野生番茄LA2157中熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲基因Mi-9候選基因的分離與過表達載體構(gòu)建

王銀磊 陳偉男 趙麗萍 周 蓉 宋劉霞 余文貴 趙統(tǒng)敏*

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，江蘇南京 210014；2江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014；3揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州 225009）

野生番茄LA2157中熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲基因Mi-9候選基因的分離與過表達載體構(gòu)建

王銀磊1，2陳偉男3趙麗萍1，2周 蓉1，2宋劉霞1，2余文貴1，2趙統(tǒng)敏1，2*

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，江蘇南京 210014；2江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014；3揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州 225009）

根結(jié)線蟲是番茄上的重要土傳病害，選育抗根結(jié)線蟲品種是最有效的防治方法，但是目前轉(zhuǎn)育到栽培番茄中的抗根結(jié)線蟲基因Mi-1在土溫高于28 ℃時就喪失了抗性。本試驗利用熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲野生番茄材料LA2157，根據(jù)Mi-1基因的序列信息，對其中熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲Mi-9基因進行同源克隆，在LA2157中共獲得2個候選基因片段；通過In-Fusion克隆技術，將候選基因與過表達載體pBI121進行連接，經(jīng)電泳檢測和測序分析，最終構(gòu)建Mi-9候選基因的過表達重組載體。

番茄；根結(jié)線蟲；Mi-9基因；同源克??；過表達載體構(gòu)建

番茄（Solanum lycopersicum L.）是我國主要蔬菜種類之一，根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）是番茄上重要的土傳病害（劉維志，2000），對番茄生產(chǎn)造成嚴重的影響（趙統(tǒng)敏 等，2012）。在番茄育種中，選育抗根結(jié)線蟲品種已經(jīng)成為重要的育種目標之一（Filho & Stevens，1980）。

根結(jié)線蟲屬包括90多個種，其中最為常見、對植物危害嚴重的主要是南方根結(jié)線蟲（M.incognita）、花生根結(jié)線蟲（M. arenaria）、北方根結(jié)線蟲（M. hapla）和爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）4種。在北方日光溫室，以南方根結(jié)線蟲分布最廣、為害最重（Sasser，1980；趙統(tǒng)敏 等，2012）。感病番茄植株從苗期到成株期均可被根結(jié)線蟲侵染。根結(jié)線蟲從側(cè)根根尖侵入、寄生，形成根結(jié)，感病初期植株的表型癥狀并不明顯，隨著根系吸水能力的下降，在晴天中午氣溫較高時感病植株會出現(xiàn)類似缺水的萎蔫現(xiàn)象，氣溫下降時又恢復正常，但隨著線蟲群體的擴大，根結(jié)不斷著生和變大，葉片衰老加快，植株生長勢減弱，并通常伴隨其他病害的發(fā)生，導致產(chǎn)量下降，嚴重的甚至整株枯萎死亡。此外，根結(jié)線蟲侵染時造成的傷口，也成為其他土傳病害的侵入通道，加重植株病害的發(fā)生（Dorhout et al.，1993）。

