飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚消化酶、免疫酶以及抗氧化酶的影響

付旭　崔前進(jìn)　陳冰　楊博學(xué)　周婧　陳明康　韓雨哲

摘 要：為研究不同的飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚（Labidochromis caeruleus）的消化、免疫以及抗氧化酶的影響，選取狀態(tài)良好的淡黑鑷麗魚120尾隨機(jī)平均分成5個實(shí)驗(yàn)梯度，用脂肪含量分別為7.44%、9.86%、1091%、15.25%和23.69%的飼料進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，各3組平行，按脂肪水平從低到高分別用Z1、Z2、Z3、Z4和Z5表示。試驗(yàn)周期68 d。結(jié)果表明：隨著飼料中脂肪水平的增加，脂肪酶Z4顯著高于其他組（P<0.05）；胃蛋白酶活力和淀粉酶活力出現(xiàn)先增后降再增加的趨勢（P<0.05）；乳酸脫氫酶活力Z4顯著低于其他各組（P<0.05）；酸性磷酸酶活力Z2顯著高于其他各組（P<0.05）；堿性磷酸酶活力Z5顯著低于其他組（P<0.05）；過氧化氫酶活力Z3顯著高于其他各組（P<0.05）；丙二醛呈現(xiàn)先增后降再增加趨勢（P<0.05）；其他抗氧化能力指標(biāo)無明顯差異（P>0.05）。試驗(yàn)表明飼料中脂肪水平小于10.91%時隨著脂肪水平的升高對淡黑鑷麗魚的消化、免疫以及抗氧化有促進(jìn)增強(qiáng)作用，但脂肪水平高于10.91%會對淡黑鑷麗魚的消化、免疫以及抗氧化能力起到抑制的作用，并且會影響魚體的健康狀況。

關(guān)鍵詞：淡黑鑷麗魚（Labidochromis caeruleus）；脂肪水平；消化酶；免疫酶；抗氧化酶

脂肪對于魚類生長發(fā)育非常重要，是魚類主要的能量來源，維持了魚類的生命活動[1]。魚類攝入脂肪的多少會影響體內(nèi)多種酶的變化[2-3]。攝入過量的脂肪會積累在魚類的肝臟、腸壁以及腹腔等部位，導(dǎo)致魚類的代謝處于紊亂，影響魚類的抵抗能力以及活力[4]。攝入適當(dāng)?shù)闹具€會有助于魚類對脂溶性物質(zhì)的吸收[5]。在飼料中適當(dāng)?shù)闹竞繒岣呙庖吡Γ^量的脂肪也會產(chǎn)生負(fù)面的影響，比如會提升魚體的氧化反應(yīng)，從而激發(fā)魚體的抗氧化機(jī)制，過高的脂肪也會增加魚類患上脂肪肝的幾率從而造成不同程度的肝損傷[6]。

淡黑鑷麗魚（Labidochromis caeruleus）屬鱸形目、隆頭魚亞目、慈鯛科、鑷麗魚屬，屬于馬拉維湖慈鯛巖棲類小型慈鯛，成年個體11±1.0 cm，呈橙黃色，背鰭近邊緣處有一條黑色條紋?？蛇m應(yīng)人工飼料。淡黑鑷麗魚的觀賞價值取決于體型是否標(biāo)準(zhǔn)和體色的鮮艷程度。

目前，對淡黑鑷麗魚的研究較少，主要集中于形態(tài)學(xué)等方面。本試驗(yàn)將以淡黑鑷麗魚為研究對象，探討飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚消化、抗氧化以及免疫能力的影響，為開發(fā)淡黑鑷麗魚配合飼料提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚及飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)的試驗(yàn)用魚由當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場自行繁育。體質(zhì)量為（1.70±0.5）g。體長為（47.29±4.5）mm，取狀態(tài)良好的淡黑鑷麗魚120尾隨機(jī)平均分成5個試驗(yàn)梯度各3組平行進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，每個平行組8尾魚，于控溫循環(huán)水系統(tǒng)（匯新鈦公司提供）中進(jìn)行整個試驗(yàn)過程，水體積30 L，循環(huán)水流量3 L/min。每組隨機(jī)布置于此系統(tǒng)中，每20日再次將每個組別隨機(jī)布置，并徹底清理魚缸。水溫25±1.0 ℃，每日投喂兩次分別于8：00和16：00，投喂至試驗(yàn)魚不攝食為止。投喂后1 h進(jìn)行吸底，同時清理糞便收集殘餌，每日18：00換水20%，每日控制均勻光照12 h。保持氧氣充足。試驗(yàn)周期共68 d。

