• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-221通過下調(diào)PTEN促進肺癌A549細胞增殖

    2017-12-22 09:10:10鄭禮平梁翠微杜均祥龔五星
    中國病理生理雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:螢光克隆肺癌

    鄭禮平, 張 楠, 梁翠微, 杜均祥, 龔五星

    (珠海市人民醫(yī)院, 暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院腫瘤科, 廣東 珠海 519000)

    miR-221通過下調(diào)PTEN促進肺癌A549細胞增殖

    鄭禮平△, 張 楠, 梁翠微, 杜均祥, 龔五星

    (珠海市人民醫(yī)院, 暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院腫瘤科, 廣東 珠海 519000)

    目的探討微小RNA-221(miR-221)對肺癌A549細胞增殖的影響及其相關(guān)作用機制。方法通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 把miR-221 mimics轉(zhuǎn)染入肺癌細胞A549 內(nèi),RT-qPCR檢測miR-221和PTEN mRNA的表達;Western blot檢測PTEN蛋白表達;CCK-8及平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力。構(gòu)建含PTEN3’-UTR的螢光素酶報告載體,檢驗miR-221對PTEN的靶向調(diào)控作用。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-221后肺癌細胞中miR-221表達水平明顯高于對照組及空白組(P<0.01),PTEN mRNA及蛋白表達均顯著下降(P<0.05);細胞增殖及集落形成能力明顯增強(P<0.05);miR-221能抑制PTEN的螢光素酶活性。結(jié)論miR-221能夠抑制肺癌A549細胞中PTEN的表達,并促進細胞增殖。

    肺癌; A549細胞; 微小RNA-221; PTEN蛋白; 細胞增殖

    肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年升高趨勢,對人類健康造成重大影響。2015年我國肺癌新發(fā)病例達73.3萬,死亡病例為61萬,發(fā)病率和死亡率均排在我國惡性腫瘤的首位[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一組進化保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA,是人體內(nèi)普遍表達的小型基因調(diào)控因子[2-3]。miRNA能與靶基因mRNA的互補序列結(jié)合,調(diào)控體內(nèi)多種蛋白的表達,對細胞的增殖、分化及凋亡等產(chǎn)生重要影響[4]。miR-221基因定位在X染色體p11.3區(qū)的1 kb區(qū)域內(nèi),屬于成簇分布的miRNA基因。研究發(fā)現(xiàn)miR-221在乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等多種腫瘤均有高表達[5-7],提示miR-221可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們前期運用RT-qPCR技術(shù)檢測了10例肺癌組織及癌旁正常組織中miR-221的表達,結(jié)果顯示癌組織中miR-221是癌旁正常組織中的4.23倍。本課題通過研究miR-221過表達對肺癌A549細胞增殖的影響及作用機制,為肺癌的治療提供新的靶點。

    材 料 和 方 法

    1 材料和試劑

    肺癌細胞株A549購自中國科學(xué)院上海細胞所;RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco;PTEN抗體購自Abcam;miR-221 mimics和miR-NC購自上海吉瑪制藥;CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所;雙螢光素酶檢測試劑盒購自Promega;RNA提取試劑Trizol和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen。

    2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

    肺癌A549細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),37℃、5% CO2、相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中。在細胞生長接近于90%融合時,用胰酶將細胞消化,并吹打成單細胞懸液后收集離心,然后用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋,制成5×108/L的懸液。將細胞轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,在細胞融合為80%~90%時進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前2h更換成無血清的新鮮培養(yǎng)基。實驗分組:實驗組,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics;對照(control)組,轉(zhuǎn)染miR-NC;空白(blank)組,單用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行相應(yīng)轉(zhuǎn)染,在轉(zhuǎn)染24~48 h后收集細胞進行相應(yīng)檢測。

    3 主要方法

    3.1RT-qPCR檢測磷酸酶和張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog protein,PTEN)mRNA及miR-221的表達 在轉(zhuǎn)染24 h后,通過Trizol法進行各組細胞總RNA的提取,后通過紫外分光光度計來檢測RNA的濃度以及純度,控制RNA的純度在1.8~2.0左右。按照RT-qPCR試劑盒給出的操作說明書進行cDNA的合成。擴增反應(yīng)條件設(shè)置為:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,55℃ 延伸20 s,72℃退火20 s,40個循環(huán),以U6作為內(nèi)參照。運用2-ΔΔCt法進行運算分析。

