿菌生物膜形成能力檢測(cè)參照Yonezawa等的方法并加以改進(jìn)[13]。取-80 ℃保存的28株菌株，經(jīng)復(fù)蘇傳代后，挑取平板中的菌落，置于新鮮配制的含7%胎牛血清的布氏培養(yǎng)基中，37 ℃，80～100 r/min振蕩微需氧培養(yǎng)24 h，調(diào)至OD600為1.0備用。用無(wú)菌鑷子取18 mm×18 mm的蓋玻片，以一定角度置于12微孔板中，每孔加入2 mL含7%胎牛血清的布氏培養(yǎng)液。取上述調(diào)制好的預(yù)培養(yǎng)菌懸液加入微孔板中，置于37 ℃微需氧環(huán)境，80～100 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。取出蓋玻片清洗2次，干燥后置于1%結(jié)晶紫中染色30 s，用水洗去多余結(jié)晶紫。室溫干燥后，用10%乙酸溶解脫色，所得溶液取200 μL用酶標(biāo)儀測(cè)OD595。以不加預(yù)培養(yǎng)液的微孔作為空白對(duì)照，重復(fù)3次。

1.2.3幽門螺桿菌毒力基因檢測(cè)細(xì)菌基因組DNA提取按試劑盒說(shuō)明書操作，引物合成(cagA、vacA、iceA、dupA、oipA)參照文獻(xiàn)[14]，采用基本局部比對(duì)搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)軟件對(duì)基因的保守區(qū)及突變位點(diǎn)相應(yīng)片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成(表1)。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增：擴(kuò)增體系總體積25 μL，每個(gè)反應(yīng)體系DNA模板1 μL。擴(kuò)增條件：熱循環(huán)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，割膠回收PCR產(chǎn)物并純化，送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

表1幽門螺桿菌的鑒定及毒力基因引物序列

Tab.1PrimersequencesforH.pyloriidentificationandvirulencegenes

GeneSequence(5′?3′)Size(bp)16SrRNAFTCTAACGAATAAGCACCGGCTA576RGTGCAGCACCTGTTTTCAAGGureCFTCGGCAGTGCTAAAAGGATAGA500RAAACTTATCCCCAATCGCGCAcagAFAATACACCAACGCCTCCAAG400RTTGTTGCCGCTTTTGCTCTCvacAs1FATGGAAATACAACAAACACAC258RCTGCTTGAATGCGCCAAACvacAs2FATGGAAATACAACAAACACAC286RCTGCTTGAATGCGCCAAACvacAm1FCAATCTGTCCAATCAAGCGAG567RGCGTCAAAATAATTCCAAGGvacAm2FCAATCTGTCCAATCAAGCGAG642RGCGTCAAAATAATTCCAAGGiceA1FGTGTTTTTAACCAAAGTATC247RCTATAGCCASTYTCTTTGCAiceA2FGTTGGGTATATCACAATTTAT229/334RTTRCCCTATTTTCTAGTAGGTdupAFATGAGTTCTATTAACAG1839RTTAAATACTCTTCCTTATAAGoipAFCGCGGAAAGGAACGGGTTTT519RTTAGCGTCTAGCGTTCTGCC

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析患者性別、年齡，以及菌株毒力、耐藥類型與生物膜形成能力之間的相關(guān)性，單因素方差分析比較不同疾病類型與菌株生物膜形成能力之間的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株及臨床病例特征

28株幽門螺桿菌對(duì)應(yīng)的臨床病例中，男性15例、女性13例；平均年齡(50.04±14.7)歲，≥60歲8例、45～59歲11例、<45歲9例。其中慢性淺表性胃炎8例、慢性萎縮性胃炎14例、消化性潰瘍6例?？焖倌蛩孛冈囼?yàn)(rapid urease test，RUT)陽(yáng)性14例、陰性14例。

2.2 幽門螺桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

28株幽門螺桿菌對(duì)4種抗菌藥物的耐藥率分別是：左氧氟沙星32%(9/28)，甲硝唑75%(21/28)，克拉霉素11%(3/28)，阿莫西林0。對(duì)兩種藥物均耐藥10株(10/28，36%)，其中對(duì)甲硝唑和克拉霉素同時(shí)耐藥1株，對(duì)甲硝唑和左氧氟沙星同時(shí)耐藥8株，對(duì)左氧氟沙星和克拉霉素同時(shí)耐藥1株(表2)。