1.2 試驗(yàn)飼料的制備

試驗(yàn)飼料的原料于上海生物工程有限公司。飼料經(jīng)過研磨、過篩、攪拌器充分混勻，用小型顆粒飼料制粒機(jī)壓制而成，60 ℃烘箱烘干至含水量18%，于-20 ℃冰箱真空密封避光保存。以大豆油（金龍魚品牌）為脂肪源，以魚粉、豆粕等為蛋白源，以淀粉等為糖源。添加的大豆油含量分別為0、30、60、92、170 g/kg，共五組。試驗(yàn)飼料的基本成分以及配比質(zhì)量見表1。

維生素E 4 000 IU、維生素K3 1 000 mg、維生素B1 2 000 mg、維生素B2 1 500 mg、維生素B6 1 000 mg、維生素B12 5 mg、煙酸1 000 mg、維生素C 5 000 mg、泛酸鈣5 000 mg、葉酸100 mg、肌醇10 000 mg、載體葡萄糖及水≤ 10%；礦物質(zhì)混合物為0025 mg/g 預(yù)混料提供（mg/kg）： 氯化鈉107.79、七水硫酸鎂380.02、二水磷酸氫鈉241.91、磷酸二氫鉀665.20、二水磷酸鈣376.70、檸檬酸鐵82.38、乳酸鈣907.10、氫氧化鋁0.52、七水硫酸鋅9.90、硫酸銅0.28、七水硫酸錳2.22、碘酸鈣0.42、一水硫酸鈷2.77。

1.3 試驗(yàn)取樣以及方法

試驗(yàn)期間觀察魚的生長發(fā)育、攝食情況、死亡狀況。試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，每個平行組隨機(jī)取6尾魚。紗布擦干體表水分，至于冰袋上用滅菌的解剖工具進(jìn)行解剖，取其完整的肝臟和腸道。將每個平行組所取全部魚的肝臟做混樣用于測免疫酶、抗氧化酶，腸道做混樣用于測消化酶，置于對應(yīng)組別的離心管內(nèi)置于液氮中，后置于-80 ℃冰箱中短暫儲存，樣品置于滅菌的玻璃勻漿器中，置于碎冰中，加入預(yù)冷的生理鹽水充分勻漿制成20%的勻漿液，于4 ℃、2 500 r離心機(jī)離心10 min取上清。再稀釋成每種不同種酶測試的最適濃度。勻漿液在8 h內(nèi)測試完畢。

1.4 指標(biāo)測定與計(jì)算

采用試劑盒（南京建成生物有限公司）進(jìn)行測定，針對胃蛋白酶（PRS）、脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMS）、總氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）和總抗氧化能力（T-AOC）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）和溶菌酶（LZM）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）進(jìn)行測定并對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

所得數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并采用spss 20.0分析軟件進(jìn)行方差齊次檢驗(yàn)和單因素方差分析（One-Way ANOVA）并進(jìn)行Duncan氏多重比較，差異顯著水平為P<0.05。endprint

2 結(jié)果

2.1 飼料水平對淡黑鑷麗魚消化能力的影響

表2為淡黑鑷麗魚消化酶活力受飼料脂肪水平的影響。三種酶在不同脂肪濃度的作用下差異顯著。LPS的活性隨飼料中脂肪水平的增加呈先增后降趨勢。并于Z4達(dá)到最高值，Z4與Z5之間存在顯著差異（P<0.05），Z4與Z5分別與其他三組無顯著差異（P>0.05）。PRS隨脂肪水平的增高呈先增后降再增的趨勢，Z1、Z2與其余三組無顯著差異（P>0.05），Z3與Z4、Z5兩組有顯著差異（P<0.05）。AMS隨脂肪水平的增高呈先增后降的趨勢，于Z2達(dá)到最高值。其中Z4與Z1、Z2、Z3三組有顯著差異（P<0.05），Z2與Z3、Z4、Z5三組存在顯著差異（P<0.05），Z1與Z4、Z5兩組存在顯著差異（P<0.05）。

