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    黃酒中尿素的酶法降解應用研究

    2017-12-22 08:57:03李由然吳志勇石貴陽江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室江南大學生物工程學院
    食品安全導刊 2017年33期
    關鍵詞:脲酶黃酒緩沖液

    □ 李由然 吳志勇 石貴陽 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室;江南大學 生物工程學院

    黃酒中尿素的酶法降解應用研究

    □ 李由然 吳志勇 石貴陽 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室;江南大學 生物工程學院

    在黃酒生產(chǎn)中使用脲酶降解尿素有望成為控制氨基甲酸乙酯(EC)的含量的有效手段。本研究選取日本清酒生產(chǎn)用商品化脲酶NAGAPSIN,在考察了其基于溫度和pH的酶學性質(zhì)及各因素對酶降解尿素影響的基礎上探索了該酶在降解成品黃酒中尿素中的應用。結(jié)果顯示該酶的作用最適溫度為30oC,最適作用pH為4.4;在低溫及酸性條件下具有較好的穩(wěn)定性。在成品黃酒中的效果驗證表明,30 U/L的脲酶既可于2 d內(nèi)降解約80%的尿素,且殘余酶活易清除?;谝陨辖Y(jié)果,進一步提出了兩種脲酶在實際生產(chǎn)中的應用方案。本研究為黃酒中尿素和EC的酶法控制提供了實驗數(shù)據(jù)支持及實際應用指導。

    黃酒;尿素;氨基甲酸乙酯;脲酶

    黃酒是我國的特有酒種,其低耗糧、低酒度和高營養(yǎng)的釀造酒特質(zhì)契合酒類市場營養(yǎng)保健的消費趨勢,多年來產(chǎn)銷量穩(wěn)步增長。當前我國的黃酒釀造行業(yè)已擺脫了粗放式生產(chǎn)、低價競爭的局面,轉(zhuǎn)而致力于提升產(chǎn)品的品質(zhì)。然而在現(xiàn)有工藝水平下,尿素和重點致癌物質(zhì)氨基甲酸乙酯(EC)含量偏高的問題仍然使整個行業(yè)面臨著嚴峻的食品安全問題[1]。

    黃酒中的尿素主要來源于發(fā)酵過程中酵母的代謝;以之為前體,在發(fā)酵后期和貯酒階段會生成EC[2,3]。目前,國內(nèi)外消除EC的主要方法有工藝優(yōu)化法、代謝工程改造法和酶法[4]。其中酶法通過使用脲酶特異性降解EC的前體-尿素,可有效降低產(chǎn)品中EC的含量。脲酶作為食品添加劑已獲歐盟,美國FDA等批準。同時,相比其他兩種方法,其降解效率高且不改變黃酒的正常生產(chǎn)工藝,被認為是最適宜推廣的EC控制方法[5]。國外多家企業(yè)分別研制了不同微生物來源的脲酶,并已成功應用于葡萄酒、清酒等發(fā)酵食品中EC的控制[6,7]。然而,只有滿足以下兩點要求脲酶才有應用于黃酒行業(yè)的價值:可作用于較低的pH(4.0)和在較高的乙醇濃度(15%)中仍保持生物活性。

    現(xiàn)有研究多關注于不同來源脲酶的催化機理及酶學性質(zhì),其尿素降解效果的數(shù)據(jù)為利用純酶在僅含有底物的理想體系實驗中獲得[8]。而有關商品化食品脲酶降解黃酒中尿素的應用研究僅在2006年由古越龍山采用日本武田公司的脲酶Takeda-AU開展實驗所報道[9],其結(jié)果顯示pH低于4時脲酶的效果已開始降低。在十年之后的今天,我國已著手在黃酒標準中加入尿素和EC含量的指標,隨著國家“黃酒中EC預防控制技術指南”的發(fā)布,脲酶酶法降解作為被納入的一種主要措施,其應用性研究的緊迫性不言而喻。本研究選取了當前在日本清酒行業(yè)中占據(jù)主要市場的食品脲酶NAGAPSIN作為對象,通過對其酶學性質(zhì)及應用于黃酒尿素降解的考察,評估了其實際應用效果,并且提出了適合于我國黃酒生產(chǎn)過程的酶法尿素降解工藝。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑

    尿素、EC、9-羥基噸均為分析純(>99%),購于Sigma公司。尿素和EC分別用無水乙醇為溶劑配制為10 g/L標準溶液,-4℃保存。9-羥基噸用正丙醇為溶劑配制為0.02 mol/L的溶液,避光-4℃保存。乙酸鈉、乙酸、濃鹽酸、無水乙醇和三氯乙酸(TCA)為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司。稱取2.7216 g乙酸鈉溶于1000 mL水中,用1%乙酸調(diào)節(jié)pH至7.2,配制成為0.02 mol/L乙酸鈉溶液。濃鹽酸用分析用水稀釋至1.5 mol/L。TCA用分析用水配制成20%(w/w)的溶液。色譜純乙腈購于ThermoFisher公司。

