糖皮質(zhì)激素對變應性鼻炎豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒細胞及肥大細胞浸潤及P物質(zhì)含量的影響

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(1.南華大學附屬南華醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 衡陽 421001；2.婁底市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科)

·基礎醫(yī)學·

糖皮質(zhì)激素對變應性鼻炎豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒細胞及肥大細胞浸潤及P物質(zhì)含量的影響

陳祖堯1，羅志葵2，朱發(fā)梅1，鄭家法1

(1.南華大學附屬南華醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 衡陽 421001；2.婁底市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科)

目的探索糖皮質(zhì)激素對變應性鼻炎(AR)豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒細胞浸潤、肥大細胞浸潤及P物質(zhì)(SP)含量的影響。方法30只雄性豚鼠分為正常組(對照組)、變應性鼻炎組(模型組)和糖皮質(zhì)激素治療組(干預組)(n=10)。采用卵清蛋白腹腔注射基礎致敏及雙側(cè)鼻腔局部激發(fā)建造豚鼠變應性鼻炎模型，干預組用糖皮質(zhì)激素布地奈德噴鼻治療。對照組及模型組同期用生理鹽水噴鼻處理。豚鼠鼻中隔黏膜予以蘇木素—伊紅染色、甲苯胺藍染色及SP免疫組化分析,顯微鏡下觀察計數(shù)鼻中隔黏膜中嗜酸粒細胞和肥大細胞浸潤程度。光密度半定量分析SP免疫組化染色。結(jié)果與對照組比較，模型組癥狀學評分滿足變應性鼻炎診斷標準，有明顯嗜酸性粒細胞及肥大細胞浸潤；與模型組比較，糖皮質(zhì)差異激素噴鼻治療干預后，干預組各項指標和癥狀均有改善。結(jié)論局部應用布地奈德有緩解AR癥狀，并能降低嗜酸性粒細胞及肥大細胞的浸潤程度，減輕組織炎性反應，可能是與通過抑制變應性鼻炎鼻黏膜中SP釋放有關。

變應性鼻炎； 嗜酸性粒細胞； 肥大細胞； P物質(zhì)

變應性鼻炎 ( allergic rhinitis，AR)俗稱過敏性鼻炎，是機體通過各種途徑接觸(主要是呼吸道)個體化的變應原后，鼻腔鼻竇黏膜產(chǎn)生的IgE 介導的非病原微生物感染性炎癥，目前認為，Th1/Th2穩(wěn)態(tài)因受變應原的影響所產(chǎn)生的失衡構(gòu)成了AR的免疫學基礎。變應性鼻炎的發(fā)生、發(fā)展是由于變應原激活嗜酸性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞及樹突狀細胞等多種炎性細胞,在這些細胞內(nèi)中經(jīng)過多種配體受體信號傳導途徑后激活相關因子如NF-κB等，繼之釋放白細胞介素、組胺、白三烯等多種細胞因子及炎癥遞質(zhì)[1]。目前研究表明鼻黏膜感覺神經(jīng)纖維末梢受到軸索反射的作用而被激活釋放多種神經(jīng)肽,這些神經(jīng)肽如SP、降鈣素基因相關肽、血管活性腸肽等在介導的局部血管通透性增加、炎性細胞浸潤以及組織損傷中起重要作用[2]。本實驗采用卵清蛋白致敏方法制備AR模型大鼠，運用多種染色方法系統(tǒng)地觀察變應性鼻炎小鼠鼻腔黏膜的組織病理學情況，觀察具有代表性的炎性細胞嗜酸性粒細胞、肥大細胞的浸潤以及鼻粘膜中SP的變化，旨在從細胞及分子水平進一步研究變態(tài)反應的發(fā)病機制。探討糖皮質(zhì)激素是否能影響神經(jīng)肽的表達以及神經(jīng)肽是否參與變應性鼻炎中鼻粘膜嗜酸性粒細胞及肥大細胞的浸潤過程。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組健康雄性豚鼠30只，體重150～220 g，于南華大學實驗動物中心購買及喂養(yǎng)，保證濕度50%±5%，環(huán)境溫度為22.5±2.5 ℃。保持室內(nèi)環(huán)境清潔及安靜通風，實驗過程中，豚鼠能自由獲取標準顆粒飼料(南華大學實驗動物中心提供)、瓶裝自來水喂養(yǎng)。

1.2主要試劑及藥品雷諾考特(布地奈德鼻噴霧劑)，購自于南華大學附屬南華醫(yī)院；高純卵清蛋白(ovalbumin，OVA)V級，購自于美國Sigma公司；甲苯胺藍染色液，乙二胺四乙酸(EDTA)，P物質(zhì)抗體，SP免疫組化學試劑盒，DAB顯色試劑盒，氫氧化鋁瓶裝佐劑等均購自于北京博奧森生物技術有限公司。

