血管緊張素Ⅱ2型受體活化促進(jìn)缺氧/復(fù)氧損傷PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)

，，，，，，，*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014級(jí)卓越醫(yī)師班)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

血管緊張素Ⅱ2型受體活化促進(jìn)缺氧/復(fù)氧損傷PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)

莫中成1，彭鳳玲2，張梅英3，歐含笑1，謝遠(yuǎn)杰1，陳賽男3，石金鳳1，龍雙漣1*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014級(jí)卓越醫(yī)師班)

目的探討血管緊張素Ⅱ2型受體(AT2R)活化對(duì)缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷PC12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

方法PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征。將PC12細(xì)胞用連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)處理后復(fù)制H/R損傷的神經(jīng)細(xì)胞模型；H/R損傷PC12細(xì)胞分別予以AT2R拮抗劑(PD123319)、AT2R激動(dòng)劑(CGP42112)進(jìn)行處理，采用MTT法觀察細(xì)胞存活率的變化；以逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果PC12細(xì)胞經(jīng)40mmol/LNa2S2O4處理1 h后，MTT法檢測(cè)的細(xì)胞存活率約為55～60%，提示復(fù)制H/R損傷模型成功；H/R損傷PC12細(xì)胞經(jīng)CGP42112處理后，細(xì)胞存活率顯著增高，而B(niǎo)ax mRNA 表達(dá)下調(diào)，Bcl-2 mRNA 表達(dá)上調(diào)；而PD123319處理后，細(xì)胞存活率顯著下降， Bax mRNA 表達(dá)上調(diào)，Bcl-2 mRNA 表達(dá)則下調(diào)。結(jié)論AT2R活化可改善H/R損傷的PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)理可能與其上調(diào)Bcl-2/Bax的比值有關(guān)。

血管緊張素Ⅱ2型受體； PC12細(xì)胞； 缺氧/復(fù)氧損傷； 凋亡

缺血性腦血管病系顱內(nèi)血液循環(huán)障礙導(dǎo)致腦組織損傷的一類疾病，它具有發(fā)病率高，致殘致死率高的特點(diǎn)。目前臨床治療仍以溶栓重建腦血流為主，但再灌注的同時(shí)又會(huì)進(jìn)一步加重缺血腦組織的病理?yè)p害，甚至不可逆，也就是缺血/再灌注損傷[1-2]。血管緊張素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是腎素—血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)中主要活性分子，可分為AngⅡ-1型受體(AT1R)和AngⅡ-2型受體(AT2R)[3]，其中AT2R與AngⅡ相互作用可對(duì)缺血性腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[4]。研究顯示，在腦缺血/再灌注損傷中，神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡是其主要的表現(xiàn)[5]，而有研究發(fā)現(xiàn)AT2R激動(dòng)劑CGP42112對(duì)氧糖剝奪后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起保護(hù)作用[6]。在凋亡研究中，Bax和 Bcl-2 分別作為促凋亡基因和抑凋亡基因一直是研究熱點(diǎn)，它們?cè)诩?xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。本研究以腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株(PC12細(xì)胞)為對(duì)象[8]，用化學(xué)性缺氧劑連二亞硫酸鈉 ( Na2S2O4)處理PC12細(xì)胞，復(fù)制H/R損傷神經(jīng)細(xì)胞模型，探討AT2R活化對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1試劑PC12細(xì)胞受贈(zèng)于南華大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所；四氮唑鹽(MTT)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，2×Taq PCR Mastermix購(gòu)自上海市碧云天生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)沙市佳和生物科技有限責(zé)任公司，Bax、Bcl-2、GAPDH引物均由上海生工公司合成，羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司，PD123319購(gòu)自美國(guó)Abcam公司， CGP42112購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，GAPDH購(gòu)自美國(guó)CST公司，高糖DMEM培養(yǎng)基、無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料責(zé)任有限公司；其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及H/R損傷細(xì)胞模型的建立PC12細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗三次，加入新鮮配制含40 mmol/L Na2S2O4的無(wú)糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基于無(wú)菌培養(yǎng)瓶或孔中，37 ℃、5% CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育。1小時(shí)后取出細(xì)胞，用無(wú)菌PBS洗三次，加入新鮮含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。