    3.2Western blot檢測PTEN蛋白的表達 在瞬時轉(zhuǎn)染48 h后,按照說明書進行總蛋白的提取,BCA法進行蛋白濃度測定。取各樣品50 μg,進行SDS-PAGE分離,其后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%的脫脂牛奶于搖床上室溫封閉1 h;加入PTEN抗體和GAPDH抗體,在4℃孵育過夜。于次日用TBST在室溫漂洗3次;同樣方法稀釋Ⅱ抗,室溫孵育1 h,TBST進行3次漂洗,最后用ECL化學(xué)發(fā)光法試劑盒進行顯影及曝光。

    3.3CCK-8法檢測細胞增殖 將上述3組對數(shù)期的A549細胞接種在96孔板內(nèi),每孔1 000個細胞。培養(yǎng)24 h,待細胞貼壁后進行轉(zhuǎn)染。分別在轉(zhuǎn)染10、20、30、40、50、60 h后,置換成不含血清的新鮮培養(yǎng)基。后向每孔加入10 μL CCK-8試劑,于37 ℃孵育2 h后終止培養(yǎng)。酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度(A),每組平行重復(fù)5孔,重復(fù)實驗3次。

    3.4平板克隆形成實驗 按LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染,24 h后用胰酶把細胞吹散為單細胞懸液,1 000/孔接種于平皿,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后用多聚甲醛進行固定,1%結(jié)晶紫染色,流水緩慢清洗后于自然環(huán)境干燥。顯微鏡下計算克隆形成數(shù)(含有50個細胞以上的集落為1個克隆):克隆形成率(%)=克隆形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

    3.5雙螢光素酶報告基因檢測 合成含有能夠和相應(yīng)miR-221互補結(jié)合的靶基因PTEN3’-UTR序列片段及突變的3’-UTR序列片段。將這2個片段分別克隆至pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點上。將A549細胞以4×108/L接種在6孔板中。將螢光素酶報告載體與miR-221 mimics及對照序列miR-NC進行共轉(zhuǎn)染,按LipofectamineTM2000說明書進行。在轉(zhuǎn)染48 h后將細胞收集處理,根據(jù)Promega公司雙螢光素酶報告基因進行檢測。

    4 統(tǒng)計學(xué)處理

    用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 miR-221 mimics轉(zhuǎn)染后A549細胞中miR-221表達升高

    RT-qPCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics能夠顯著提高A549細胞中miR-221的表達。實驗組miR-221表達量較空白組明顯升高(P<0.01);對照組和空白組間miR-221含量無明顯差異,見圖1。

    Figure 1. The miR-221 expression in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖1肺癌A549細胞中miR-221的表達

    2 miR-221抑制PTEN的表達

    RT-qPCR結(jié)果顯示,實驗組PTEN的mRNA表達水平較空白組明顯下降,比值是0.33±0.08(P<0.05);對照組和空白組間mRNA含量無明顯差異,見圖2。取PTEN/GAPDH的灰度值比值作為蛋白的相對表達水平,空白組灰度值為1,實驗組及對照組分別為0.31±0.09和0.95±0.11。Western blot顯示實驗組PTEN蛋白水平較對照組和空白組明顯降低(P<0.05),見圖3。

    Figure 2. The mRNA expression of PTEN in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖2肺癌A549細胞PTEN的mRNA表達

    Figure 3. The protein expression of PTEN in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖3肺癌A549細胞PTEN蛋白的表達

    3 miR-221促進A549細胞增殖

    CCK-8實驗顯示,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics的實驗組細胞在30~60 h,吸光度明顯高于對照組及空白組(P<0.05);而對照組及空白組間無明顯差異,見圖4。平板克隆形成實驗顯示,miR-221 mimics組集落形成數(shù)比對照組和空白組明顯增加(P<0.05),而對照組與空白組集落形成數(shù)量之間無統(tǒng)計學(xué)差異,見圖5。

    4 PTEN是miR-221的下游靶基因

    運用生物信息學(xué)軟件TargetScan進行靶基因預(yù)測,顯示PTEN可能是miR-221的下游靶基因。雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,在含野生型PTEN的3’-UTR序列細胞中,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics組與對照組相比,螢光素酶活性明顯下降(P<0.05);而在含突變型PTEN的3’-UTR序列細胞中,實驗組與對照組和空白組的螢光素酶活性無明顯差異,見圖6。