1.3動物模型的制備及處理30只健康雄性豚鼠抽簽均分為正常對照組、糖皮質(zhì)激素(布地奈德噴鼻劑)治療干預組和變應性鼻炎模型組。變應性鼻炎模型組和布地奈德治療干預組，參照經(jīng)典動物造模方法,①基礎致敏：腹腔內(nèi)隔日注射7次，注射液是以卵清蛋白(ovalbu-min，OVA)0.3 mg+Al(OH)330 mg+生理鹽水1 mL現(xiàn)配現(xiàn)用的混懸液；②局部激發(fā)：基礎致敏結(jié)束后第一天即以每側(cè)50 μL的2%OVA溶液滴鼻7天，每日1次。正常對照組同期以Al(OH)330 mg+生理鹽水1 mL等量生理鹽水腹腔注射行基礎致敏，用同量生理鹽水滴鼻局部激發(fā)。造模結(jié)束后立即行癥狀行為學評分并統(tǒng)計分析，模型建立后第1天干預組便開始連續(xù)3周的布地奈德噴鼻治療，劑量20 μg/kg。其余兩組均按體重同期同法生理鹽水噴鼻。

1.4鼻部癥狀評分標準每次鼻腔局部末次激發(fā)后30分鐘內(nèi)觀察并記錄豚鼠鼻周陣發(fā)性劇烈前爪搔鼻動作、噴嚏次數(shù)、鼻涕情況，并參照國內(nèi)學者標準[1]予以評分。在用布地奈德治療的3周時間中，于第7天、第14天、第21天藥物噴鼻后對實驗對象進行同法評分。疊加記分具體方法見表1。

表1 三組大鼠鼻部癥狀學記分標準

1.5鼻黏膜取材、組織病理學切片及組織染色為期3周布地奈德噴鼻干預治療結(jié)束后，用10%水合氯醛溶液(0.1 mL/20 g)行腹腔注射，全身麻醉后，游離取出鼻中隔兩側(cè)鼻黏膜，迅速將取下鼻中隔黏膜固定于4%多聚甲醛中,移入10%乙二胺四乙酸(EDTA)中脫鈣后,常規(guī)石蠟包埋并低溫保存標本、切片，切片厚4～5 μm。根據(jù)試劑盒說明書嚴格按實驗步驟對組織標本進行蘇木素—伊紅(HE)染色、甲苯胺藍染色及P物質(zhì)免疫組化染色。

1.6鼻黏膜中SP的測定結(jié)果判斷:顯微鏡下鼻黏膜上皮及黏膜下組織中出現(xiàn)淺黃色產(chǎn)物為弱陽性，棕黃色為陽性反應,強陽性則表現(xiàn)為深棕色產(chǎn)物。通過計算機圖像分析軟件可得出代表該切片SP表達水平的平均光密度值。平均光密度值與神經(jīng)肽SP的表達呈正相關，鏡下表現(xiàn)染色越深。

1.7統(tǒng)計分析上述數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，應用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件，單因素方差分析方法分析三組間的差異，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 AR模型癥狀造模完成后模型組疊加總分明顯高于對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。進一步干預實驗完成后再次評分，模型組明顯高于對照組和干預組(P<0．05),對照組和干預組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.507)。結(jié)果見表2。

表2 干預前后大鼠癥狀學疊加評分

2.2組織病理學改變

2.2.1 HE染色 各組HE染色見圖1。對照組、干預組及組模型組每高倍視野下嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)分別為1.30±0.95、1.35±0.45、15.27±3.67。模型組可見鼻黏膜纖毛倒伏紊亂，部分有脫落甚至柱狀上皮鱗化或壞死,黏膜下組織間質(zhì)水腫,小血管擴張,大量嗜酸性粒細胞浸潤，一定量的漿細胞、淋巴細胞等多種炎性細胞浸潤。模型組鼻黏膜組織嗜酸性粒細胞計數(shù)分別與對照組和干預組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組及干預組鼻黏膜無明顯水腫,鼻黏膜無明顯嗜酸性粒細胞及炎細胞浸潤。兩組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.282)。見表3。

圖1 三組豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒細胞浸潤情況(HE染色400×)

