TLR4/NLRP3炎癥復(fù)合體介導(dǎo)對(duì)比劑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥和損傷

林 燕， 林佳瓊， 謝楚莉， 管小鳳， 譚學(xué)賢， 黃澤娜

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1腎內(nèi)科， 2病理科， 廣東 廣州 510150； 3南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室， 廣東 廣州 510515； 4中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 廣東 廣州 510080； 5中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院超聲科， 廣東 廣州 510120； 6廣東省人民醫(yī)院急危重癥醫(yī)學(xué)部， 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 廣東 廣州 510080)

TLR4/NLRP3炎癥復(fù)合體介導(dǎo)對(duì)比劑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥和損傷

林 燕1， 林佳瓊3， 謝楚莉4， 管小鳳5， 譚學(xué)賢2， 黃澤娜6△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院1腎內(nèi)科，2病理科， 廣東 廣州 510150；3南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室， 廣東 廣州 510515；4中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 廣東 廣州 510080；5中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院超聲科， 廣東 廣州 510120；6廣東省人民醫(yī)院急危重癥醫(yī)學(xué)部， 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 廣東 廣州 510080)

目的探討Toll樣受體4(TLR4)/Nod樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥復(fù)合體是否介導(dǎo)了對(duì)比劑(CM)引起的腎小管上皮細(xì)胞炎癥和損傷。方法本研究運(yùn)用碘普羅胺作用于大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E建立損傷模型。應(yīng)用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率；Western blot測(cè)定TLR4、NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、caspase-1和cleaved caspase-3的蛋白水平；ELISA法檢測(cè)炎癥因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和IL-18的水平；Hoechst 33258核染色法檢測(cè)凋亡率；JC-1染色法測(cè)定線粒體膜電位。用小干擾RNA沉默NLRP3表達(dá)。結(jié)果CM可降低NRK-52E細(xì)胞的存活率并上調(diào)cleaved caspase-3的蛋白水平(P<0.05)；此外，CM可上調(diào)細(xì)胞TLR4/NLRP3炎癥復(fù)合體的表達(dá)并促進(jìn)炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌(P<0.05)。沉默NLRP3可以對(duì)抗CM誘導(dǎo)的炎癥因子分泌；TLR4抑制劑TAK-242及沉默NLRP3能減輕CM引起的細(xì)胞凋亡和線粒體功能損傷。結(jié)論TLR4/NLRP3炎癥復(fù)合體參與了CM致急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制，并介導(dǎo)了CM誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷和炎癥。

對(duì)比劑； 腎損傷； 炎癥； Toll樣受體4； Nod樣受體蛋白3炎癥復(fù)合體

隨著介入、多層螺旋CT和三維重建技術(shù)的發(fā)展，對(duì)比劑(contrast media，CM)在診斷治療中得到廣泛應(yīng)用，而對(duì)比劑致急性腎損傷(contrast-induced acute kidney injury，CIAKI)也日漸突出。CIAKI是引起院內(nèi)腎功能衰竭的第三大原因，僅次于腎臟灌注不足和腎毒性藥物，占全部醫(yī)院獲得性腎功能衰竭的11%[1-2]。CIAKI的發(fā)生是多因素共同參與的結(jié)果?，F(xiàn)有的研究表明，CIAKI的發(fā)病主要與CM導(dǎo)致腎臟微血管血流動(dòng)力學(xué)改變、CM對(duì)腎小管細(xì)胞的直接毒性、氧化應(yīng)激和炎癥損傷及腎小管梗阻等有關(guān)[3]。其中，炎癥損傷可能是CIAKI發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為模式識(shí)別受體中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，可介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫。TLR4是TLRs家族中極為重要的成員，在非感染性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[4]。TLR4識(shí)別配體后，可以激活下游一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中包括NF-κB通路[5]，激活炎癥反應(yīng)。Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥復(fù)合體(inflammasome)由調(diào)節(jié)亞單位NLRP3、接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speckle-like protein，ASC)及效應(yīng)器caspase-1組成。NLRP3炎癥復(fù)合體目前被視為一種重要的炎癥調(diào)節(jié)因子，NLRP3一旦激活，可使白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18等炎癥因子的前體轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，從而引起炎癥反應(yīng)[6]。而在CIAKI中，TLR4/NLRP3炎癥復(fù)合體是否參與了炎癥的激活并進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞的凋亡，目前仍無(wú)相關(guān)研究。

因此，本研究應(yīng)用臨床上運(yùn)用最為廣泛的含碘對(duì)比劑碘普羅胺(iopromide)損傷大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，建立CIAKI模型，并探討TLR4/NLRP3炎癥復(fù)合體在CM誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷和炎癥中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