    Figure 4. Proliferation curves of lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖4肺癌A549細胞的增殖曲線

    Figure 5. Flat plate colony formation test results of lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖5肺癌A549細胞的克隆形成率

    Figure 6. The effect of miR-221 on the target sequence ofPTENdetected by luciferase enzymatic activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖6螢光素酶活性檢測miR-221對PTEN靶序列的作用

    討 論

    miRNA是人體內(nèi)長度約22個核苷酸的非編碼雙鏈小RNA。 miRNA能與相應(yīng)的信使RNA的互補序列結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控靶基因的表達,進而在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[8]。在多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程都存在miRNA的表達異常。根據(jù)miRNA對腫瘤細胞的影響,將其分為致癌miRNA和抑癌miRNA。研究發(fā)現(xiàn),即使是同一種miRNA在不同的腫瘤中表達也會有差異,有時甚至截然不同,對腫瘤細胞的影響也千差萬別[9]。前期我們運用PCR技術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)miR-221在肺癌組織中表達較癌旁正常組織明顯增加,提示miR-221可能在肺癌的發(fā)展中起重要作用。

    miR-221在人類組織及細胞中發(fā)現(xiàn)比較早、存在范圍廣泛,并且在多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)其表達異常,其作用得到了越來越多的重視。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中miR-221含量較正常肝細胞明顯升高,其負向調(diào)控細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子CDKN1B/p27以及CDKN1C/p57,促進肝癌細胞增殖[10]。Pallante等[11]通過微陣列芯片分析甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-221在癌組織中顯著升高;而沉默miR-221表達后,癌細胞的增殖水平明顯降低。在本研究中,在A549細胞中轉(zhuǎn)染miR-221 mimics后,肺癌細胞增殖能力明顯升高;集落形成數(shù)比對照組、空白組均明顯增加。這與我們前期發(fā)現(xiàn)miR-221在肺癌組織中表達增加是吻合的。

    為了進一步確定miR-221的下游作用靶點,我們運用了公認的TargetScan靶基因預(yù)測軟件,并結(jié)合相關(guān)文獻,提示第10號染色體缺失的PTEN可能是其作用靶點之一。PTEN是第1個被發(fā)現(xiàn)的有磷酸酶活性的抑癌基因,其編碼的蛋白含有脂質(zhì)磷酸酶及蛋白磷酸酶的雙重特異性酶活性,與腫瘤的關(guān)系密切[12]。研究發(fā)現(xiàn)在肺癌中PTEN表達的缺失會導(dǎo)致其不能抑制PI3K/AKT信號通路,進而促進肺癌的發(fā)展[13]。在人白血病K562細胞中轉(zhuǎn)染PTEN后,細胞生長明顯受到抑制,且能增強青蒿琥酯的抑癌作用[14]。在本實驗中,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics后肺癌細胞中PTEN蛋白及mRNA表達明顯下降,且雙螢光素酶報告基因進一步確定了PTEN為miR-221的下游靶基因。miR-221抑制PTEN表達后會如何影響下游信號通路還需我們進一步地研究。

    綜上所述,本研究通過細胞轉(zhuǎn)染使miR-221在肺癌細胞中過表達,檢測細胞的增殖能力,并進一步探討其作用機制。研究結(jié)果表明miR-221能夠抑制PTEN的表達,進而促進肺癌細胞的增殖。本研究揭示肺癌中miR-221調(diào)控的新機制,有望為肺癌的治療提供可能的作用靶點。

    [1] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2):115-132.

    [2] Carrington JC, Ambros V. Role of microRNAs in plant and animal development[J]. Science, 2003, 301(5631):336-338.

    [3] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2):281-297.

    [4] Hayes J, Peruzzi PP, Lawler S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy[J]. Trends Mol Med, 2014, 20(8):460-469.

    [5] Eissa S, Matboli M, Sharawy A, et al. Prognostic and biological significance of microRNA-221 in breast cancer[J]. Gene, 2015, 574(1):163-167.

    [6] Yang Y, Zhao X, Li HX. MiR-221 and miR-222 simultaneously target ARID1A and enhance proliferation and invasion of cervical cancer cells[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2016, 20(8):1509-1515.