組別nEOS計數(shù)FP對照組101.30±0.95129.000.00干預組101.35±0.45模型組1015.27±3.67

三組甲苯胺藍染色顯微鏡下攝影見圖2。對照組、干預組及組模型組每高倍視野下肥大細胞浸潤數(shù)分別為1.30±0.52、1.31±0.36、10.02±3.17。模型組可見鼻黏膜纖毛倒伏紊亂，部分上皮脫落，黏膜下組織間質(zhì)水腫,小血管擴張,著色的肥大細胞顏色深且數(shù)量較多，周圍有顆粒狀物圍繞，體積偏大。而對照組、干預組缺少或無著色的肥大細胞。模型組肥大細胞計數(shù)分別與對照組和干預組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組及干預組鼻黏膜無明顯水腫,鼻黏膜缺少或無著色的肥大細胞。兩組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.463)。見表4。

圖2 三組豚鼠鼻黏膜肥大細胞浸潤情況(甲苯胺藍染色400×)

2.2.2 鼻黏膜中SP的免疫組化 三組SP免疫組化染色見圖3。三組大鼠鼻粘膜中SP的光密度表達值見表5。鼻黏膜上皮細胞及其周圍、固有層小血管、腺體周圍及浸潤于鼻粘膜的炎性細胞及其周圍有SP的表達。光鏡下為SP所在部位出現(xiàn)棕黃色陰影為陽性部位，強陽性則呈深棕色，淺黃色為弱陽性。對照組與干預組鼻黏膜上皮細胞及其周圍、固有層小血管、腺體周圍及浸潤于鼻粘膜的炎性細胞及其周圍SP的表達成弱陽性。模型組大鼠鼻黏膜中上述部位的陰影較對照組及干預相比明顯增強。應用圖像分析軟件后可知模型組鼻黏膜中SP的平均光密度半定量值明顯高于對照組和干預組,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；對照組與干預組兩組之間平均光密度半定量值差異無統(tǒng)計學意義(P=0.130)。

表4 豚鼻黏膜組織肥大細胞計數(shù)

表5 三組大鼠鼻粘膜中SP的平均光密度表達值

圖3 三組豚鼠鼻黏膜P物質(zhì)情況(免疫組化染色400×)

2.3 P物質(zhì)與嗜酸性粒細胞及肥大細胞的相關性分析將20只AR模型(干預組及模型組)視為一整體進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)鼻黏膜中P物質(zhì)表達與變應性鼻炎嗜酸性粒細胞浸潤呈正相關，兩者散點圖見圖4A；P物質(zhì)表達與變應性鼻炎鼻黏膜中肥大細胞浸潤也呈正相關(r=0.780,P<0.05)，兩者散點見圖4B。

圖4 散點圖 A:P物質(zhì)與嗜酸性粒細胞;B:P物質(zhì)與肥大細胞

3 討 論

目前認為這些神經(jīng)肽通過相應的受體作用于鼻粘膜的靶位點(相關炎性細胞)調(diào)控細胞基因的表達，通過促進細胞因子及細胞間黏附分子的合成來介導變應性炎癥的發(fā)生發(fā)展[3]。Chalastras[4]等研究發(fā)現(xiàn)在變應性鼻炎患者的鼻粘膜中P物質(zhì)和血管活性腸肽(VIP)表達明顯增高，認為其在變應性鼻炎的免疫和超敏反應神經(jīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Kavut[5]等研究證實了類似結(jié)論，證明變應性鼻炎患者的鼻粘膜中P物質(zhì)表達增高，其發(fā)揮著重要作用。

本實驗選取4～6周雄性大鼠，選用OVA行基礎致敏及鼻內(nèi)激發(fā)兩個階段，建立AR大鼠模型。造模結(jié)束后的癥狀行為學評分，模型及藥物干預組豚鼠均激發(fā)出典型的AR癥狀。本研究應用HE染色及甲苯胺藍染色觀察AR模型鼻黏膜的病理組織改變情況，發(fā)現(xiàn)致敏組小鼠的鼻黏膜上皮細胞脫落、基底膜增厚，黏膜下間質(zhì)水腫，局部微血管擴張，固有層內(nèi)可見特征性的嗜酸性粒細胞浸潤，肥大細胞浸潤。鼻嗜酸性粒細胞、肥大細胞計數(shù)結(jié)果均提示AR模型造模成功。在模型組大鼠的鼻粘膜中，我們通過研究證實其P物質(zhì)表達明顯增高，且通過相關性分析發(fā)現(xiàn)鼻粘膜中P物質(zhì)表達與嗜酸性粒細胞和肥大細胞數(shù)量有統(tǒng)計學相關性，表明P物質(zhì)作為重要的神經(jīng)肽在變應性鼻炎的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要意義，推測其可能促進變態(tài)反應炎性效應細胞的浸潤過程或炎性細胞通過產(chǎn)生P物質(zhì)來參與發(fā)病過程。國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)在變應性鼻炎鼻黏膜中浸潤的肥大細胞周圍有密集的肽能神經(jīng)纖維末梢,肥大細胞被甲苯胺藍染色陽性的同時證實其周圍亦有SP物質(zhì)免疫組織化學染色陽性陰影,認為這些肽能神經(jīng)纖維能夠作用于肥大細胞,通過肥大脫顆粒而釋放組胺、白三烯等炎性介質(zhì)，而肥大細胞所產(chǎn)生的組胺、白三烯等又可刺激肽能神經(jīng)纖維末梢，促進SP與降鈣素基因相關肽(CGRP)的進一步分泌[6]。肥大細胞還可通過釋放類胰蛋白酶激活肽能神經(jīng)表面的蛋白酶激受體-2，促進起合成并釋放SP等神經(jīng)肽，此項實驗有力的肯定了肥大細胞與局部神經(jīng)末梢之間的確存在著結(jié)構(gòu)上和功能上的密切聯(lián)系[7]。肥大細胞與神經(jīng)肽之間相互作用模式豐富了對變應性鼻炎的認識。