    1.1.2 儀器設備

    UV2000紫外可見分光光度計,美國UNICO公司;HB-100恒溫金屬浴,杭州博日科技有限公司;GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海精密實驗設備有限公司;Delta 320型pH 計,瑞士Mettler-Toledo 公司;Waters 2695高效液相色譜儀,Waters 2475熒光檢測器,美國沃特斯公司。

    1.1.3 實驗材料

    酸性脲酶:NAGAPSIN,日本長瀨(NAGASE)公司,3500 U/g,出廠批號2656332。稱取0.857 g脲酶樣品溶于1 L蒸餾水中配制成酶液待使用。

    酒樣:市售紹興黃酒產(chǎn)品1和2。

    1.2 方法

    1.2.1 尿素測定方法

    (1)參照文獻進行樣品前處理。500 μL黃酒樣品用乙醇稀釋至1 000 μL,加入 100 μL 1.5 mol/L鹽酸溶液和400 μL0.02mol/L 9-羥基噸溶液,混合均勻后于室溫避光衍生30 min,采用0.22 μm有機系針頭式濾器過濾,待測。

    (2)色譜條件。色譜柱:C18色譜柱(Zorbax SB-Aq 250mm×4.6 mm,5 μm),熒光檢測器:λex=234 nm,λem=600 nm,進樣量:10 μL。流動相A:0.02 mol/L 乙酸鈉(pH7.2),流動相B:乙腈,流速:0.8 mL/min。流動相洗脫梯度參照文獻方法[10]。

    1.2.2 pH對脲酶活力和穩(wěn)定性的影響

    最適作用pH:在1.7 mL 不同pH(2.4、3、3.4、4、4.4、5、5.4、6.7)的緩沖液中分別加入0.8 mL無水乙醇,1 mL 1%尿素溶液和0.5 mL酶液并混勻。于37℃反應30 min后,立即加入4 mL 10%TCA溶液終止反應。剩余的尿素含量用前述方法測定。在這一條件下,1 U定義為1分鐘降解1 μmol尿素所需的酶量。

    pH穩(wěn)定性:將0.5 mL酶液和0.8 mL無水乙醇加入1.7 mL 不同pH(2.4、3、3.4、4、4.4、5、5.4、6.7)的緩沖液中并混勻,每個pH值配制4份。于室溫靜置6 h,期間分別于0、1.5、3.5、6 h的時刻取1份加入1 mL 1%尿素溶液依照前述方法測定脲酶活力。

    1.2.3 溫度對脲酶活力和穩(wěn)定性的影響

    最適作用溫度:在1.7 mL pH4的緩沖液中分別加入0.8 mL無水乙醇,1 mL 1%尿素溶液和0.5 mL酶液并混勻。分別于4、10、16、20、30、40、℃反應30 min后,立即加入4 mL 10%TCA溶液終止反應。剩余的尿素含量用前述方法測定。

    pH穩(wěn)定性:將0.5 mL酶液和0.8 mL無水乙醇加入1.7 mL pH4的緩沖液中并混勻,分別于4、10、16、20、30、40℃靜置72 h,每個溫度配制7份。期間分別于0、2、6、12、24、48、72 h的時刻取1份加入1 mL 1%尿素溶液依照前述方法測定脲酶活力。

    1.2.4 乙醇對脲酶活力的影響

    在前述檢測酶活的反應體系中改變乙醇終濃度分別為0%、5%、10%、15%、 30%、 40%、50%、60%、70%,以1 mL 1%尿素溶液為底物依前述方法檢測不同乙醇濃度下的脲酶活力。

    1.2.5 不同因素對脲酶降解尿素的影響

    在模擬環(huán)境下考察不同pH對脲酶降解尿素的影響,具體實驗方法為:于18 mL反應體系中分別加入0.09 mL 1%尿素溶液、0.18 mL 酶液、3.6 mL無水乙醇以及14.13 mL 不同pH(3、4、5)的緩沖液?;靹蚝蠓盅b于18個1.5 mL EP管中(每管1 mL),置于15℃每天取樣檢測殘留尿素含量,共5 d,每個樣品三個平行。

    在模擬環(huán)境下考察不同溫度對脲酶降解尿素的影響,具體實驗方法為:于35 mL反應體系中分別加入0.175 mL 1%尿素溶液、0.35 mL 酶液、7 mL無水乙醇以及27.475 mL pH4的緩沖液?;靹蚝蠓盅b于35個1.5 mL EP管中(每管1 mL),分別置于0、5、10、15、20℃反應,每天取樣檢測殘留尿素含量,共10 d,每個樣品三個平行。