表2E-test檢測(cè)幽門螺桿菌對(duì)4種抗菌藥物的敏感度

Tab.2SusceptibilityratesofH.pyloritofourantimicrobialagentswithE-test(n, %)

AntibioticsSensitiveResistantResistancerateMTZ72175%CLA25311%LEV19932%AMX2800

2.3 幽門螺桿菌毒力基因檢測(cè)

檢測(cè)幽門螺桿菌的主要毒力相關(guān)基因cagA、vacA(m1/m2、s1/s2)、iceA、oipA和dupA，28株菌株均檢出cagA和oipA，基因型vacAs1檢出率為100%，未發(fā)現(xiàn)vacAs2?；蛐蛌acAs1m1占39%(11/28)，基因型vacAs1m2占比最高，為61%(17/28)。iceA1陽(yáng)性率為54%(15/28)，iceA2為21%(6/28)，iceA1A2為25%(7/28)。dupA陽(yáng)性率為36%(10/28)(表3)。

表3幽門螺桿菌攜帶的毒力基因型分布

Tab.3PrevalenceofgenotypesdetectedinH.pylori

GenotypePrevalencecagA100%oipA100%vacAs1100%vacAs20vacAs1m139%vacAs1m261%iceA154%iceA221%iceA1A225%dupA36%

2.4 幽門螺桿菌生物膜形成能力與毒力、耐藥及臨床特征的相關(guān)性分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)建立12微孔板/玻片法，對(duì)28株幽門螺桿菌的生物膜形成能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，28株菌株均能形成生物膜，檢出率為100%，但形成生物膜的能力有差異。OD595為 0.091～0.86，平均0.257±0.196。陰性對(duì)照無(wú)生物膜生長(zhǎng)(圖1)。比較患者性別、年齡，以及菌株毒力、耐藥類型與生物膜形成能力的關(guān)系。結(jié)果顯示，3個(gè)年齡組中，45～59歲組形成生物膜的能力最強(qiáng)，其次是<45歲組，而≥60歲組生物膜形成能力最弱。患者不同性別之間生物膜形成能力無(wú)顯著差異。不同毒力基因型中，分別比較iceA1組與iceA2組及iceA1A2組(P=0.014,P=0.018)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以iceA1組生物膜形成能力較強(qiáng)。dupA+與dupA-組之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.010)，dupA-組生物膜形成能力較強(qiáng)。vacAs1/m1與vacAs1/m2組之間無(wú)顯著差異。比較不同耐藥類型，克拉霉素和左氧氟沙星耐藥組與敏感組之間無(wú)差異；甲硝唑耐藥組與敏感組之間有顯著差異(P=0.004)，甲硝唑敏感組生物膜形成能力較強(qiáng)(表4)。慢性胃炎(group 1)、慢性萎縮性胃炎(group 2)及消化性潰瘍 (group 3) 對(duì)應(yīng)菌株形成生物膜能力的組間(F=1.061，P=0.361)及組內(nèi)兩兩比較均無(wú)顯著差異(P1,2=0.195，P1,3=0.241，P2,3=0.906)。

表4不同組之間幽門螺桿菌生物膜形成能力的差異

Tab.4DifferencesintheabilityofbiofilmformationofH.pyloriindifferentgroups

GroupnIndependent?samplet?testMeanStandarddeviationFvaluePvalueGender Malesvs．females15/130．287/0．2220．221/0．1651．3810．251Age ≥60vs．45?598/110．184/0．3670．034/0．27914．0440．001? ≥60vs．<458/90．184/0．1890．034/0．0655．3210．036? <45vs．45?599/110．189/0．3670．065/0．27912．9340．002?Antibiotics Rvs．S MTZ21/70．228/0．3440．141/0．30810．2420．004? CLA3/250．155/0．2700．037/0．2041．6280．213 LEV9/190．268/0．2520．197/0．2010．0040．953RUT Pvs．N14/140．262/0．2470．229/0．1700．5210．477Virulencegenes vacA s1/m1vs．s1/m211/170．235/0．2720．186/0．2070．0860．772 iceA A1vs．A215/60．327/0．1440．246/0．0277．3400．014? A1vs．A1A215/70．327/0．2050．246/0．0526．6610．018? A2vs．A1A26/70．144/0．2050．027/0．0522．6850．130 dupA Pvs．N10/180．187/0．2960．053/0．2357．6420．010?

