患病鯽病原的確定與藥物治療效果

史謝堯 張振國 郝爽 黃俊嶺 羅璋 馮守明

摘 要：2017年7月，天津某鯽魚養(yǎng)殖場發(fā)生病害，患病鯽主要癥狀為頭部發(fā)黑，體表出血。為分析其病因，通過寄生蟲檢測、病毒檢測、病原菌分離和鑒定、藥物敏感性測定等方法對患病魚及病原進行了研究。結(jié)果表明：從患病魚體表和體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)大量寄生蟲；未能檢測到皰疹病毒II型陽性；但從腎臟和脾臟組織分離到大量細菌。經(jīng)鑒定為溫和氣單胞菌；該分離株對鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素和氟苯尼考等3種藥物較為敏感，選擇鹽酸土霉素作為治療藥物，按25.0 mg/kg魚體重的用藥量拌和在飼料中進行投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂5 d，取得了較好的治療效果。

關鍵詞：鯽；溫和氣單胞菌；藥物敏感性；治療

鯽具有肉質(zhì)鮮嫩，抗逆性強，適應集約化養(yǎng)殖等特點而深受養(yǎng)殖者喜愛，是我國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一，2016年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量達291.2萬噸[1]。隨著鯽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖產(chǎn)量的穩(wěn)步上升，各種病害的大規(guī)模暴發(fā)已經(jīng)成為了鯽健康發(fā)展的制約因子。迄今為止，鯽的多種生物性病原被報道，包括病毒性病原鯉皰疹病毒I型（Cyprinid herpesvirus I，CyHV-I）和鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-II）[2-4]；細菌性病原嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、蘇伯利亞氣單胞菌等[3-5]；以及車輪蟲、孢子蟲等寄生蟲病原和真菌性病原[6-8]。病原的多樣化給鯽病害的防治帶來困難，特別少數(shù)不同的病原引起鯽的發(fā)病癥狀極為相似，例如氣單胞菌引起的細菌性敗血癥和鯉皰疹病毒II型引起的鯽皰疹病毒病都能導致鯽體表出血[4，9]，僅憑肉眼觀察很難判斷病原，給鯽疾病的診治增加了難度。為了對疾病進行有效防控，在疾病發(fā)生后及時查找病原，篩選有效藥物進行治療顯得尤為重要。

2017年7月上旬，天津武清地區(qū)某鯽魚養(yǎng)殖池塘發(fā)生疾病，典型癥狀為頭部發(fā)黑、體表出血、黏液增多、鱗片松動，該疾病發(fā)展速度快、死亡率高，給養(yǎng)殖者帶來了較大的經(jīng)濟損失。為了盡快采取合理措施控制疾病的蔓延，作者等對病原進行了分析，開展了藥敏性試驗，根據(jù)試驗結(jié)果選擇藥物進行了野外治療試驗，取得較好的治療效果。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和寄生蟲觀察

用75%酒精棉球反復擦拭病魚體表后，在無菌條件下對病魚進行解剖，用接種環(huán)分別從患病魚的腎、肝、脾等組織取少量樣品劃線接種于LB平板和BHI平板，28 ℃培育48 h后，選取優(yōu)勢菌落進行純化，直至獲得純培養(yǎng)JY-201705菌株后，將其保存、備用；同時，取患病魚的鰭條、鰓、黏液、腸黏膜等樣本在顯微鏡下進行寄生蟲檢查。

1.2 病毒的檢測

取患病鯽的鰓、腎、脾、肝、腦組織混合后勻漿，使用DNA提取試劑盒按照說明書提取DNA。用套式PCR的方法對鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2， CyHV-2）進行檢測（引物序列見表1）[9]。PCR反應體系為：DNA模板0.5 μL，上下游引物各0.2 μL（10 μmol/L），2 × Mix 10 μL，加雙蒸水至20 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min后進行以下循環(huán)，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學觀察 將分離純化后的JY-201705菌株劃線接種于LB平板，28℃培養(yǎng)24 h至長出均勻菌落后，觀察其菌落形態(tài)。并挑取少量菌苔做革蘭氏染色涂片，利用光學顯微鏡觀察染色特性和菌體形態(tài)。

1.3.2 全自動細菌鑒定儀鑒定 按GN試劑卡片說明書操作。

1.3.3 分子生物學方法鑒定 按參考文獻[10]的方法進行，提取菌株JY-201705的基因組DNA為模板，采用細菌16S rRNA序列擴增的通用引物（表1）進行PCR擴增（反應體系和程序參照12）。將PCR產(chǎn)物切膠回收，連接PMD-18T載體后，轉(zhuǎn)E.coil TOP10感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行測序，測序結(jié)果與所有已登錄GenBank的基因片段進行同源性比對得到相應的屬種信息，并從GenBank中下載相近種的16S rRNA序列，利用軟件MEGA5.0進行多序列匹配排列，采用鄰位相連法（ Neighbor-joining） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstraps重復檢驗1 000次。