碘普羅胺注射液370(碘濃度為370 g/L，表示為370 g I/L)由Bayer提供；抗TLR4、NLRP3和ASC 抗體購(gòu)自Abcam；抗caspase-1及cleaved caspase-3 抗體購(gòu)自CST；抗GAPDH抗體、多克隆羊抗兔 II抗、多克隆羊抗小鼠 II 抗及多克隆驢抗羊 II 抗購(gòu)自Proteintech；TLR4抑制劑TAK-242及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine transfection reagent)購(gòu)自Life Technologies；NLRP3-小干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)由廣州銳博公司供應(yīng)；特級(jí)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；JC-1染液和Hoechst 33258染液由Sigma-Aldrin供應(yīng)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購(gòu)自日本同仁公司；檢測(cè)IL-1β 和IL-18的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供。腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E購(gòu)自廣州吉尼歐公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將NRK-52E細(xì)胞置于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃的條件下傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%的融合狀態(tài)時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)。

2.2損傷模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 應(yīng)用不同濃度(50、100、150和200 g I/L)碘普羅胺以及不同處理時(shí)間(1、2和3 h)作用于NRK-52E細(xì)胞建立損傷模型。選取最佳損傷濃度及最佳損傷時(shí)間后將實(shí)驗(yàn)分為6組：(1)正常對(duì)照(control)組：?jiǎn)渭儾捎肦PMI-1640培養(yǎng)基作用于NRK-52E細(xì)胞；(2)CM損傷(CM)組：用不同濃度CM處理NRK-52E細(xì)胞；(3)CM+TAK-242組：在CM處理前，予以5 μmol/L TAK-242預(yù)處理細(xì)胞1 h；(4)CM+NLRP3-siRNA組：在CM處理前，予以NLRP3-siRNA轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞24 h；(5)TAK-242組：5 μmol/L TAK-242預(yù)處理細(xì)胞1 h后，繼續(xù)予以RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；(6)NLRP3-siRNA組：NLRP3-siRNA轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞24 h后，繼續(xù)予以RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.3CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率 常規(guī)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK-52E細(xì)胞，配成1×108/L的細(xì)胞懸液，96孔板內(nèi)每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，待細(xì)胞密度增長(zhǎng)至80%時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)分組予以細(xì)胞不同處理后，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的存活率，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度(A)值，計(jì)算每組5個(gè)復(fù)孔A值的均數(shù)。按照以下公式計(jì)算：細(xì)胞存活率(%)=處理組A值/對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4Western blot檢測(cè)TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1和cleaved caspase-3的蛋白水平 細(xì)胞根據(jù)分組給予相應(yīng)處理后，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。等量的蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入 I 抗(濃度均為1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜后，加入濃度為1∶5 000的 II 抗稀釋液，室溫下孵育1 h。使用超敏 ECL顯色液，雙色紅外熒光成像系統(tǒng)曝光。ImageJ 1.41軟件分析灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5ELISA法檢測(cè)炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌水平 細(xì)胞按照分組給予不同的處理后，收集培養(yǎng)基作待測(cè)標(biāo)本。ELISA操作流程根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，在終止顯色反應(yīng)后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處A值。以標(biāo)準(zhǔn)品的A值作為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品所對(duì)應(yīng)的濃度值作為縱坐標(biāo)，用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行回歸擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到待測(cè)樣本的濃度，最后將所得的樣本濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6siRNA沉默NLRP3的表達(dá) 將NRK-52E細(xì)胞種植于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染使用說(shuō)明書將NLRP3-siRNA(GCUUCAGCCACAUGACUUUTT)和隨機(jī)非編碼RNA(random non-coding RNA；作為陰性對(duì)照，negative control，NC)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，37 ℃敷箱培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞蛋白，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)沉默效率。

2.7Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相法測(cè)定凋亡細(xì)胞的數(shù)量 細(xì)胞按照分組給予相應(yīng)的處理后，4%多聚甲醛處理10 min，然后加入Hoechst 33258染料緩沖液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野進(jìn)行熒光拍攝，ImageJ 1.41軟件分析各視野平均熒光強(qiáng)度。

2.8JC-1染色熒光顯微鏡照相法檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP) 細(xì)胞按照分組給予相應(yīng)的處理后，加入稀釋的JC-1染液，培養(yǎng)箱中孵育45 min，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野進(jìn)行熒光拍攝，ImageJ 1.41軟件分析各視野紅色熒光強(qiáng)度及綠色熒光強(qiáng)度，并計(jì)算各視野紅/綠熒光強(qiáng)度比值，最后對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組平均紅/綠熒光強(qiáng)度比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CM降低NRK-52E細(xì)胞的存活率并上調(diào)cleaved caspase-3的蛋白水平