防治根結(jié)線蟲的方法主要有物理防治、化學防治和生物防治。夏季休棚期，通過深翻耕作層土壤結(jié)合高溫悶棚，施用殺線劑、生物菌劑可以在一定程度上降低蟲口數(shù)量，但是不能從根本上解決根結(jié)線蟲對番茄植株的為害，處理不當還會對人體和環(huán)境造成影響（Aboul-Eid et al.，2006）。20世紀40年代，隨著抗根結(jié)線蟲基因從野生番茄轉(zhuǎn)育到栽培番茄中，利用抗病基因已成為防治根結(jié)線蟲的重要方法之一。第一個被發(fā)現(xiàn)的抗根結(jié)線蟲基因Mi-1，是通過遠緣雜交胚挽救的手段從野生番茄轉(zhuǎn)育到栽培番茄中的（Smith，1944）。時至今日，該基因仍然在番茄抗根結(jié)線蟲中發(fā)揮著巨大的作用。Mi-1基因被定位在番茄6號染色體的短臂端，在定位區(qū)間內(nèi)多個同源性極高的片段成簇出現(xiàn)，序列分析證實該基因家族在這一區(qū)間內(nèi)存在7個同源片段。通過對這些基因的分析和功能驗證，明確只有Mi-1.2（即Mi-1）對根結(jié)線蟲具有抗性，其他基因不具有抗根結(jié)線蟲的能力（Milligan et al.，1998）。但Mi-1基因在土壤溫度高于28 ℃時，對根結(jié)線蟲的抗性就會喪失，在我國保護地栽培區(qū)域，番茄生長季中很長的時間都會存在Mi-1基因抗性喪失的情況（Tzortzakakis et al.，2005）。隨著番茄野生資源中抗病基因的挖掘，已經(jīng)明確Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5和Mi-9基因在高溫條件下仍然具有對根結(jié)線蟲穩(wěn)定的抗性（Cap et al.，1993；Veremis &Roberts，1996；Yaghoobi et al.，2005；Jablonska et al.，2007）。目前這些熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲基因均未被應用到栽培番茄中，加強對這些基因的利用，可以有效地解決Mi-1基因在生產(chǎn)中遇到的問題。

Mi-9基因是定位于野生番茄材料LA2157中的熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲基因，以Mi-1基因的部分序列構(gòu)建TRV病毒誘導的沉默載體，可以將LA2157對根結(jié)線蟲的抗性沉默，證明Mi-1與Mi-9基因具有同源性（Jablonska et al.，2007；Wang et al.，2013）。本試驗采用同源克隆的方法對野生番茄LA2157中熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲基因Mi-9的候選基因進行分離，并構(gòu)建過表達載體，為闡明Mi-9基因的抗病機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所進行。供試材料為熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲野生番茄LA2157，含有熱穩(wěn)定抗性基因Mi-9；該材料從美國加州大學番茄種質(zhì)資源中心引進。試驗用根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲，利用感病番茄moneymaker進行繁殖，之后挑取卵塊進行孵化，將收集得到的二齡幼蟲用于接種試驗（Ammiraju et al.，2003）。

試驗用亞克隆載體為北京全式金生物技術有限公司的T3載體，構(gòu)建重組載體所用骨架載體為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所茄果類實驗室保存的pBI121載體；大腸桿菌（Escherichia coli）菌株為Takara公司的DH5α和JM109。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種 2015年10月，采用50孔育苗穴盤在人工氣候室內(nèi)播種LA2157，苗齡40 d時定植于直徑10 cm的營養(yǎng)缽，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中；7 d后隨機選取5株番茄幼苗接種南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲，每株接種3 000條；接種30 d后，將5株植株的根系在32 ℃溫水中洗凈，用吸水紙吸干后包于錫箔紙中，液氮保存（Wang et al.，2013）。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 采用天根生化科技有限公司的RNA提取試劑盒對番茄根系樣品進行RNA提??；然后利用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的制備。

1.2.3 同源基因分離和相關引物設計 由于Mi-1與Mi-9基因具有同源性，在進行Mi-9基因的分離時，可以根據(jù)已知Mi-1的全基因組序列設計全長擴增引物，以含有Mi-9基因番茄材料LA2157的cDNA為模板，進行序列擴增。對擴增后的序列進行功能驗證，可以最終獲得Mi-9基因的全長序列信息。根據(jù)Mi-1基因的序列信息（序列登錄號AF039682.1），利用Primer 5.0軟件進行全長擴增引物的設計；同時，根據(jù)過表達載體pBI121序列信息，設計用于In-Fusion重組載體構(gòu)建的引物和重組載體檢測的引物（表1）。