    [7] Wang L, Liu C, Li C, et al. Effects of microRNA-221/222 on cell proliferation and apoptosis in prostate cancer cells[J]. Gene, 2015, 572(2):252-258.

    [8] Abba M, Mudduluru G, Allgayer H. MicroRNAs in can-cer: small molecules, big chances[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2012, 12(7):733-743.

    [9] Tutar L, Tutar E, Tutar Y. MicroRNAs and cancer: an overview[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2014, 15(5):430-437.

    [10] Fornari F, Gramantieri L, Ferracin M, et al. MiR-221 controls CDKN1C/p57 and CDKN1B/p27 expression in human hepatocellular carcinoma[J]. Oncogene, 2008, 27(43):5651-5661.

    [11] Pallante P, Visone R, Ferracin M, et al. MicroRNA deregulation in human thyroid papillary carcinomas [J]. Endocr Relat Cancer, 2006, 13(2):497-508.

    [12] Song MS, Salmena L, Pandolfi PP. The functions and re-gulation of the PTEN tumour suppressor[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(5):283-296.

    [13] Hollander MC, Balogh AR, Liwanag J, et al. Strain-specific spontaneous and NNK-mediated tomorigenesis inPten+/-mice[J]. Neoplasia, 2008, 10(8):866-872.

    [14] 成志勇, 徐 倩, 趙亞玲, 等. 野生型PTEN基因增強青蒿琥酯抑制K562細胞的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(1):112-117.

    miR-221 promotes proliferation of lung cancer A549 cells by down-regulating PTEN

    ZHENG Li-ping, ZHANG Nan, LIANG Cui-wei, DU Jun-xiang, GONG Wu-xing

    (DepartmentofOncology,ZhuhaiPeople’sHospital,ZhuhaiHospitalAffiliatedtoJinanUniversity,Zhuhai519000,China.E-mail:zlpzs1987@126.com)

    AIM: To explore the effect of microRNA-221 (miR-221) on the proliferation of lung cancer A549 cells, and to investigate its mechanism.METHODSThe A549 cells were transfected with miR-221 mimics by Lipofectamine 2000. The expression of miR-221 was detected by RT-qPCR. The expression of PTEN at mRNA and protein le-vels was detected by RT-qPCR and Western blot, respectively. The cell proliferation was examined by CCK-8 assay and colony formation assay. The 3’-UTR ofPTENwas cloned into luciferase reporter vector and its enzymatic activity was detected to verify whether miR-221 targeted toPTEN.RESULTSThe expression level of miR-221 in the A549 cells was significantly increased after transfection with miR-221 mimics as compared with negative control group and blank group (P<0.01). The mRNA and protein levels of PTEN were significantly down-regulated compared with control group and blank group (P<0.05). In addition, miR-221 over-expression significantly promoted the proliferation of A549 cells (P<0.05). Moreover, miR-221 inhibited the enzymatic activity of luciferase reporter vector ofPTEN.CONCLUSIONOver-expression of miR-221 significantly promotes the proliferation ability of human lung cancer A549 cells by down-regulation of PTEN.

    Lung cancer; A549 cells; MicroRNA-221; PTEN protein; Cell proliferation

    1000- 4718(2017)12- 2208- 04

    2017- 05- 15

    2017- 05- 27

    △通訊作者 Tel: 0756-2158932; E-mail: zlpzs1987@126.com

    R734.2; R363

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.015

    (責(zé)任編輯: 林白霜, 羅 森)