不同濃度的CM處理NRK-52E細(xì)胞3 h后降低細(xì)胞的存活率，其中，150及200 g I/L的碘普羅胺處理細(xì)胞3 h可明顯降低細(xì)胞存活率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A；選取150 g I/L(圖1B)及200 g I/L(圖1C)的碘普羅胺分別處理細(xì)胞1 h、2 h和3 h，可降低細(xì)胞的存活率(P<0.05，P<0.01)；此外，150 g I/L及200 g I/L的碘普羅胺處理細(xì)胞3 h還可以上調(diào)cleaved caspase-3的表達(dá)，見圖1D。

2 CM上調(diào)NRK-52E細(xì)胞TLR4及NLRP3炎癥復(fù)合體的表達(dá)

150 g I/L及200 g I/L的碘普羅胺處理細(xì)胞3 h可上調(diào)TLR4的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；NLRP3炎癥復(fù)合體由NLRP3、ASC及caspase-1三部分組成， 150及200 g I/L的碘普羅胺處理細(xì)胞3 h可上調(diào)NLRP3、ASC和caspase-1的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

3 CM促進(jìn)NRK-52E細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌

150及200 g I/L的碘普羅胺處理細(xì)胞3 h，可促進(jìn)NRK-52E細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

4 siRNA下調(diào)NRK-52E細(xì)胞內(nèi)NLRP3的表達(dá)

siRNA作用于NRK-52E細(xì)胞24 h可明顯下調(diào)NLRP3的表達(dá)，較正常對(duì)照組及NC組表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染隨機(jī)非編碼RNA對(duì)NLRP3表達(dá)無(wú)影響，見圖4。

5 沉默NLRP3對(duì)抗CM誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌

在200 g I/L碘普羅胺處理NRK-52E細(xì)胞前，NLRP3-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h能明顯減弱CM誘導(dǎo)的IL-1β和IL-18的分泌，與CM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NLRP3-siRNA預(yù)處理對(duì)IL-1β和IL-18的基礎(chǔ)分泌無(wú)明顯影響，見圖5。

6 TAK-242及沉默NLRP3能減輕CM引起的NRK-52E細(xì)胞凋亡

200 g I/L的碘普羅胺處理NRK-52E細(xì)胞3 h后，細(xì)胞出現(xiàn)了核固縮和熒光增強(qiáng)等凋亡表現(xiàn)，細(xì)胞凋亡率增加，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在CM處理NRK-52E細(xì)胞之前，予以5 μmol/L TAK-242預(yù)處理細(xì)胞1 h，能明顯阻斷CM的致細(xì)胞凋亡作用，與CM組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NLRP3-siRNA預(yù)處理細(xì)胞24 h亦可明顯阻斷CM的致細(xì)胞凋亡作用(P<0.01)；而TAK-242及NLRP3-siRNA預(yù)處理本身不引起細(xì)胞凋亡，見圖6。

Figure 1. CM decreased the cell viability and increased the protein level of cleaved caspase-3 in the NRK-52E cells. A: the cells were treated with indicated concentrations of CM for 3 h; B and C: the cells were treated with 150 g I/L or 200 g I/L CM for indicated time; D: the protein level of cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1CM降低NRK-52E細(xì)胞存活率并上調(diào)cleavedcaspase-3的蛋白水平

Figure 2. CM upregulated the expression of TLR4 and NLRP3 inflammasome in the NRK-52E cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2CM上調(diào)NRK-52E細(xì)胞TLR4及NLRP3炎癥復(fù)合體的表達(dá)

Figure 3. CM induced the releases of IL-1β and IL-18 from the NRK-52E cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3CM促進(jìn)NRK-52E細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β和IL-18

Figure 4. siRNA significantly downregulated NLRP3 expression in the NRK-52E cells determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4siRNA下調(diào)NRK-52E細(xì)胞NLRP3的表達(dá)

7 TAK-242及沉默NLRP3能減輕CM誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞線粒體功能損傷

MMP是檢測(cè)線粒體功能損傷的一項(xiàng)指標(biāo)，MMP降低提示線粒體膜受損。200 g I/L的碘普羅胺處理NRK-52E細(xì)胞3 h后，CM組的紅/綠色熒光強(qiáng)度比值與正常對(duì)照組相比明顯下降(P<0.01)，提示MMP的丟失；在CM處理NRK-52E細(xì)胞之前，予以5 μmol/L TAK-242預(yù)處理細(xì)胞1 h，可使細(xì)胞內(nèi)MMP丟失減少，與CM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NLRP3-siRNA預(yù)處理細(xì)胞24 h亦可對(duì)抗CM從而穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)MMP(P<0.01)；而TAK-242和NLRP3-siRNA預(yù)處理本身不引起細(xì)胞內(nèi)MMP的變化，見圖7。