1.2.4 In-Fusion重組載體構(gòu)建 將全長引物Milong-up和Mi-long-low擴增后片段與T3載體進行連接，以此重組載體為模板，采用CTC0414-1 NF和CTC0414-1 NR進行擴增，利用Takara膠回收試劑盒對片段進行回收。將pBI121載體進行雙酶切，所用內(nèi)切酶為BamHⅠ和SmaⅠ。雙酶切體系為：載體10 μL，buffer 10×T 1 μL，BamHⅠ和SamⅠ各1 μL，H2O 5 μL，BSA 2 μL。酶切4 h后，回收線性化的載體片段。將外源片段和線性化載體的膠回收產(chǎn)物各1 μL、5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL混樣，50 ℃連接15 min，將連接產(chǎn)物1 μL轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)中，涂板培養(yǎng)，37 ℃過夜（陳菲帆 等，2015）。

1.2.5 重組載體檢測 為了檢測重組載體是否為陽性，在載體和基因的連接部分兩側(cè)分別設計正向引物和反向引物，擴增結(jié)果為目的片段大小時，可以確定載體為重組載體。利用Primer 5.0軟件設計重組載體的檢測引物nemjz-F和nemjz-R，該引物擴增片段大小為988 bp。PCR反應體系為：單克隆提取質(zhì)粒DNA 1 μL，DNA聚合酶擴增MIX試劑5 μL，上下游引物各0.1 μL，H2O 4.8 μL。通過對擴增片段進行測序和分析，判斷是否為重組載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mi-9候選基因的分離

以野生番茄LA2157的cDNA為模板，采用Mi-long-up/Mi-long-low引物進行全長基因的分離，通過PCR擴增獲得1條單一的擴增條帶，大小約3 700 bp（圖1）。此前在對Mi-1基因進行克隆的時候，已經(jīng)明確在該基因的分布區(qū)間存在多個序列大小相似的同源片段，因此還需對所獲得的條帶進行分析，確定擴增條帶為單基因還是多個基因組成。

圖1 Mi-1基因及Mi-9候選基因PCR擴增結(jié)果

圖2 Mi-1與Mi-9候選基因氨基酸序列比較結(jié)果

2.2 分離片段的比較分析

對擴增獲得的條帶進行回收和T3載體連接轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)菌后長出的大腸桿菌單克隆進行測序分析，確定該條帶中共包含2個基因片段，將這2個基因分別命名為2157-1和2157-3。對這2個序列進行測序分析，之后與Mi-1基因蛋白序列進行比較（圖2）。將基因2157-1和2157-3的翻譯蛋白序列2157-1蛋白與2157-3蛋白進行同源性分析，確定同源性為93.16%，與Mi-1基因氨基酸序列同源性分別為92.36%和97.22%。2157-1蛋白由1 252個氨基酸組成，2157-3蛋白和Mi-1蛋白均由1 257個氨基酸組成。

2.3 過表達重組載體的構(gòu)建

分別利用2157-1、2157-3基因序列與T3連接的質(zhì)粒為模板，采用CTC0414-1 NF/CTC0414-1 NR引物進行擴增，對擴增片段進行膠回收。同時回收BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切后線性化的載體質(zhì)粒pBI121（圖3）。之后將載體分別與膠回收后的2157-1和2157-3基因序列片段進行連接。

2.4 重組載體的檢測

用于檢測重組載體的引物nemjz-F/nemjz-R可以在基因5′端檢測外源基因與載體連接點。通過對轉(zhuǎn)化后菌斑的擴增，2157-1、2157-3基因序列與pBI121重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，均可以在900～1 000 bp間擴增出單一的條帶，理論擴增片段大小為988 bp（圖4），結(jié)果與預期吻合。為了進一步確定所得菌斑內(nèi)質(zhì)粒是否為陽性重組質(zhì)粒，對上述PCR產(chǎn)物進行測序分析，結(jié)果證實為陽性重組質(zhì)粒，至此完成了對候選基因片段過表達載體的構(gòu)建。