R, resistance; S, sensitive; MTZ, metronidazole; CLA, clarithromycin; LEV, levofloxacin; RUT, rapid urease test; P, positive; N, negative. *P<0.05.

The graph shows the quantification of biofilms formed after 3-day culture in Brucella broth containing 7% FCS. The biofilms of 28 strains are shown as shadow bars and the lines depict theOD595value of these strains. The number of individual bacteria is indicated below the column and the last bar is negative control. All of the results were expressed as the mean±SD from three independent experiments.

圖128株幽門螺桿菌生物膜形成能力的分析

Fig.1Biofilmformationof28H.pyloriisolates

3 討論

幽門螺桿菌是常定植于胃黏膜上皮細(xì)胞表面的一種微需氧菌，為引起胃及十二指腸疾病的重要病原菌。然而，其高感染率與臨床發(fā)病率并不相符，患病后的疾病類型及轉(zhuǎn)歸也有明顯差異。有研究者提出，這可能與宿主、環(huán)境及菌株的遺傳特征有關(guān)，其中菌株攜帶的毒力因子類型與其致病性關(guān)系密切[9,13]。隨著抗感染藥物的廣泛使用，幽門螺桿菌的耐藥率逐漸升高，而其感染的根除治療一直以經(jīng)驗(yàn)治療為主，采用統(tǒng)一推薦的治療方案進(jìn)行，部分因耐藥菌株而根治失敗。因此，了解當(dāng)?shù)赜拈T螺桿菌耐藥情況及其毒力基因型，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

目前，幽門螺桿菌對(duì)其感染治療常用藥物如克拉霉素、喹諾酮類、甲硝唑和阿莫西林等均產(chǎn)生不同程度的耐藥，不同國(guó)家和地區(qū)的耐藥率不盡相同[15-16]。根除治療幽門螺桿菌的一線方案采用的是含有質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)和兩種抗菌藥物(克拉霉素、阿莫西林及甲硝唑)的三聯(lián)療法，但仍有至少30%的患者根除治療失敗。因此，采用該療法時(shí)應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)赜拈T螺桿菌的耐藥率及體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行[15-17]。本研究中，28株幽門螺桿菌對(duì)常見4種抗菌藥物的總體耐藥率分別是：甲硝唑75%，左氧氟沙星32%，克拉霉素11%，阿莫西林0，與Vianna等[15]及牛占岳等[18]的報(bào)道類似。甲硝唑耐藥率最高的可能原因是其價(jià)格低廉而廣泛用于厭氧菌感染。提示本院臨床醫(yī)師應(yīng)首選阿莫西林，慎用甲硝唑，若要使用則需增加用藥劑量或頻率以加強(qiáng)根除效果。雙重耐藥菌占36%，以對(duì)甲硝唑和左氧氟沙星同時(shí)耐藥為主，這可能與這兩種藥物被廣泛推薦用于二線補(bǔ)救方案根除幽門螺桿菌有關(guān)[15]。