    猜你喜歡
    螢光克隆肺癌
    火蟲發(fā)光為什么一閃一閃的
    中醫(yī)防治肺癌術(shù)后并發(fā)癥
    克隆狼
    對比增強磁敏感加權(quán)成像對肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤檢出的研究
    浙江:誕生首批體細胞克隆豬
    流螢之光
    活色螢光“耀”個性
    鳳凰生活(2018年8期)2018-09-03 10:38:12
    流螢之光
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    microRNA-205在人非小細胞肺癌中的表達及臨床意義
    天天操日日干夜夜撸| 国产精品一国产av| 精品一区二区免费观看| 青青草视频在线视频观看| 丰满少妇做爰视频| 亚洲成人一二三区av| 午夜影院在线不卡| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 91国产中文字幕| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品少妇久久久久久888优播| 美国免费a级毛片| 精品少妇内射三级| 人人澡人人妻人| 啦啦啦在线观看免费高清www| 日韩大片免费观看网站| 日韩大片免费观看网站| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 中文字幕精品免费在线观看视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美另类一区| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲精品视频女| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲欧美精品自产自拍| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 五月开心婷婷网| 亚洲国产av新网站| 国产精品一国产av| 国产黄频视频在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 国产成人精品久久久久久| 日韩制服骚丝袜av| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美日韩av久久| 少妇精品久久久久久久| 中文天堂在线官网| 国产视频首页在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美精品一区二区免费开放| 青春草亚洲视频在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 考比视频在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 多毛熟女@视频| 亚洲精品日本国产第一区| 波多野结衣av一区二区av| 夫妻性生交免费视频一级片| 最新在线观看一区二区三区 | 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品女同一区二区软件| 午夜激情久久久久久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 成人国产麻豆网| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久久久久久久久久久大奶| 只有这里有精品99| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产精品免费大片| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 嫩草影院入口| 一本久久精品| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 午夜91福利影院| 毛片一级片免费看久久久久| 精品少妇内射三级| 国产老妇伦熟女老妇高清| 老司机靠b影院| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品 欧美亚洲| 男女边摸边吃奶| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文字幕人妻熟女乱码| 成人国产麻豆网| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 中文字幕色久视频| av在线播放精品| 亚洲精品日本国产第一区| av国产精品久久久久影院| 国精品久久久久久国模美| netflix在线观看网站| 中文字幕高清在线视频| 亚洲国产最新在线播放| 男人爽女人下面视频在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品国产三级国产专区5o| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 嫩草影视91久久| 欧美在线黄色| 久久久久精品人妻al黑| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产成人精品无人区| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲熟女精品中文字幕| 激情五月婷婷亚洲| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产av一区二区精品久久| 日韩大码丰满熟妇| 美女福利国产在线| 欧美97在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产高清国产精品国产三级| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 丝袜美腿诱惑在线| 日韩av免费高清视频| 亚洲一区中文字幕在线| 高清视频免费观看一区二区| 一区在线观看完整版| 日日摸夜夜添夜夜爱| 九九爱精品视频在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久狼人影院| 波多野结衣一区麻豆| 美女福利国产在线| 一区福利在线观看| 午夜日本视频在线| xxxhd国产人妻xxx| 国产成人系列免费观看| 超色免费av| 最近中文字幕高清免费大全6| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久国产精品大桥未久av| 色吧在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 毛片一级片免费看久久久久| 午夜免费观看性视频| 国产黄色免费在线视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日韩av不卡免费在线播放| 国产一区二区 视频在线| 另类精品久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲情色 制服丝袜| 日韩一区二区视频免费看| 免费高清在线观看视频在线观看| 精品国产国语对白av| 国产成人系列免费观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲国产欧美网| 欧美在线黄色| 日本色播在线视频| a 毛片基地| 国产成人一区二区在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久久久久久久久久免费av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 在线观看www视频免费| 90打野战视频偷拍视频| 激情五月婷婷亚洲| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲第一av免费看| 美女主播在线视频| 精品久久久精品久久久| 尾随美女入室| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲,欧美,日韩| 一区二区av电影网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久国产精品大桥未久av| www.