圖3 In-Fusion重組載體構(gòu)建過程中外源片段的擴增（a）及載體線性化（b）

圖4 重組載體菌液PCR檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

番茄品種選育過程中往往將抗根結(jié)線蟲和抗另一種番茄毀滅性病害——番茄黃化曲葉病毒病的品種稱為雙抗品種，可見選育抗根結(jié)線蟲的番茄品種在育種中的重要性。根結(jié)線蟲一旦在某一地區(qū)發(fā)生，就很難根除。除了對番茄造成危害以外，黃瓜、甘藍、胡蘿卜等多種蔬菜均是根結(jié)線蟲的寄主（唐本安 等，2001；席先梅 等，2017）。選育抗病品種是最為根本、有效、環(huán)保的防治方法。但是番茄品種中目前所用的Mi-1基因在土溫高于28 ℃時就喪失了對該病害的抗性，造成番茄的減產(chǎn)。

隨著全球變暖的加劇，保護地連作障礙的加深，以及Mi-1對根結(jié)線蟲熱敏感的特性，對熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲基因在番茄品種中的應用需求日益迫切。通過前期材料篩選，獲得1份熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲的栽培番茄材料ZN17，通過基因定位將熱穩(wěn)定抗病基因Mi-HT定位在番茄6號染色體Mi-1基因附近（Wang et al.，2013）。研究發(fā)現(xiàn)，熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲基因Mi-9也位于同一位點附近，通過病毒誘導的基因沉默技術，證實Mi-1、Mi-HT與Mi-9基因具有同源性。因此在對Mi-HT進行進一步研究中，就需要與Mi-9進行比較。本試驗根據(jù)Mi-1的序列信息，設計全長擴增引物，對Mi-9基因進行同源克隆，獲得了2個與Mi-1基因同源性很高的基因，為了研究這2個基因在高溫下對根結(jié)線蟲的抗性，將這2個基因分別與過表達載體pBI121進行重組載體的構(gòu)建，為之后基因功能的分析奠定了基礎。Mi-9基因的克隆與功能分析，也將為闡明熱穩(wěn)定抗根結(jié)線蟲機理的深入研究提供依據(jù)。

陳菲帆，王琪琦，鐘輝麗，付冰冰，任丹莉，李玉紅．2015．基于In-Fusion技術的ERECTA基因植物表達載體的構(gòu)建．北方園藝，（18）：110-115．

劉維志．2000．植物病原線蟲學．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社．

唐本安，唐敏，岳新民．2001．南方根結(jié)線蟲生態(tài)地理居群對胡蘿卜生產(chǎn)危害的研究．中國農(nóng)學通報，17（1）：28-32．

席先梅，白全江，張慶萍，李玉民，郭金濤，李敏．2017．設施黃瓜根結(jié)線蟲化學防治技術研究．植物保護，43（2）：235-240．

趙統(tǒng)敏，王銀磊，楊瑪麗，趙麗萍，余文貴．2012．番茄根結(jié)線蟲病抗性基因的研究進展．江蘇農(nóng)業(yè)學報，28（6）：1492-1497．

Aboul-Eid H Z，Noweer E M，Ashour N E，Ameen H H．2006．Evaluation of a nematode bio-product Dbx-20% against root-knot nematode Meloidogyne incognita affecting grapevine under field conditions．Communications in Agricultural & Applied Biological Sciences，71（3）：659-663．

Ammiraju J，Veremis J，Huang X，Roberts P，Kaloshian I．2003．The heat-stable root-knot nematode resistance gene Mi-9 from Lycopersicon peruvianum is localized on the short arm of chromosome 6．Theoretical & Applied Genetics，106（3）：478-484．

Cap G B，Roberts P A，Thomason I J．1993．Inheritance of heat-stable resistance to Meloidogyne incognita in Lycopersicon peruvianum and its relationship to the Mi gene．Theoretical & Applied Genetics，85（6-7）：777-783．

Dorhout R，Gommers F J，Koll?ffel C．1993．Phloem transport of carboxyfluorescein through tomato roots infected with Meloidogyne incognita．Physiological & Molecular Plant Pathology，43（1）：1-10．