1.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率取2×104個(gè)/mL PC12細(xì)胞按200 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，更換培養(yǎng)液，每孔分別加入不同濃度無(wú)菌Na2S2O4(終濃度為0，10，20，40，60 mmol/L)，每一濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。1小時(shí)后每孔加20 μL 5 mg/mL噻唑藍(lán)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h。小心吸棄孔內(nèi)液體。每孔加入150 μL二甲基亞砜，在微型混勻器上振蕩10 min，待結(jié)晶物完全溶解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)各孔的光密度值(OD值)，結(jié)果分別以相應(yīng)的調(diào)零孔標(biāo)化。設(shè)定對(duì)照組吸光度代表的細(xì)胞存活率為100 %，按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.4臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化細(xì)胞分為空白組、Na2S2O4組。空白組細(xì)胞正常培養(yǎng)；Na2S2O4組細(xì)胞用40 mmol/L Na2S2O4處理 1 小時(shí)后復(fù)氧，繼續(xù)孵育1小時(shí)后細(xì)胞經(jīng)無(wú)菌 PBS 洗滌三次后，加入約100 μL 0.4% 臺(tái)盼藍(lán)，靜置染色3分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用預(yù)冷TRIzoL試劑提取細(xì)胞內(nèi)RNA，按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。按照2×Taq PCR Mastermix試劑盒設(shè)定逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)程序。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，計(jì)算灰度值并進(jìn)行半定量分析。所用引物序列如表1。

表1 引物序列

1.6圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法圖片均采用Image J軟件分析并處理。所有計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05判定差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1復(fù)制H/R損傷細(xì)胞模型

2.1.1 Na2S2O4抑制PC12細(xì)胞的生長(zhǎng) 采用 MTT 法檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，不同濃度Na2S2O4(0、10、20、30、40、50、60 mmol/L)處理后，PC12細(xì)胞存活率下降，并且呈濃度依賴性。40 mmol/L Na2S2O4處理 1 小時(shí)細(xì)胞的存活率為55～60% (圖 1 A) 。然后，以 40 mmol/L的 Na2S2O4處理細(xì)胞不同時(shí)間(0、15、30、45、60、75、90 min)后，PC12細(xì)胞的存活率隨著 Na2S2O4作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，呈時(shí)間依賴性(圖1 B)。我們選用 40 mmol/L Na2S2O4處理 1 小時(shí)后復(fù)氧以復(fù)制H/R損傷細(xì)胞模型。

圖1 Na2S2O4對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響與空白組比較， *:P<0.05，**:P<0.001

2.1.2 臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化 細(xì)胞經(jīng)40 mmol/L Na2S2O4處理 1 小時(shí)后復(fù)氧，繼續(xù)孵育1小時(shí)后采用臺(tái)盼藍(lán)染色后顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白(對(duì)照)組 PC12 細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，細(xì)胞突起細(xì)長(zhǎng)有分支，呈典型的神經(jīng)細(xì)胞顯微形態(tài)特征；而Na2S2O4組細(xì)胞皺縮變圓，突起收縮，甚至消失，死亡細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞拒染呈無(wú)色透明狀(圖2)。

2.2 AT2R活化促進(jìn)H/R損傷PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)

2.2.1 AT2R激動(dòng)劑增加H/R損傷PC12細(xì)胞的存活率 CGP42112是AT2R的一種特異激動(dòng)劑。復(fù)制H/R損傷模型后，采用MTT 法檢測(cè) PC12 細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，采用不同濃度CGP42112(0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)處理H/R損傷PC12細(xì)胞，細(xì)胞存活率隨激動(dòng)劑濃度的增加而逐漸升高(圖3 A)；以10-6mol/L CGP42112處理H/R損傷PC12細(xì)胞不同時(shí)間(0、1、2、3 h)，細(xì)胞存活率逐漸增加(圖3 B)。

圖2：臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞活力變化(200×)A：空白組，B：Na2S2O4組

圖3 CGP42112對(duì)H/R損傷PC12 細(xì)胞存活率的影響與空白組比較，#:P<0.001；與H/R組比較，*:P<0.05

2.2.2 AT2R激動(dòng)劑上調(diào)H/R損傷PC12細(xì)胞Bcl-2mRNA表達(dá)，下調(diào)Bax mRNA表達(dá) 采用RT-PCR檢測(cè)H/R損傷PC12 細(xì)胞中Bax、Bcl-2 mRNA 表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度CGP42112(0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)處理H/R損傷PC12細(xì)胞，隨著 CGP42112 濃度的升高，Bax mRNA 表達(dá)下調(diào)(圖4)、Bcl-2 mRNA 表達(dá)則上調(diào)(圖5)。