幽門螺桿菌的毒力基因型與患者感染后的疾病類型及轉(zhuǎn)歸、菌株耐藥關(guān)系密切，具有地域和人群差異，不同毒力因子組合的致病性也迥異[9]。CagA是目前研究最多的毒力因子，與消化性潰瘍、萎縮性胃炎和胃癌密切相關(guān)，在西方人群中最為突出。東亞地區(qū)人群幾乎100%攜帶cagA基因，其中只有血清CagA 抗體陽(yáng)性者與胃癌有關(guān)[9]。vacA編碼VacA，能誘導(dǎo)膜通道形成和線粒體中細(xì)胞色素C釋放，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡和炎性因子釋放。目前對(duì)vacA的研究?jī)H次于cagA，其s區(qū)和m區(qū)各有2個(gè)等位基因，vacAs1m1菌株較vacAs1m2具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而vacAs2m2菌株無(wú)細(xì)胞毒性，vacAs2m1菌株極為少見[9,19]。iceA有iceA1和iceA2兩個(gè)等位基因，其中iceA1與胃潰瘍發(fā)生關(guān)系密切[9]。OipA是與菌株黏附有關(guān)的一類外膜蛋白，與十二指腸潰瘍及胃癌相關(guān)[9,20]。上述毒力因子之間相互協(xié)同，共同引發(fā)疾病[21]。dupA被視為疾病特異性毒力標(biāo)志基因，與十二指腸潰瘍發(fā)生有關(guān)，尤其在東亞地區(qū)關(guān)系更為密切[22]。本研究共檢測(cè)28株幽門螺桿菌，基因型cagA、oipA和vacAs1檢出率為100%，未發(fā)現(xiàn)vacAs2，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。vacA以基因型vacAs1m2為主，占61%，vacAs1m1占39%，與東南亞主要流行基因型一致[9]，與國(guó)內(nèi)浙江、貴州及河西走廊地區(qū)報(bào)道接近[23-25]。iceA1陽(yáng)性率為54%，iceA2為21%，符合文獻(xiàn)有關(guān)iceA基因在不同地區(qū)分布的報(bào)道[26]。iceA1檢出率明顯高于iceA2，與國(guó)內(nèi)浙江、內(nèi)蒙古及貴州地區(qū)一致[23-24,27]。dupA陽(yáng)性率為36%(10/28)，與亞洲國(guó)家報(bào)道的31%相似[9,22]。

生物膜是細(xì)菌為在不利環(huán)境中存活，而將自身包裹在自分泌的由多糖、胞外DNA、脂質(zhì)和蛋白構(gòu)成的胞外聚合物中的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)[28-29]，通過(guò)延緩或阻滯抗菌藥物滲透及減弱細(xì)菌代謝和生長(zhǎng)速率，以降低細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感度，還能抵抗宿主自身防御系統(tǒng)的免疫效應(yīng)，引起組織持續(xù)炎癥反應(yīng)及損傷，被認(rèn)為是引發(fā)或加重慢性感染的原因[30]。研究表明，幽門螺桿菌在體外和體內(nèi)均能形成生物膜，生物膜形成后更有利于不同基因之間的交換，從而生成毒力和生存力更強(qiáng)的菌株[31-32]。不同菌株形成生物膜的能力也有差異，相關(guān)報(bào)道不多。有研究表明，幽門螺桿菌形成生物膜的能力與群體感應(yīng)基因luxS及cagE4型分泌基因突變有關(guān)，ArsS蛋白參與菌株生物膜形成的調(diào)控，外膜囊泡中的外膜蛋白AlpB 也起重要作用[33-35]。本研究采用玻片法檢測(cè)菌株生物膜，發(fā)現(xiàn)28株幽門螺桿菌均能在玻片的氣液交界面形成生物膜，但形成生物膜的能力不盡相同，與以前報(bào)道一致[10,13]。本研究幽門螺桿菌感染病例中，男性感染率略高于女性，患者年齡集中在45～59歲，以慢性萎縮性胃炎為主。進(jìn)一步分析患者性別、年齡，以及疾病類型、藥敏結(jié)果、毒力因子等，發(fā)現(xiàn)不同年齡組之間生物膜形成能力有差異(P=0.001、0.036、0.002)，以45～59歲組最強(qiáng)，其次是<45歲組，≥60歲組最弱，這可能與患者胃內(nèi)微環(huán)境有關(guān)。不同性別、疾病類型之間無(wú)差異。RUT陽(yáng)性組與陰性組之間無(wú)顯著差異。毒力基因型vacAs1/m1與vacAs1/m2之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；iceA1與iceA2及iceA1A2(P=0.014、0.018)之間差異顯著，以iceA1生物膜形成能力較強(qiáng)；dupA+與dupA-之間有顯著差異(P=0.010)，dupA-形成能力較強(qiáng)?？死顾睾妥笱醴承悄退幗M與敏感組之間無(wú)差異，但甲硝唑耐藥組與敏感組之間有顯著差異(P=0.004)，甲硝唑敏感組生物膜形成能力較強(qiáng)。因本次入組的實(shí)驗(yàn)菌株較少，幽門螺桿菌生物膜形成能力與患者性別、疾病類型等因素的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本院分離的幽門螺桿菌毒力基因型以cagA、oipA、iceAs1及vacAs1/m2 為主，甲硝唑耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻；45～59歲、iceA1+dupA-基因型及對(duì)甲硝唑敏感的菌株形成生物膜的能力較強(qiáng)，其可能調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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. ZHAO Hu, E-mail：hubertzhao@163.com