2.2 飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚免疫能力的影響

表3為淡黑鑷麗魚免疫酶活力受飼料脂肪水平的影響，其中各個組別中的LZM活性無顯著差異（P>0.05）。LDH的活性隨脂肪水平的增加先增后降，Z4顯著低于Z1、Z2、Z3三組（P<005）。ACP活力隨脂肪水平增加呈現(xiàn)出先增后降再趨于平緩的趨勢，Z2顯著高于Z1、Z3和Z5（P<0.05）。AKP活力Z1與其他組之間無顯著差異（P>0.05），Z5顯著低于除Z1外的其他組（P<0.05）。

2.3 脂肪水平對淡黑鑷麗魚抗氧化能力的影響

表4為淡黑鑷麗魚抗氧化能力受飼料脂肪水平的影響，分別為總抗氧化能力、總氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和丙二醛，其中T-AOC、T-SOD和GSH-PX在不同脂肪水平下不表現(xiàn)出顯著差異（P>0.05），但總體趨勢為先增后降。CAT隨脂肪水平的不斷升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，于Z3處出現(xiàn)最高值，并且顯著高于Z1、Z5兩組（P<0.05）。MDA則呈先升后降再顯著上升的趨勢，其中Z3顯著高于Z1（P<0.05），Z2、Z4分別與Z1、Z3兩組沒有顯著差異（P>0.05），而Z5則顯著高于其他組二至三倍（P<0.05）。

3 討論

3.1 飼料水平對淡黑鑷麗魚消化能力的影響

魚類消化酶的活性受很多因素影響，如魚類的品種、食性、環(huán)境以及外源攝入的營養(yǎng)飼料等[7]。消化酶可催化體內(nèi)化學(xué)變化維持正常的生命活動，反映魚類對飼料的利用率及生長發(fā)育狀況，故消化酶的研究對幫助提高魚類的飼料轉(zhuǎn)化率以及促進(jìn)魚類的生長發(fā)育起重要作用[8]。本試驗(yàn)證實(shí)在飼料中適當(dāng)?shù)闹竞坑兄谔岣叩阼圎愻~的胃蛋白酶和淀粉酶的活性，但過高的脂肪含量會抑制胃蛋白酶和淀粉酶的活性。魚類體內(nèi)脂肪酶的活力受攝入的外源脂肪含量的多少影響。當(dāng)在一定范圍內(nèi)攝入脂肪越多脂肪酶的活力就越強(qiáng)，以便可以消化吸收更多的脂肪來提供所需的能量，但當(dāng)脂肪攝入量過高時，由于脂肪積累過多會導(dǎo)致魚類患有營養(yǎng)性脂肪肝，并對魚體產(chǎn)生毒素，還會導(dǎo)致肌肉滲出性損失和肌肉營養(yǎng)不良，不僅影響魚的生長發(fā)育還會對魚體造成損傷，并且影響肝臟分泌各種活性酶[9]。本試驗(yàn)中在飼料脂肪水平極低時，為了提供足夠的能量而需要消化碳水化合物和蛋白質(zhì)，使得胃蛋白酶和淀粉酶活力增加；當(dāng)飼料脂肪水平繼續(xù)增加時，由于提供了充足的能量使得不需要蛋白質(zhì)和碳水化合物來提供能量，從而抑制蛋白酶和淀粉酶的活力[10]。但隨著脂肪含量的繼續(xù)升高，蛋白酶活力又開始增加，由于足夠脂肪的消化保證了必須脂肪酸的比例和種類的平衡以及充足的能量節(jié)約了蛋白質(zhì)可以開始更好的參與魚體的生長發(fā)育從而蛋白酶的活力再次升高[11]。直至最高脂肪濃度組由于積累過多脂肪造成脂肪肝從而導(dǎo)致肝臟無法正常工作，而導(dǎo)致脂肪酶活力顯著降低使得脂肪無法被利用，為了維持魚體正常的代謝所需的能量，只能利用蛋白質(zhì)和碳水化合物，使得蛋白酶和淀粉酶的活力從原來的基礎(chǔ)再次升高，但由于損傷的肝胰臟是魚類淀粉酶主要的分泌器官，腸道只能分泌少量淀粉酶，所以淀粉酶活力雖然升高也無法達(dá)到之前的峰值。