圖4 不同濃度CGP42112對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞中Bax mRNA表達(dá)的影響與空白組比較，#:P<0.001；與H/R組比較，*:P<0.05

圖5 不同濃度CGP42112對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響與空白組比較，#:P<0.001；與H/R組比較，*:P<0.05

采用10-6mol/L CGP42112處理H/R損傷PC12細(xì)胞不同時(shí)間(0、1、2、3 h)后，隨著CGP42112 作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Bax mRNA 表達(dá)下調(diào)(圖6)，而B(niǎo)cl-2 mRNA 表達(dá)則上調(diào)(圖7)。

2.3 AT2R抑制抑制H/R損傷PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)

2.3.1 AT2R抑制劑減弱H/R損傷PC12細(xì)胞存活率 PD123319是一種AT2R特異性抑制劑。建立H/R損傷模型后，采用MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度PD123319(0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)使H/R損傷PC12細(xì)胞存活率下降，且呈濃度效應(yīng)(圖8A)；采用10-6mol/L PD123319處理H/R損傷PC12細(xì)胞不同時(shí)間(0、1、2、3 h)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率也逐漸下降(圖8B)。

圖6 CGP42112作用不同時(shí)間對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞中Bax mRNA表達(dá)的變化與空白組比較，#:P<0.001；與H/R組比較，*:P<0.05

圖7 CGP42112作用不同時(shí)間對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)的變化與空白組比較，#:P<0.001；與H/R組比較，*:P<0.05

2.3.2 AT2R抑制劑下調(diào)H/R損傷 PC12 細(xì)胞Bcl-2mRNA表達(dá)，上調(diào)Bax mRNA表達(dá) 為了進(jìn)一步觀察 AT2R 對(duì)H/R損傷 PC12 細(xì)胞中 Bax、Bcl-2 mRNA 表達(dá)的影響，在建立H/R損傷模型后，采用PD123319處理細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA 的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，采用不同濃度PD123319(0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)處理H/R損傷PC12細(xì)胞，隨著 PD123319 濃度的升高，Bax mRNA 表達(dá)量上調(diào)(圖9)，而B(niǎo)cl-2 mRNA 表達(dá)量下調(diào)(圖10)。

圖8 PD123319對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞存活率的影響與空白組比較，#:P<0.001；與H/R組比較，*:P<0.05

圖9 不同濃度PD123319對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞中Bax mRNA表達(dá)的影響與空白組比較，#:P<0.01；與H/R組比較，*:P<0.05

采用10-6mol/L PD123319處理H/R損傷PC12細(xì)胞不同時(shí)間(0、1、2、3 h)，隨著PD123319 作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Bax mRNA 表達(dá)上調(diào)(圖11)，而B(niǎo)cl-2 mRNA 表達(dá)下調(diào)(圖12)。

3 討 論

缺血性腦病是最常見(jiàn)的腦血管疾病，也是人類致殘和致死的主要原因之一，其病理生理過(guò)程主要涉及因缺血造成的初次和/或二次損傷，即缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[9]。目前，對(duì)于缺血性腦病缺血后的初始損傷和后續(xù)的繼發(fā)性損傷的病理生理機(jī)制尚未完全闡明，因此，探討其發(fā)病機(jī)制和發(fā)展新的治療方法備受關(guān)注。

圖10 不同濃度PD123319對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響與空白組比較，#:P<0.01；與H/R組比較，*:P<0.05

圖11 PD123319作用不同時(shí)間對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)的影響與空白組比較，#:P<0.001；與H/R組比較，*:P<0.05

圖12 PD123319作用不同時(shí)間對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響與空白組比較，#:P<0.001；與H/R組比較，*:P<0.05