精华液| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲成色77777| 国产男人的电影天堂91| 亚洲专区中文字幕在线 | 日韩中文字幕欧美一区二区 | 少妇人妻久久综合中文| 国产精品久久久久久精品电影小说| 深夜精品福利| 大码成人一级视频| 久久久久久人妻| 国产福利在线免费观看视频| av卡一久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品日本国产第一区| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲免费av在线视频| 97精品久久久久久久久久精品| 日本黄色日本黄色录像| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产男人的电影天堂91| 999久久久国产精品视频| 在线看a的网站| 成人漫画全彩无遮挡| 久久精品国产a三级三级三级| 一级片免费观看大全| 日本av手机在线免费观看| 新久久久久国产一级毛片| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久婷婷青草| 精品久久久久久电影网| 国产乱来视频区| 女人久久www免费人成看片| 久久久国产一区二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 日本欧美视频一区| 亚洲欧洲国产日韩| 国产亚洲av高清不卡| 国产免费现黄频在线看| 国产一区二区 视频在线| 在线观看人妻少妇| 国产 一区精品| 午夜福利影视在线免费观看| 黄色一级大片看看| 一边亲一边摸免费视频| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲国产欧美一区二区综合| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲国产日韩一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日本色播在线视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲第一区二区三区不卡| 黄片播放在线免费| av视频免费观看在线观看| 国产一区二区在线观看av| 久久人人爽人人片av| 午夜福利在线免费观看网站| 久久青草综合色| 男人添女人高潮全过程视频| 99久久精品国产亚洲精品| 国产乱来视频区| av.在线天堂| 免费观看性生交大片5| 久久狼人影院| 成人国语在线视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲人成电影观看| 久久久久精品性色| 色网站视频免费| av天堂久久9| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲天堂av无毛| 成年人午夜在线观看视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美女扒开内裤让男人捅视频| 九九爱精品视频在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲伊人色综图| 午夜日本视频在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一边亲一边摸免费视频| 免费黄频网站在线观看国产| 免费观看a级毛片全部| 久久久久精品性色| av.在线天堂| 亚洲精品久久午夜乱码| 尾随美女入室| 国产精品欧美亚洲77777| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 又大又黄又爽视频免费| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 99热全是精品| 午夜日本视频在线| 在现免费观看毛片| 天堂中文最新版在线下载| 黄色毛片三级朝国网站| 国产又色又爽无遮挡免| 男女边吃奶边做爰视频| avwww免费| 色婷婷av一区二区三区视频| 韩国精品一区二区三区| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 大香蕉久久成人网| 老司机在亚洲福利影院| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久 成人 亚洲| 免费看不卡的av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 蜜桃国产av成人99| 91国产中文字幕| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 制服人妻中文乱码| 亚洲成人国产一区在线观看 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 高清黄色对白视频在线免费看| 色播在线永久视频| 黄色一级大片看看| 久久 成人 亚洲| 99re6热这里在线精品视频| 午夜久久久在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 视频区图区小说| 另类精品久久| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久人人爽人人片av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲四区av| 人体艺术视频欧美日本| 日韩免费高清中文字幕av| 大香蕉久久网| 午夜福利视频精品| 伦理电影大哥的女人| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产高清国产精品国产三级| 宅男免费午夜| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日本欧美视频一区| 色综合欧美亚洲国产小说| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 一区福利在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 丰满少妇做爰视频| 欧美最新免费一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 无遮挡黄片免费观看| 两性夫妻黄色片| av不卡在线播放| 成人亚洲欧美一区二区av| 99久久精品国产亚洲精品| 国产日韩欧美视频二区| 国产熟女欧美一区二区| 美国免费a级毛片| 亚洲男人天堂网一区| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲成人免费av在线播放| 日韩伦理黄色片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久精品人人爽人人爽视色| 好男人视频免费观看在线| 宅男免费午夜| 天美传媒精品一区二区| 久热这里只有精品99| 亚洲综合色网址| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲天堂av无毛| 丝袜脚勾引网站| 国产福利在线免费观看视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| videosex国产| 国产1区2区3区精品| 午夜福利一区二区在线看| 成人三级做爰电影| 午夜影院在线不卡| 日韩伦理黄色片| 999久久久国产精品视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美成人午夜精品| 美女大奶头黄色视频| 99久国产av精品国产电影| 午夜福利在线免费观看网站| 久久 成人 亚洲| 五月开心婷婷网| 中文字幕最新亚洲高清| 天天影视国产精品| 国产精品欧美亚洲77777| av在线老鸭窝| 最近最新中文字幕免费大全7| 纯流量卡能插随身wifi吗| 美女大奶头黄色视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美精品一区二区大全| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 蜜桃在线观看..