討 論

本研究應(yīng)用CM損傷腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E建立CIAKI模型，證實(shí)了CM對(duì)腎小管細(xì)胞的損傷作用，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率降低、凋亡率增加、線粒體功能損傷、凋亡蛋白cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào)及炎癥因子IL-1β和IL-18分泌增多。

在各種急慢性腎臟疾病中，TLR4均起著至關(guān)重要的作用。在一項(xiàng)對(duì)慢性腎臟病的研究中[7]發(fā)現(xiàn)，TLR4表達(dá)缺失可使慢性腎臟病大鼠的腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化及血肌酐水平減輕。在缺血再灌注損傷的AKI模型中[8]，腎小管損傷將導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的二次激活，近端及遠(yuǎn)端小管以及集合管中TLR4的表達(dá)均明顯上調(diào)。Nair等[9]應(yīng)用LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷模型亦證實(shí)，抑制大鼠TLR4的表達(dá)可以明顯減少炎癥因子的表達(dá)和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。與以上研究結(jié)果相類似，我們的研究結(jié)果也證實(shí)了CM可顯著上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)。此外，我們進(jìn)一步探討了TLR4與CM所致腎小管上皮細(xì)胞損傷的關(guān)系。經(jīng)CM處理的NRK-52E細(xì)胞中可見細(xì)胞凋亡增加及線粒體膜電位丟失，而運(yùn)用TAK-242可以大大減少這些損傷，表明TLR4的確參與了CM所致的腎小管損傷。

Figure 5. Silencing ofNLRP3 reduced CM-induced releases of IL-1β and IL-18 measured by ELISA. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsCM group.

圖5沉默NLRP3對(duì)抗CM誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β和IL-18分泌

Figure 6. TAK-242 and silencing ofNLRP3 alleviated CM-induced apoptosis of the NRK-52E cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCM group.

圖6TAK-242及沉默NLRP3抑制CM引起的NRK-52E細(xì)胞凋亡

研究顯示[10-11]，NLRP3炎癥復(fù)合體參與了多種AKI疾病的發(fā)生發(fā)展。在敗血癥誘導(dǎo)的AKI模型中[10]，NLRP3敲除可逆轉(zhuǎn)敗血癥導(dǎo)致的低血壓和血清肌酐水平的升高，并減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及炎癥因子的分泌。在橫紋肌溶解的AKI模型中[11]，敲除NLRP3的小鼠炎癥因子表達(dá)水平明顯下降。而在白蛋白刺激腎小管細(xì)胞模型及不同蛋白尿水平的系膜增生性腎小球腎炎患者中均證實(shí)，NLRP3炎癥復(fù)合體參與調(diào)控了白蛋白引起的腎小管損傷[12]。在本研究中，CM誘導(dǎo)了NRK-52E細(xì)胞NLRP3、ASC及效應(yīng)器caspase-1的表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌。研究顯示[13]，NLRP3蛋白的表達(dá)水平是炎癥復(fù)合體激活的限速步驟。而在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中同樣驗(yàn)證，沉默NLRP3后可以明顯減弱CM誘導(dǎo)的IL-1β和IL-18的分泌。Komada等[11]的研究表明，在橫紋肌溶解致急性腎損傷模型中，敲除NLRP3可使凋亡細(xì)胞減少，證實(shí)NLRP3炎癥復(fù)合體與凋亡相關(guān)。與此研究結(jié)果相一致，我們的研究結(jié)果也顯示沉默NLRP3后，CM誘導(dǎo)的損傷，包括細(xì)胞凋亡以及線粒體電位丟失均得到明顯改善。

綜上所述，我們的研究結(jié)果證實(shí)了TLR4/NLRP3炎癥復(fù)合體在CM所致的腎小管上皮細(xì)胞損傷及炎癥中發(fā)揮了非常重要的作用，提示TLR4/NLRP3炎癥復(fù)合體可能成為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，為我們將來(lái)防治CIAKI提供新的治療思路。

Figure 7. TAK-242 and silencing ofNLRP3 attenuated CM-induced MMP loss in the NRK-52E cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCM group.

圖7TAK-242及沉默NLRP3減輕CM誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位丟失

[1] Nash K, Hafeez A, Hou S. Hospital-acquired renal insufficiency[J]. Am J Kidney Dis, 2002, 39(5):930-936.