1.4 藥物敏感性測定

1.4.1 待測細菌的準備 將從患病鯽上分離到的JY-201705菌株接種在LB培養(yǎng)基中，28 ℃ 150 r/min培養(yǎng)48 h后，6 000 g離心10 min收集菌體，用0.75%的滅菌生理鹽水將菌液濃度調(diào)整至1×107 CFU/mL，備用。

1.4.2 供試藥物的選擇 選擇硫酸新霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、氟苯尼考、恩諾殺星、諾氟殺星、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素等10種藥物進行藥敏試驗。

1.4.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定 參照陳昌福等[11]的方法進行。將各種藥物分別用適宜介質(zhì)溶解后，用0.75%滅菌生理鹽水按2倍稀釋法將各種藥物濃度稀釋至1 000.0～0.25 μg/mL等13個濃度。然后用滅菌后的LB培養(yǎng)基將各濃度的藥物稀釋10倍，使藥物濃度稀釋至100.0～0.025 μg/mL等13個濃度。在盛有3.0 mL 含不同濃度藥物的LB培養(yǎng)基的試管中分別加入100.0 μL供試菌液，28℃ 150 r/min培養(yǎng)36 h后，肉眼觀察證實無菌生長試管中的最低藥物濃度，即為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

1.5 野外藥物治療試驗

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選擇有較好抑菌效果的鹽酸土霉素，按25.0 mg/kg.魚體重的使用量，均勻地拌和在飼料中制備成藥物餌料，對發(fā)病池塘養(yǎng)殖的鯽進行投喂，每天投喂1次藥餌，連續(xù)投喂5 d。endprint

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離

從瀕死鯽腎臟分離得到細菌1株，暫定名為JY201705。分離菌株在LB平板上形成光滑半透明、圓形、濕潤、邊緣整齊隆起的灰白色菌落；BHI平板上生長的菌落形與在LB平板類似，但生長速度更快，菌落更大，呈淡黃色。

2.2 病原菌的鑒定

通過革蘭氏染色，利用光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌株JY201705菌株為革蘭陰性短桿菌，無芽胞。利用法國梅里埃公司的全自動微生物鑒定系統(tǒng)（型號：VITEK 2 Compact）鑒定的結(jié)果為溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），可信度為98%，鑒定評語為極好的鑒定。具體生化反應見表2。以JY201705菌株的總DNA為模板，經(jīng)細菌通用引物27F和1 492R擴增到1 506 bp大小的核酸片段，將測序產(chǎn)物進入NCBI網(wǎng)站進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)其與溫和氣單胞菌同源性最高，為99%。選用GenBank中已登錄的部分氣單胞菌屬16S rRNA基因序列進行匹配排列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)果表明JY201705菌株與A.sobria聚成一枝。因此，綜合各方面試驗結(jié)果，將JY201705菌株鑒定為溫和氣單胞菌。

2.3 藥物敏感性試驗

各種抗菌藥物對菌株JY201705的MIC測定結(jié)果如表3所示。在10種供試藥物中，以鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素和氟苯尼考具有比較好的抑菌效果，最小抑菌濃度分別為0.39、0.78 和1.56 μg/mL， 其他各種藥物的抑菌效果比較差。

2.4 野外治療效果

采用抑菌效果較好的鹽酸土霉素對患病鯽進行治療，在投喂藥餌2 d后，鯽死亡率即開始度下降，連續(xù)用藥5 d后，養(yǎng)殖池塘內(nèi)鯽基本上停止了死亡，說明鹽酸土霉素對該疾病具有很好的治療效果。