Filho H P M，Stevens M A．1980．Tomato breeding for nematode resistance：survey of resistant varieties for horticultural characteristics and genotype of acid phosphatases．Symposium on Production of Tomatoes for Processing，100：383-394．

Jablonska B，Ammiraju J S，Bhattarai K K，Mantelin S，Martinez de Ilarduya O，Roberts P A，Kaloshian I．2007．The Mi-9 gene from Solanum arcanum conferring heat-stable resistance to rootknot nematodes is a homolog of Mi-1．Plant Physiology，143（2）：1044-1054．

Milligan S B，Bodeau J，Yaghoobi J，Kaloshian I，Zabel P，Williamson V M．1998．The root knot nematode resistance gene Mi from tomato is a member of the leucine zipper，nucleotide binding，leucine-rich repeat family of plant genes．Plant Cell，10（8）：1307-1319．

Sasser J N．1980．Root-knot nematodes：a global menace to crop production．Plant Disease，64（1）：36-41．

Smith P G．1944．Embryo culture of a tomato species hybrid．J Amer Soc Hort Sci，44：413-416．

Tzortzakakis E A，Adam M A M，Blok V C，Blok V C，Paraskevopoulos C，Bourtzis K．2005．Occurrence of resistance-breaking populations of root-knot nematodes on tomato in Greece．European Journal of Plant Pathology，113（1）：101-105．

Veremis J C，Roberts P A．1996．Differentiation of Meloidogyne incognita and M. arenaria novel resistance phenotypes in Lycopersicon peruvianum and derived bridge-lines．Theoretical &Applied Genetics，93（5-6）：960-967．

Wang Y，Yang W，Zhang W，Han Q，F(xiàn)eng M，Shen H．2013．Mapping of a heat-stable gene for resistance to southern root-knot nematode in Solanum lycopersicum．Plant Molecular Biology Reporter，31（2）：352-362．

Yaghoobi J，Yates J L，Williamson V M．2005．Fine mapping of the nematode resistance gene Mi-3 in Solanum peruvianum and construction of a S. lycopersicum DNA contig spanning the locus．Molecular Genetics & Genomics，274（1）：60-69．

Isolation of Heat-stable Candidate Gene Mi-9 for Resistance to Root-knot Nematode in Wild Tomato LA2157 and Construction of Over-expressive Vector

WANG Yin-lei1，2，CHEN Wei-nan3，ZHAO Li-ping1，2，ZHOU Rong1，2，SONG Liu-xia1，2，YU Wen-gui1，2，ZHAO Tong-min1，2*
（1Institute of Vegetable Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China；2Key Laboratory for High Efficient Horticulture Crops Genetic Improvement of Jiangsu Province，Nanjing 210014，Jiangsu，China；3School of Horticulture and Plant Protection，Yangzhou University，Yangzhou 225009，Jiangsu，China）

Root-knot nematode disease is one of the important tomato soil-borne diseases．Breeding varieties with root-knot nematode resistance is an effective control method to deal with this disease．But at present，Mi-1 the only gene transferred to tomato culture with resistance to root-knot nematode loses its resistance when the soil temperature is over 28 ℃．In this study，wild tomato accession LA2157 with heat-stable resistance to root-knot nematode was used．According to the sequence information of Mi-1，we carried out homologous cloning on Mi-9 gene with heat-stable resistance to root-knot nematode and gained 2 candidate gene segments from LA2157．The candidate gene was ligated with the overexpression vector pBI121 by In-Fusion cloning technique．Electrophoresis and sequencing analysis proved that the recombinant vectors of the candidate gene were constructed．

Tomato；Root-knot nematode；Mi-9 gene；Homologous cloning；Over-experessive vector construction

王銀磊，男，副研究員，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種與生物技術，E-mail：yinleiwang@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：趙統(tǒng)敏，男，研究員，專業(yè)方向：番茄育種，E-mail：tmzhaomail@163.com

2017-08-25；接受日期：2017-09-30

國家自然科學青年基金項目（31401884），江蘇省自然科學青年基金項目（BK20140739）