3.2 飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚免疫酶活力的影響

在謝麗玲[12]對龜殼攀鱸的研究中提出ACP和AKP的活性對魚類的免疫能力的強(qiáng)弱起到影響，并發(fā)現(xiàn)ACP和AKP主要由肝臟分泌到血液以及腸道中，ACP和AKP在腸道、肝臟、鰓以及腎臟含量較多，故提出魚類在ACP和AKP的作用下通過腸胃的代謝作用和鰓以及腎臟的解毒作用提高自身的免疫能力和對外界的抗逆性。在柳陽[13]對大西洋鮭的研究和王萍[14]對大鱗副泥鰍的研究中提出了AKP和ACP對消化吸收以及代謝調(diào)節(jié)起到了重要作用。本試驗(yàn)AKP和ACP活性均為先增加后降低說明飼料脂肪水平小于15.25%時可以增加魚體的免疫能力以及對營養(yǎng)的消化吸收和新陳代謝功能，但若脂肪攝入過量會導(dǎo)致脂肪累積過多，造成肝臟以及其他器官受損，使得AKP和ACP無法正常產(chǎn)生分泌，從而降低對營養(yǎng)的吸收能力和免疫能力導(dǎo)致魚體的抗逆性減弱，在環(huán)境改變時出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。LDH作為機(jī)體能量代謝中參與糖酵解的重要酶，存在于各組織器官中，主要分布于胞內(nèi)。在生物體內(nèi)，LDH主要催化乳酸脫氫成為丙酮酸，從而完成葡萄糖的無氧酵解過程，其基本功能為參與調(diào)節(jié)NAD和NADH的比率，從而對細(xì)胞內(nèi)一系列生化反應(yīng)起調(diào)控作用[15]。本試驗(yàn)在飼料脂肪水平超過10.91%時LDH活力表現(xiàn)出顯著下降，說明此時脂肪攝入量過多，導(dǎo)致體內(nèi)組織損傷，免疫力下降，抗逆性減弱。與李偉[16]對鯽魚的乳酸脫氫酶的研究中提出了魚體在受到細(xì)菌入侵、體內(nèi)出現(xiàn)組織器官的損傷以及受重金屬影響時，肝臟等組織中的LDH活力會降低的結(jié)果相同。

3.3 脂肪水平對淡黑鑷麗魚抗氧化能力的影響

本試驗(yàn)中T-AOC、T-SOD、GSH-PX和CAT表現(xiàn)先增后降的趨勢，其主要原因?yàn)樵谝欢ㄖ竞糠秶鷥?nèi)，脂肪會對肝臟產(chǎn)生一定的刺激作用，使得肝臟產(chǎn)生更多的抗氧化酶從而增加魚體的抗氧化能力，減少脂質(zhì)過氧化物對魚體的損傷，但是如果脂肪攝入過高，則脂肪過量沉積于魚的肝臟、消化道以及體腔等部位，發(fā)生氧化產(chǎn)生過多的活性氧自由基，破壞細(xì)胞膜機(jī)構(gòu)和功能，對魚體肝臟的負(fù)荷增加，導(dǎo)致抗氧化能力的減弱[17]。MDA為過氧化反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物，其含量作為過氧化物積累狀況和氧化應(yīng)激程度的重要指標(biāo)[18]。本試驗(yàn)中MDA的先升高則是隨著攝入脂肪的不斷增加，脂質(zhì)過氧化物不斷積累產(chǎn)生的結(jié)果。Z4組MDA略下降，但抗氧化酶活力沒有升高并出現(xiàn)下降，由于每組飼料中添加200 mg/kg的葉黃素5 g/kg，葉黃素為脂溶性，并且有很強(qiáng)的的抗氧化作用[19]。脂肪含量的增加促進(jìn)了魚體對葉黃素的吸收和累積，使得自由基在魚體內(nèi)未發(fā)生作用即被葉黃素清除，導(dǎo)致誘導(dǎo)性酶活活力降低，從而產(chǎn)生了飼料脂肪含量升高時MDA和抗氧化能力同時降低的情況。在脂肪攝入極高的Z5組，MDA顯著高于其他組，可能是由于脂肪過多的累積并遠(yuǎn)超過體內(nèi)累積的葉黃素可以控制的范圍，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物增加，造成肝臟負(fù)荷過重，導(dǎo)致肝功能損傷，使其無法正常分泌抗氧化酶，抗氧化酶活性降低，MDA激增，對魚體造成損傷乃至死亡[20]。endprint