RAS與心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的功能密切相關(guān)，在許多疾病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。AngⅡ是RAS中主要的生物活性成分之一，主要有 AT1R 和 AT2R 兩種G蛋白偶聯(lián)受體亞型。研究表明，AngⅡ 依賴于 AT2R 對(duì)缺血誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用[10]。Iwanami等研究發(fā)現(xiàn)，造血細(xì)胞中的 AT2R 對(duì)中風(fēng)后神經(jīng)系統(tǒng)有重要的保護(hù)作用[11]。AT2R激動(dòng)劑CGP42112對(duì)糖剝奪后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起保護(hù)作用，且能改善梗死區(qū)細(xì)胞功能。然而，AT2R 在大腦中的調(diào)節(jié)功能尚未闡述清楚。本實(shí)驗(yàn)首先復(fù)制了H/R損傷 PC12 細(xì)胞模型，并在研究中發(fā)現(xiàn)，AT2R 激動(dòng)劑能促進(jìn)H/R損傷 PC12 細(xì)胞的存活，而 AT2R 抑制劑則使H/R損傷 PC12 細(xì)胞存活率下降，且這種作用呈時(shí)間和濃度依賴性。這些結(jié)果表明AT2R 活化能促進(jìn)H/R損傷 PC12 細(xì)胞的存活。

研究顯示，凋亡相關(guān)基因的表達(dá)可受許多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控而影響細(xì)胞的凋亡過(guò)程[12]。Bax作為促凋亡基因，它能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而B(niǎo)lc-2則能抑制各種刺激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13]。在缺血性腦血管疾病中，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化能誘導(dǎo)Bcl-2/Bax表達(dá)比值增加，從而抑制缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[14-15]。在短暫腦缺血后缺血區(qū)域，Bax表達(dá)明顯上調(diào)，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)則下調(diào)；在再灌注后腦皮質(zhì)缺血半暗帶的胞漿部分促凋亡基因Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)[16]。Bax和Bcl-2之間的平衡決定著腦缺血中神經(jīng)元的存活狀態(tài)[17]。在研究中我們發(fā)現(xiàn)，AT2R激動(dòng)劑能使Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)比值增加；相反，AT2R抑制劑使Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)比值減少，這些結(jié)果提示AT2R活化可增加Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)的比值。也有研究發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血/再灌注后糾正高碳酸血癥可通過(guò)增加Bcl-2蛋白及減弱Bax蛋白的表達(dá)改善空間記憶和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙[18]，這也與調(diào)控Bcl-2/Bax表達(dá)進(jìn)而影響神經(jīng)元的凋亡相關(guān)。

綜上所述，通過(guò)對(duì)H/R損傷的PC12細(xì)胞模型的研究表明，AT2R活化后可使H/R損傷PC12細(xì)胞的存活率增加，Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)比值上升，提示，AT2R活化可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2/Bax的表達(dá)，增加Bcl-2/Bax表達(dá)比值而保護(hù) H/R損傷PC12細(xì)胞，抑制其凋亡的發(fā)生。

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AngiotensinIItype2receptoractivationpromotesthegrowthofPC12cellsinducedbyhypoxia/reoxygenation

MO Zhongcheng,PENG Fengling,ZHANG Meiying,et al

(DepartmentofHistologyandEmbryology,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the effects of activated angiotensin II type 2 receptor (AT2R) on the growth of PC12 cells induced by hypoxia/reoxygenation (H/R).MethodsPC12 cells were treated with Na2S2O4for 1 h to establish the H/R model.Then the cells were treated with AT2R antagonist (PD123319) or AT2R agonist (CGP42112),respectively.The survival rate of cells was observed by MTT,the expression of Bax/Bcl-2 mRNA was detected through reverse transcription PCR.ResultsThe survival ratio of cells is about 55～60% in the cells treated with 40mmol/L Na2S2O4and shows that the H/R injury model is successfully established in the PC12 cells.Compared with the control groups,the survival rate of cells is increased,Bax mRNA expression is down-regulated and Bcl-2 mRNA expression is up-regulated in the H/R injury PC12 cells treated with CGP42112.While in the H/R injury PC12 cells treated with PD123319,the survival rate of cells is decreased,Bax mRNA expression is up-regulated and Bcl-2 mRNA expression is down-regulated.ConclusionAT2R activation can improve the growth of PC12 cells damaged by H/R,which the mechanism is related with the upregulation of Bcl-2/Bax ratio.

angiotensin II type 2 receptor; PC12 cells; hypoxia/reoxygenation injury; apoptosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.01.009

2016-06-23；

2016-10-28

湖南省自然科學(xué)基金(2016JJ6133)；南華大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(2016NH053XJXZ).

*通訊作者，E-mail:898381647@qq.com.

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秦旭平)