RelationshipbetweendrugresistanceandvirulenceofHelicobacterpylorianditsbiofilmformationability

ZHAO Fuju1, HU Binjie1, WANG Xiaofei2, SUN Qijuan1, XIANG Ping3, ZHANG Yanmei1, QU Di2, ZHAO Hu1

1.DepartmentofClinicalLaboratory,HuadongHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China; 2.KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirologyofMinistriesofEducationandHealth,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 3.DepartmentofEndoscopy,HuadongHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China

To investigate the drug resistance and virulence ofHelicobacterpylori(H.pylori) strains, and explore their relationship with the infection characteristics and biofilm formation ability, gastric mucosa biopsy samples and related clinical data were collected from Huadong Hospital Affiliated to Fudan University between December 2014 and June 2015.H.pyloristrains isolated from these clinical samples were subjected to drug resistance assay, virulence gene assay and biofilm-forming assay. Twenty-eightH.pyloristrains were acquired. The resistance rates to levofloxacin (LEV), metronidazole (MTZ), clarithromycin (CLA) and amoxicillin (AMX) were 32%, 75%, 11% and 0, respectively. The single and double resistance rates were 61% (17/28) and 36% (10/28), respectively. The detection rates of virulence genescagA,oipAandvacAs1 were 100%, and novacAs2 was detected.vacAs1m2 genotype accounted for 61% (17/28), followed byvacAs1m1(11/28, 39%). The prevalence rates oficeA1,iceA2 andiceA1iceA2 were 54% (15/28), 21% (6/28), 25% (7/28), respectively. The detection rate ofdupAwas 36% (10/28). The biofilm-forming ability of 28 strains varied. Single factor and independent samplettest analysis showed that strains isolated from 45-59 years old patients,iceA1+dupA-genotype, metronidazole-sensitive strains could form stronger biofilm. In conclusion, the resistance rate ofH.pylorito metronidazole was highest in single resistance, and the double resistance should not be neglected. The main genotypes ofH.pyloriisolates werecagA,oipA,vacAs1m2. TheH.pyloribiofilm-forming ability is related to the age of patients. Specifically, strains isolated from the age 45-59 group have stronger biofilm-forming ability than those obtained from other age groups. In addition, isolates carrying the virulence geneiceA1 have strong biofilm-forming ability. And there is a negative correlation betweendupAgenotype or metronidazole resistance and the biofilm-forming ability of theH.pyloriisolates.

Helicobacterpylori; Biofilm formation; Drug resistance; Virulence gene

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目(14ZR1413100、14411962800、 16411968000)，上海申康醫(yī)院發(fā)展中心市級(jí)醫(yī)院臨床輔助科室能力建設(shè)項(xiàng)目(SHDC22014003)

趙虎

2017-05-05)

《微生物與感染》2018年征訂啟事

《微生物與感染》重點(diǎn)介紹國(guó)內(nèi)外微生物學(xué)基礎(chǔ)研究與臨床相結(jié)合的研究成果和新進(jìn)展，內(nèi)容涉及與人類、動(dòng)物和植物感染有關(guān)的微生物，如病毒、細(xì)菌、真菌、立克次體、螺旋體、支原體等的生物學(xué)及分子生物學(xué)特性、抗感染免疫、實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)以及臨床感染等方面的研究。主要欄目有特約專稿、論著、病例分析、綜述等。可供從事微生物與感染的教學(xué)、科研、醫(yī)療等工作者參考。歡迎廣大讀者到當(dāng)?shù)剜]局訂閱。

雙月25日出版 統(tǒng)一刊號(hào)：ISSN 1673-6184 CN 31-1966/R 郵發(fā)代號(hào)：4-341

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《微生物與感染》編輯部