國外研究揭示糖皮質(zhì)激素噴鼻可通過減少神經(jīng)肽含量來改善變應性鼻炎患者的臨床癥狀，但兩者間的具體作用機制人在探索當中[8]。在變應性鼻炎結(jié)膜炎患者中，糖皮質(zhì)激素噴鼻治療后測得其淚液中SP值明顯下降，且眼結(jié)膜變應性炎癥癥狀明顯改善[9]。本研究組經(jīng)3周的糖皮質(zhì)激素治療干預后,干預組切片HE染色、甲苯胺藍染色和SP神經(jīng)肽免疫組織化學染色顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)大鼠鼻黏膜上皮細胞及其周圍、固有層小血管、腺體周圍的炎性細胞減少及其周圍代表有SP的表達的平均光密度顏色變淡，表明鼻用激素的應用能有效一致鼻腔粘膜變態(tài)反應性炎癥，其效應細胞如嗜酸性粒細胞和肥大細胞明顯減少，同時P物質(zhì)表達也顯著降低，P物質(zhì)和嗜酸性粒細胞以及肥大細胞的表達同樣具有一致性，這一結(jié)論一方面表明了三者在致病過程中的重要關聯(lián)，另一方面表明P物質(zhì)在藥物治療過程中可能也是藥物作用的重要靶點或效應之一。我們通過此研究證實了糖皮質(zhì)激素抑制變應性炎癥的機制與神經(jīng)肽表達存在關聯(lián)，其具體機制還需要進一步相關研究闡明。

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Effectofglucocorticoidontheinfiltrationofeosinophils,mastcellsandSPinnasalmucosaofguineapigswithallergicrhinitis

CHEN Zuyao,LUO Zhikui,ZHU Famei，et al

(DepartmentofOtorhinolaryngology，NanhuaHospitalAffliatedtotheUniversityofSouthChina，Hengyang421001,Hunan，China)

ObjectiveTo explore the effect of glucocorticoid on the infiltration of eosinophils,mast cells and substance P(SP) in nasal mucosa of guinea pigs with allergic rhinitis (AR).Methods30 of male guinea pigs were divided into normal control group (NG),allergic rhinitis groups (MG) and glucocorticoid treatment intervention group (GG) (n=10).Guinea pig model group set up by intraperitoneal injection of ovalbumin sensitization and bilateral nasal local excitation.GG was treated with glucocorticoid budesonide nasal spray treatment for 3 weeks,NG and MG treated with physiological saline nasal spray processing in the same period.Separation of guinea pigs nasal septum mucosa formaldehyde fixed immediately stained with HE and toluidine blue staining.SP was analysized with immunohistochemical method,and the acidophilic granulocyte and mast cells in nasal septum mucosa were counted under microscope.Immunohistochemical study of substance P average optical density was statistical analyzed.Resultscompared with the NG,semeiology scores of MG was meet the criteria for the diagnosis of allergic rhinitis,and have obvious eosinophils and mast cells infiltration.Compared to the MG,every index and symptom in GG was improved.ConclusionLocal application of budesonide can relieve symptoms of AR,reduce tissue inflammatory reaction,which may relate to inhibit the release of the SP of rhinitis nasal mucosa.

allergic rhinitis; eosinophils; mast cells; Substance P

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.004

2016-12-19；

2017-01-23

湖南省教育廳科研項目(13C803).

R765.21

A

秦旭平)