[2] 王澤敏， 周芳芳， 羅 群， 等. 基因多態(tài)性與急性腎損傷的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2017, 33(1):189-192.

[3] 鄒文博， 蘇津自， 許昌聲， 等. 阿托伐他汀對(duì)碘普羅胺引起的糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(8):1393-1399.

[4] Lucas K, Maes M. Role of the Toll-like receptor (TLR) radical cycle in chronic inflammation: possible treatments targeting the TLR4 pathway[J]. Mol Neurobiol, 2013, 48(1):190-204.

[5] Bohannon JK, Hernandez A, Enkhbaatar P, et al. The immunobiology of Toll-like receptor 4 agonists: from endotoxin tolerance to immunoadjuvants[J]. Shock, 2013, 40(6):451-462.

[6] Schroder K, Tschopp J. The inflammasomes[J]. Cell, 2010, 140(6):821-832.

[7] Souza AC, Tsuji T, Baranova IN, et al. TLR4 mutant mice are protected from renal fibrosis and chronic kidney disease progression[J]. Physiol Rep， 2015, 3(9)：e12558.

[8] 徐曉嫦， 朱 曄， 張慧濤， 等. Notch 通路在大鼠腎臟缺血再灌注損傷TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(3):485-491.

[9] Nair AR, Masson GS, Ebenezer PJ, et al. Role of TLR4 in lipopolysaccharide-induced acute kidney injury: protection by blueberry[J]. Free Radic Biol Med, 2014, 71:16-25.

[10] Cao Y, Fei D, Chen M, et al. Role of the nucleotide-binding domain-like receptor protein 3 inflammasome in acute kidney injury[J]. FEBS J, 2015, 282(19):3799-3807.

[11] Komada T, Usui F, Kawashima A, et al. Role of NLRP3 inflammasomes for rhabdomyolysis-induced acute kidney injury[J]. Sci Rep, 2015, 5:10901.

[12] 丁麗紅， 劉必成， 陳平圣， 等. 白蛋白對(duì)腎小管上皮細(xì)胞中NLRP3炎性體表達(dá)的影響[J]. 中華腎臟病雜志, 2015, 31(10):760-765.

[13] Bauernfeind FG, Horvath G, Stutz A, et al. Cutting edge: NF-κB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression[J]. J Immunol, 2009, 183(2):787-791.

Involvement of TLR4/NLRP3 inflammasome in contrast medium-induced inflammation and injury in renal tubular epithelial cells

LIN Yan1, LIN Jia-qiong3, XIE Chu-li4, GUAN Xiao-feng5, TAN Xue-xian2, HUANG Ze-na6

(1DepartmentofNephrology,2DepartmentofPathology，ThirdAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,China;3DepartmentofMedicalGenetics,SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;4DepartmentofPhysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;5DepartmentofUltrasonography,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;6DivisionofCriticalCareMedicineandEmergency,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail: 506647168@qq.com)

AIM: To investigate whether Toll-like receptor 4 (TLR4) and Nod-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome were involved in contrast medium (CM)-induced inflammation and injury in renal tubular epithelial cells.METHODSIopromide was used to injure NRK-52E cells in the study. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The protein levels of TLR4, NLRP3, apoptosis-associated speckle-like protein (ASC), caspase-1 and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. The releases of interleukin (IL)-1β and IL-18 were detected by ELISA. The apoptotic rate was evaluated by Hoechst staining, and mitochondrial membrane potential (MMP) was analyzed by JC-1 staining. siRNA was transfected into the NRK-52E cells to silenceNLRP3 expression.RESULTSCM decreased the viability of NRK-52E cells (P<0.05). CM also elevated the protein levels of cleaved caspase-3, TLR4, NLRP3, IL-1β and IL-18 (P<0.05). SilencingNLRP3 attenuated CM-induced releases of inflammatory cytokines. Moreover, treatment with TLR4 inhibitor TAK-242 or knockdown ofNLRP3 by siRNA transfection both attenuated cell apoptosis and loss of MMP caused by CM.CONCLUSIONTLR4/NLRP3 inflammasome takes part in the pathogenesis of CM-induced acute kidney injury, and mediates CM-induced injury and inflammation in renal tubular epithelial cells.

Contrast media; Kidney injury; Inflammation; Toll-like receptor 4; Nod-like receptor protein 3 inflammasome

1000- 4718(2017)12- 2252- 07

2017- 06- 26

2017- 08- 02

△通訊作者 Tel: 13570466614； E-mail: 506647168@qq.com

R329.21； R692.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.022

(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)