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過研究飼料中不同脂肪水平對淡黑鑷麗魚消化、免疫和抗氧化酶活力的影響得出結(jié)論為：淡黑鑷麗魚的飼料中脂肪水平小于9.56%時淡黑鑷麗魚的消化、免疫以及抗氧化能力隨脂肪水平的增加而增強(qiáng)；但飼料中脂肪水平超過9.56%時會對淡黑鑷麗魚體內(nèi)的酶產(chǎn)生抑制的影響，嚴(yán)重時會對魚體造成損傷以致出現(xiàn)死亡情況。

參考文獻(xiàn)：

[1]

Chou Ben-Shan， Shiau Shi-Yen .Optimal dietary lipid level for growth of juvenile hybrid tilapia，Oreochromis niloticus X Oreochromis aureus[J].Aquaculture，1996，143（2）：185-195.

[2] Hanley Fred.Effects of feeding supplementary diets containing varying levels of lipid on growth，food conversion，and body composition of Nile tilapia，Oreochromis niloticus（L.）[J].Aquaculture，1991，93（4）：323-334.

[3] Cowey C B，Cooke D J ， Matty A J，et al.Effects of quantity and quality of dietary protein on certain enzyme activities in rainbow trout.[J].Journal of Nutrition，1981，111（2）：336.

[4]麥康森.水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料學(xué)（2 版）[M].北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社，2011： 41-53.

[5] 薛繼鵬.三聚氰胺、氧化魚油和脂肪對瓦氏黃顙魚生長和體色的影響[D].中國海洋大學(xué)，2011.

[6] 陳水春.飼料脂肪及不同脂肪源對魚類的影響[J].漁業(yè)信息與戰(zhàn)略，2008，23（10）：7-11.

[7] 黃瑾，熊邦喜，陳潔，等.魚類消化酶活性及其影響因素的研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（5）：129-131.

[8] Garling D L JR ， Wilson R P .Optimum dietary protein to energy ratio for channel catfish fingerlings，Ictalurus punctatus.[J].Journal of Nutrition，1976，106（9）：1368-75.

[9] 杜震宇.養(yǎng)殖魚類脂肪肝成因及相關(guān)思考[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014，38（9）：1628-1638.

[10] 向梟，周興華，陳建，等.飼料中脂肪含量對翹嘴紅鲌幼魚消化酶活性的影響[J].北京水產(chǎn)，2008（5）：35-38.

[11] 王愛民，呂富，楊文平，等.飼料脂肪水平對異育銀鯽生長性能、體脂沉積、肌肉成分及消化酶活性的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2010，22（3）：625-633.

[12] 謝麗玲，謝俊，趙斌，等.重金屬污染下龜殼攀鱸組織中ACP和AKP的活力比較[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016，11（3）：323-330.

[13] 柳陽，李勇，周邦維，等.脂肪和蛋白質(zhì)水平對工業(yè)養(yǎng)殖大西洋鮭消化酶、非特異性免疫及水質(zhì)的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014，38（3）：433-442.

[14] 王萍，杜啟艷，南平，等.饑餓對大鱗副泥鰍不同組織糖原、ACP和ALP的影響[C]//中國動物學(xué)會北方七省市區(qū)動物學(xué)學(xué)術(shù)研討會.2008：862-863.

[15] Lapworth Ruth， Tarn Anne C.Commentary on the British Thoracic Society guidelines for the investigation of unilateral pleural effusion in adults[J].Annals of Clinical Biochemistry，2006，43（Pt 1）：17.

[16] 李偉，譚妮.病原菌感染對鯽魚乳酸脫氫酶（LDH）活性的影響[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15（12）：25-26.

[17] 曾本和，廖增艷，吳雙，等.飼料脂肪水平對大鱗副泥鰍幼魚生長性能、消化酶活性及抗氧化能力的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2016，28（4）：1105-1113.

[18] Martínez-Alvarez R M， Hidalgo M C， Domezain A，et al.Physiological changes of sturgeon Acipenser naccarii caused by increasing environmental salinity[J].Journal of Experimental Biology，2002，205（Pt 23）：3699.

[19] 李海毅.葉黃素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及抗氧化活性評價[D].吉林大學(xué)，2012.

[20] 張晨捷，彭士明，陳超，等.飼料蛋白和脂肪水平對云紋石斑魚幼魚免疫和抗氧化性能的影響[J].海洋漁業(yè)，2016，38（6）：634-644.

（收稿日期：2017-09-28）endprint