    在模擬環(huán)境下考察不同尿素初始濃度對脲酶降解尿素的影響,具體實驗方法為:于18 mL反應體系中分別加入0.18 mL 酶液、3.6 mL無水乙醇、14.13 mL pH 4緩沖液以及0.09 mL不同濃度的尿素溶液,使體系中尿素終濃度分別為20、30、 40、50 mg/L。混勻后分裝于18個1.5 mL EP管中(每管1 mL),置于15℃每天取樣檢測殘留尿素含量,共5 d,每個樣品三個平行。

    在模擬環(huán)境下考察不同脲酶添加量對尿素降解的影響,具體實驗方法為:于18 mL反應體系中分別加入0.09 mL 1%尿素溶液、3.6 mL無水乙醇、14.13 mL pH4緩沖液以及0.09 mL不同濃度的酶液,使體系中脲酶終濃度分別為10、20、30、40、50 U/L?;靹蚝蠓盅b于18個1.5 mL EP管中(每管1 mL),置于15℃每天取樣檢測殘留尿素含量,共5 d,每個樣品三個平行。

    1.2.6 脲酶對黃酒中尿素及EC降解能力的考察

    向黃酒樣品中加入終濃度為30 U/L的脲酶,分裝于1.5 mL EP中分別避光靜置于10℃及20℃,每天取樣檢測尿素及EC含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 脲酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

    脲酶樣品在含有20%乙醇的不同pH緩沖液中(2.4、3、3.4、4、4.4、5、5.4、6.7)的催化活力及穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如圖1所示。結(jié)果顯示,在該條件下脲酶的最適作用pH為4.4,其在pH 3.4和pH 4下的活力十分接近最適pH。pH 5以上的條件會嚴重影響酶活,該酶在pH 6.7下幾乎完全失活。對pH穩(wěn)定性的考察顯示,該脲酶在pH2~6.7的較寬范圍內(nèi)均比較穩(wěn)定,6 h后酶活下降有限。

    2.2 脲酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

    脲酶樣品在含有20%乙醇的pH 4緩沖液中置于不同溫度下(4、10、16、20、30、40℃)的催化活力及穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如圖2所示。結(jié)果顯示,從4℃開始隨溫度升高酶活力逐步提高,至30℃為該脲酶的最適作用溫度,40℃時酶活力開始降低。對溫度穩(wěn)定性的考察顯示,該脲酶在所有實驗溫度下均在24 h內(nèi)幾乎完全喪失酶活。

    2.3 脲酶對乙醇的耐受性

    圖1 pH(A)和穩(wěn)定性(B)對脲酶活力的影響,

    圖2 溫度對脲酶活力(A)和穩(wěn)定性(B)的影響

    脲酶在不同乙醇濃度中(0%、5%、10%、15%、30%、40%、50%、60%、70%)的活力如圖3所示。結(jié)果顯示脲酶的活力隨乙醇濃度的提升而降低,而在15%的乙醇濃度下仍可保留超過70%的酶活,這一濃度與黃酒產(chǎn)品中的乙醇濃度相當。

    2.4 pH和溫度對脲酶降解尿素效果的影響

    在含有20%乙醇的初始尿素濃度為50 mg/L的體系中加入30 U/L的脲酶,分別考察了pH 3、4、5時尿素的降解情況,如圖4(A)所示。結(jié)果顯示在pH 4下,脲酶在初始2 d內(nèi)就可降解約70%尿素,進一步延長時間尿素的降解速率逐步減慢,在第5 d尿素最低降至10.8 mg/L。與以上結(jié)果相比,pH 3和pH 5時尿素的降解效果存在顯著差距,表明pH 4為該酶最適宜的作用pH。在同樣實驗條件下,溫度對脲酶降解尿素的效果也有顯著影響,如圖4(B)所示,其中20℃下10 d后尿素殘留量最低(10.2 mg/L)。與前一實驗的結(jié)果相似,初始2 d內(nèi)尿素的降解速度最快,隨后尿素含量保持平穩(wěn)。值得注意的是在0℃的條件下,該脲酶仍具有相當?shù)哪蛩亟到饽芰Γ? d可降解約50%),體現(xiàn)了其在黃酒低溫貯存中應用的潛力。