| 国产男人的电影天堂91| 精品一区二区三卡| 久久久久国产一级毛片高清牌| 免费看av在线观看网站| 一区在线观看完整版| 韩国av在线不卡| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 精品少妇久久久久久888优播| 国产av一区二区精品久久| av一本久久久久| 国产免费又黄又爽又色| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产色婷婷99| 国产男人的电影天堂91| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩av免费高清视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产男人的电影天堂91| 久久久精品免费免费高清| 久久久国产一区二区| 97在线人人人人妻| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | netflix在线观看网站| 亚洲国产日韩一区二区| 一级毛片我不卡| 免费观看人在逋| 9191精品国产免费久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 下体分泌物呈黄色| 91国产中文字幕| 99热全是精品| 日韩伦理黄色片| 久久久精品区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久| 大码成人一级视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 老司机影院毛片| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲图色成人| 成人黄色视频免费在线看| 婷婷色综合www| 国产日韩欧美在线精品| 一区二区av电影网| 九色亚洲精品在线播放| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产一区二区 视频在线| 青春草视频在线免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 咕卡用的链子| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 韩国精品一区二区三区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 国产免费又黄又爽又色| 久久免费观看电影| 热re99久久精品国产66热6| 99精品久久久久人妻精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 日本vs欧美在线观看视频| 国产色婷婷99| www.精华液| 国产成人一区二区在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美人与善性xxx| 丝袜美足系列| 51午夜福利影视在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 一区二区av电影网| 日本欧美视频一区| 精品久久蜜臀av无| 国产不卡av网站在线观看| 久久ye,这里只有精品| 国产欧美亚洲国产| 国产1区2区3区精品| 免费观看av网站的网址| 国产熟女欧美一区二区| 中文字幕av电影在线播放| 性高湖久久久久久久久免费观看| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一区二区三区激情视频| 国产黄频视频在线观看| 97在线人人人人妻| √禁漫天堂资源中文www| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲,欧美,日韩| netflix在线观看网站| 人体艺术视频欧美日本| 少妇 在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产一级毛片在线| 看非洲黑人一级黄片| 另类精品久久| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲第一av免费看| 91老司机精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品久久久精品久久久| 欧美xxⅹ黑人| 另类精品久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产日韩欧美视频二区| 久久性视频一级片| 国产亚洲一区二区精品| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 在线观看人妻少妇| 亚洲av福利一区| 熟女av电影| 久久久久久久精品精品| 国产精品二区激情视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 丝瓜视频免费看黄片| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品女同一区二区软件| 中文字幕人妻丝袜制服| 午夜激情av网站| 久久99一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 中文天堂在线官网| 大片免费播放器 马上看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲国产欧美在线一区| 精品国产一区二区三区四区第35| 天堂8中文在线网| 国产在线免费精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 91国产中文字幕| 免费黄频网站在线观看国产| 午夜激情久久久久久久| 黄色视频不卡| 亚洲欧美一区二区三区久久| 麻豆av在线久日| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 最新在线观看一区二区三区 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品一区二区免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲国产av影院在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 我的亚洲天堂| 51午夜福利影视在线观看| 水蜜桃什么品种好| 亚洲人成电影观看| 国产爽快片一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品在线美女| 一区二区av电影网| 亚洲精华国产精华液的使用体验| av在线播放精品| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 性色av一级| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲人成网站在线观看播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 男的添女的下面高潮视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 欧美黄色片欧美黄色片| 卡戴珊不雅视频在线播放| 麻豆av在线久日| 如何舔出高潮| 国产精品 欧美亚洲| 久久精品国产亚洲av涩爱| a级毛片黄视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 免费看av在线观看网站| 亚洲国产av新网站| 亚洲国产精品999| 久久国产亚洲av麻豆专区| 老鸭窝网址在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 成人三级做爰电影| 黄片小视频在线播放| 欧美国产精品va在线观看不卡| 叶爱在线成人免费视频播放| 天堂俺去俺来也www色官网| bbb黄色大片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产成人欧美| 欧美少妇被猛烈插入视频| 色网站视频免费| 97人妻天天添夜夜摸| 极品人妻少妇av视频| 秋霞伦理黄片| 一区二区三区乱码不卡18| 久久人妻熟女aⅴ| 少妇人妻精品综合一区二区| 一本色道久久久久久精品综合| 赤兔流量卡办理| 中文字幕精品免费在线观看视频| 日韩大码丰满熟妇| 国产免费又黄又爽又色| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲精品aⅴ在线观看| 女性被躁到高潮视频| 只有这里有精品99| 亚洲专区中文字幕在线 | 欧美在线黄色| 男男h啪啪无遮挡| 国产熟女欧美一区二区| 久久久久久久大尺度免费视频| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美激情极品国产一区二区三区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 免费在线观看黄色视频的| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 大片免费播放器 马上看| 精品福利永久在线观看| videos熟女内射| 黑人猛操日本美女一级片| 黄频高清免费视频| 嫩草影视91久久| 黑人猛操日本美女一级片|