3 討論

魚類發(fā)生病害以后，為了制定有效的治療措施，首先要進行病原的確定。本試驗中，利用顯微鏡對寄生蟲的進行檢查，發(fā)現(xiàn)除鰓部有少量車輪蟲寄生外，未在其他組織中發(fā)現(xiàn)大量的寄生蟲，因此排除了寄生蟲疾病的可能。據(jù)已有的報道，鯽的病毒性疾病主要有2種，一種為鯉痘瘡病（Carp pox），其病原為皰疹病毒科的鯉皰疹病毒I型（Cyprinid herpesvirus 1， CyHV-1），該病主要癥狀是體表出現(xiàn)乳頭狀突起的增生物，體表無充血癥狀，通常在冬季和早春低溫季節(jié)發(fā)生[2]，與本病在發(fā)生季節(jié)和癥狀上截然不同，因此可以排除鯉痘瘡病的可能而未進行相應的檢測；另一種為鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II， CyHV-II）引起皰疹病毒病，其主要癥狀為鰓和體表出血，流行溫度為20～25 ℃，與本病的特征極為相似，但本試驗中利用套式PCR技術未能檢測鯉皰疹病毒II型陽性，因此初步排除了病毒性疾病的可能。此外，從患病鯽腎和脾臟組織中分離到大量形態(tài)一致的菌落，利用全自動細菌鑒定儀將其鑒定為溫和氣單胞菌，此外，通過分子生物學的方法進一步驗證了其鑒定的可靠性。利用全自動細菌鑒定儀對細菌純培養(yǎng)物開展鑒定通常只需要4～6 h，較快的鑒定速度非常符合生產(chǎn)實際的要求。根據(jù)柯赫氏法則，為了對分離的疑似病原進行確認，應該利用分離株進行回感試驗，但感染試驗通常要觀察14 d以上，生產(chǎn)實踐中病害一旦發(fā)生，時間極為緊迫，所以本試驗中沒有開展回感試驗；但是，根據(jù)鑒定結(jié)果，分離到的疑似病原為溫和氣單胞菌，溫和氣單胞菌是一種水產(chǎn)動物常見病原，能引起鯽、鯉、鰱、草魚、團頭魴等淡水魚類的病害[4， 12-15]。因此，我們將其判斷為引起此次病害的病原。

為了使藥物在治療水產(chǎn)動物疾病的過程中獲得較好的效果，在決定使用某種藥物之前，需要針對病原菌進行藥物敏感性測定。只有在分離到病原菌，并測定該病原菌對擬選用藥物敏感程度的基礎上，才能選擇適當?shù)乃幬锖瓦m宜的用藥量對疾病進行治療，不然，就可能導致盲目選用藥物，造成治療效果不佳和藥物對養(yǎng)殖水環(huán)境的污染。關于菌株對藥物敏感性的測定，通常使用的方法有2種，一種為紙片法，將帶有某種藥物的紙片粘貼于已涂布待測菌液的平板上，培養(yǎng)24～48 h后通過測定抑菌圈的大小判斷敏感程度，該方法操作方便，但只能用于定性試驗。另一種方法為本試驗中使用的MIC法，該方法操作較紙片法繁瑣，但能準確計算出具體的MIC值，并可據(jù)此估計藥物的具體使用濃度，因此在生產(chǎn)實際中較為實用。在本研究中，鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素和氟苯尼考對菌株JY201705有較好的抑菌效果，這與肖艷翼等[16]的測試結(jié)果較為一致，但胡琳琳等[17]，巴翠玉等[18]，徐海圣等[19]利用分別從金魚、大馬哈魚、黃鱔中分離到的溫和氣單胞菌開展藥物敏感性測定，發(fā)現(xiàn)其對四環(huán)素耐藥。這反應出同種細菌的不同菌株耐藥情況存在很大的差別，因此，在用藥前，開展藥敏試驗顯得十分重要。本試驗中利用鹽酸土霉素治療鯽的病害取得了較好的效果，但是，這并不意味著這種藥物就永遠是抑制該池塘溫和氣單胞菌的特效藥物，因為病原菌對抗菌藥物的敏感程度會發(fā)生改變。最近，陳昌福等[20]的研究表明，利用溫和氣單胞菌在含氟苯尼考的FWA培養(yǎng)基中傳代9次以后，氟苯尼考對該菌株的MIC值上升了4～8倍，當停止使用該藥物一段時間后，MIC也會隨之下降。此外，目前我國的養(yǎng)殖水體大部分是開放型的，耐藥性可以在不同菌體間相互傳遞，由于在同一個水域中從事水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的不同養(yǎng)殖業(yè)者在預防和治療同期發(fā)生的水產(chǎn)動物病害時，可能選擇不同種類的抗生素類藥物，這會導致病原菌在短時間內(nèi)對多種藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，為了避免病原菌過快地對某些抗生素類藥物產(chǎn)生耐藥性，同一個養(yǎng)殖水域的養(yǎng)殖業(yè)者應該共同關注水域中致病菌耐藥性的變化趨勢，科學合理地選用藥物，達到避免或延緩該水域中病原菌產(chǎn)生耐藥性。

近年來，鯽皰疹病毒的發(fā)生情況十分普遍，很多養(yǎng)殖者通?？吹筋^部發(fā)黑、體表出血等癥狀就認為是皰疹病毒感染，從而失去養(yǎng)殖信心。而本試驗的研究表明，在確認為細菌性病原引起的出血癥狀后，篩選合適的藥物進行治療，能起到較好的效果。此外，也有研究表明，對于鯽皰疹病毒的防控，免疫增強劑的應用具有較好的應用效果[21]。因此，在病害發(fā)生后，一定先查找病因，再選擇合理的防控策略。endprint

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（收稿日期：2017-09-07）endprint