    2.5 尿素濃度和脲酶量對脲酶降解尿素效果的影響

    圖3 乙醇濃度對脲酶活力的影響

    為了考察脲酶對不同初始濃度尿素降解的效果,實驗設置了含有20、30、40、50 mg/L尿素的反應體系,在20%乙醇存在的條件下,30 U/L脲酶對其降解的效果如圖5(A)所示。結(jié)果顯示在所有測試組中,尿素濃度均在初始2 d內(nèi)快速降低,隨后速度減慢;5 d后的尿素殘留量與初始濃度正相關。為了考察脲酶的合理用量,在含有50 mg/L尿素的反應體系中分別加入10、20、30、40、50 U/L的脲酶,它們的降解結(jié)果如圖5(B)所示。從10 U/L開始,脲酶加量的提升可顯著增強尿素降解效果;至30 U/L后,繼續(xù)提高脲酶加量所產(chǎn)生的效果十分有限。

    圖4 pH(A)和溫度(B)對脲酶降解尿素效果的影響

    2.6 脲酶降解黃酒產(chǎn)品中尿素的效果

    經(jīng)實驗室檢測,黃酒樣品1的基本理化性質(zhì)如表1所示,這些指標表明它們可以代表市售的大部分黃酒產(chǎn)品。

    表1 黃酒樣品的基本理化性質(zhì)

    依據(jù)對脲酶酶學性質(zhì)的考察和模擬尿素降解實驗的結(jié)果設置脲酶加量為30 U/L,分別在10℃和20℃研究脲酶對黃酒產(chǎn)品中尿素和EC降解的實際效果,結(jié)果如圖6所示。脲酶在降解黃酒產(chǎn)品中尿素實驗中所顯示的特性與之前的酶學性質(zhì)考察和模擬降解實驗中保持一致。對于兩種黃酒樣品,脲酶均可以將尿素濃度降低至10 mg/L以下。無論保存在10℃還是20℃,尿素的降解效果均在初始2 d最為顯著,進一步延長時間所帶來的效果提升有限。對EC的檢測結(jié)果也顯示該脲酶對黃酒中已經(jīng)形成的EC幾乎無作用。

    圖6 脲酶對黃酒樣品1和黃酒樣品2中尿素和EC的降解效果

    3 討論

    圖7 脲酶在黃酒生產(chǎn)過程中的應用方案

    脲酶應用于黃酒中尿素的降解具有用量少、效率高、對現(xiàn)有工藝及產(chǎn)品質(zhì)量影響小等優(yōu)勢,這一技術手段已為越來越多的國內(nèi)黃酒制造企業(yè)所認可[11,12]。在歐美及日本,多種脲酶已成功應用于葡萄酒、清酒等發(fā)酵食品中尿素的降解,然而這一酶制劑在黃酒中的應用尚缺乏實驗數(shù)據(jù)支持及實際應用指導。本研究選取了在日本清酒發(fā)酵過程中占主要市場份額的脲酶NAGAPSIN作為研究對象,解析了其基于pH和溫度的酶學性質(zhì);然后又通過模擬尿素降解實驗考察應用的可行性及條件探索;最后基于前兩部分實驗的結(jié)果設計該脲酶在黃酒產(chǎn)品中降解尿素的應用實驗。綜合以上研究結(jié)果,該脲酶在pH及溫度適應性方面非常適宜應用于黃酒。首先,相比較現(xiàn)有報道的另一種脲酶Takemate-AU,其最適pH更接近4這一黃酒的通常pH。其次,該酶達到相同降解效果的用量僅為Takemate-AU的一半左右,更少的用量對產(chǎn)品質(zhì)量造成的影響更小。同時,該酶在低溫范圍內(nèi)的高活性契合了黃酒發(fā)酵和貯存的低溫條件,而在40℃以上的迅速失活又使其作用后易于除去[13]。

    本研究僅選取了黃酒成品用于脲酶的應用實驗,然而其使用方式不僅限于加入黃酒成品。根據(jù)Wu對黃酒發(fā)酵過程中尿素及EC的監(jiān)測[14],發(fā)酵后期所積累尿素在之后的勾兌澄清、煎酒和貯存工段才大量轉(zhuǎn)化為EC。因此,在EC大量形成之前應用脲酶都為時不晚。基于本研究中對脲酶特性的解析,可在黃酒發(fā)酵液壓榨后加入脲酶,作用1~2 d之后利用煎酒時的高溫(>90℃)除去脲酶的參與活力,這一方案不改變現(xiàn)有的黃酒生產(chǎn)工藝,影響產(chǎn)品質(zhì)量的風險也最小,如圖7(A)所示。脲酶應用的另一種方案是在煎酒后形成的半成品酒中加入脲酶,低溫貯藏1~2 d,再通過膜過濾技術除去脲酶后上包裝線,如圖7(B)所示。

    該方案的優(yōu)點是脲酶的用量較小,但是需要額外的膜過濾設備。兩種應用方案都有待于在實際生產(chǎn)過程中進一步的驗證及調(diào)整優(yōu)化。

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    石貴陽。

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