• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-221通過下調(diào)PTEN促進肺癌A549細胞增殖

    2017-12-22 09:10:10鄭禮平梁翠微杜均祥龔五星
    中國病理生理雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:螢光克隆肺癌

    鄭禮平, 張 楠, 梁翠微, 杜均祥, 龔五星

    (珠海市人民醫(yī)院, 暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院腫瘤科, 廣東 珠海 519000)

    miR-221通過下調(diào)PTEN促進肺癌A549細胞增殖

    鄭禮平△, 張 楠, 梁翠微, 杜均祥, 龔五星

    (珠海市人民醫(yī)院, 暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院腫瘤科, 廣東 珠海 519000)

    目的探討微小RNA-221(miR-221)對肺癌A549細胞增殖的影響及其相關(guān)作用機制。方法通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 把miR-221 mimics轉(zhuǎn)染入肺癌細胞A549 內(nèi),RT-qPCR檢測miR-221和PTEN mRNA的表達;Western blot檢測PTEN蛋白表達;CCK-8及平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力。構(gòu)建含PTEN3’-UTR的螢光素酶報告載體,檢驗miR-221對PTEN的靶向調(diào)控作用。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-221后肺癌細胞中miR-221表達水平明顯高于對照組及空白組(P<0.01),PTEN mRNA及蛋白表達均顯著下降(P<0.05);細胞增殖及集落形成能力明顯增強(P<0.05);miR-221能抑制PTEN的螢光素酶活性。結(jié)論miR-221能夠抑制肺癌A549細胞中PTEN的表達,并促進細胞增殖。

    肺癌; A549細胞; 微小RNA-221; PTEN蛋白; 細胞增殖

    肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年升高趨勢,對人類健康造成重大影響。2015年我國肺癌新發(fā)病例達73.3萬,死亡病例為61萬,發(fā)病率和死亡率均排在我國惡性腫瘤的首位[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一組進化保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA,是人體內(nèi)普遍表達的小型基因調(diào)控因子[2-3]。miRNA能與靶基因mRNA的互補序列結(jié)合,調(diào)控體內(nèi)多種蛋白的表達,對細胞的增殖、分化及凋亡等產(chǎn)生重要影響[4]。miR-221基因定位在X染色體p11.3區(qū)的1 kb區(qū)域內(nèi),屬于成簇分布的miRNA基因。研究發(fā)現(xiàn)miR-221在乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等多種腫瘤均有高表達[5-7],提示miR-221可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們前期運用RT-qPCR技術(shù)檢測了10例肺癌組織及癌旁正常組織中miR-221的表達,結(jié)果顯示癌組織中miR-221是癌旁正常組織中的4.23倍。本課題通過研究miR-221過表達對肺癌A549細胞增殖的影響及作用機制,為肺癌的治療提供新的靶點。

    材 料 和 方 法

    1 材料和試劑

    肺癌細胞株A549購自中國科學(xué)院上海細胞所;RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco;PTEN抗體購自Abcam;miR-221 mimics和miR-NC購自上海吉瑪制藥;CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所;雙螢光素酶檢測試劑盒購自Promega;RNA提取試劑Trizol和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen。

    2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

    肺癌A549細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),37℃、5% CO2、相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中。在細胞生長接近于90%融合時,用胰酶將細胞消化,并吹打成單細胞懸液后收集離心,然后用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋,制成5×108/L的懸液。將細胞轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,在細胞融合為80%~90%時進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前2h更換成無血清的新鮮培養(yǎng)基。實驗分組:實驗組,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics;對照(control)組,轉(zhuǎn)染miR-NC;空白(blank)組,單用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行相應(yīng)轉(zhuǎn)染,在轉(zhuǎn)染24~48 h后收集細胞進行相應(yīng)檢測。

    3 主要方法

    3.1RT-qPCR檢測磷酸酶和張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog protein,PTEN)mRNA及miR-221的表達 在轉(zhuǎn)染24 h后,通過Trizol法進行各組細胞總RNA的提取,后通過紫外分光光度計來檢測RNA的濃度以及純度,控制RNA的純度在1.8~2.0左右。按照RT-qPCR試劑盒給出的操作說明書進行cDNA的合成。擴增反應(yīng)條件設(shè)置為:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,55℃ 延伸20 s,72℃退火20 s,40個循環(huán),以U6作為內(nèi)參照。運用2-ΔΔCt法進行運算分析。

    3.2Western blot檢測PTEN蛋白的表達 在瞬時轉(zhuǎn)染48 h后,按照說明書進行總蛋白的提取,BCA法進行蛋白濃度測定。取各樣品50 μg,進行SDS-PAGE分離,其后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%的脫脂牛奶于搖床上室溫封閉1 h;加入PTEN抗體和GAPDH抗體,在4℃孵育過夜。于次日用TBST在室溫漂洗3次;同樣方法稀釋Ⅱ抗,室溫孵育1 h,TBST進行3次漂洗,最后用ECL化學(xué)發(fā)光法試劑盒進行顯影及曝光。

    3.3CCK-8法檢測細胞增殖 將上述3組對數(shù)期的A549細胞接種在96孔板內(nèi),每孔1 000個細胞。培養(yǎng)24 h,待細胞貼壁后進行轉(zhuǎn)染。分別在轉(zhuǎn)染10、20、30、40、50、60 h后,置換成不含血清的新鮮培養(yǎng)基。后向每孔加入10 μL CCK-8試劑,于37 ℃孵育2 h后終止培養(yǎng)。酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度(A),每組平行重復(fù)5孔,重復(fù)實驗3次。

    3.4平板克隆形成實驗 按LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染,24 h后用胰酶把細胞吹散為單細胞懸液,1 000/孔接種于平皿,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后用多聚甲醛進行固定,1%結(jié)晶紫染色,流水緩慢清洗后于自然環(huán)境干燥。顯微鏡下計算克隆形成數(shù)(含有50個細胞以上的集落為1個克隆):克隆形成率(%)=克隆形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

    3.5雙螢光素酶報告基因檢測 合成含有能夠和相應(yīng)miR-221互補結(jié)合的靶基因PTEN3’-UTR序列片段及突變的3’-UTR序列片段。將這2個片段分別克隆至pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點上。將A549細胞以4×108/L接種在6孔板中。將螢光素酶報告載體與miR-221 mimics及對照序列miR-NC進行共轉(zhuǎn)染,按LipofectamineTM2000說明書進行。在轉(zhuǎn)染48 h后將細胞收集處理,根據(jù)Promega公司雙螢光素酶報告基因進行檢測。

    4 統(tǒng)計學(xué)處理

    用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 miR-221 mimics轉(zhuǎn)染后A549細胞中miR-221表達升高

    RT-qPCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics能夠顯著提高A549細胞中miR-221的表達。實驗組miR-221表達量較空白組明顯升高(P<0.01);對照組和空白組間miR-221含量無明顯差異,見圖1。

    Figure 1. The miR-221 expression in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖1肺癌A549細胞中miR-221的表達

    2 miR-221抑制PTEN的表達

    RT-qPCR結(jié)果顯示,實驗組PTEN的mRNA表達水平較空白組明顯下降,比值是0.33±0.08(P<0.05);對照組和空白組間mRNA含量無明顯差異,見圖2。取PTEN/GAPDH的灰度值比值作為蛋白的相對表達水平,空白組灰度值為1,實驗組及對照組分別為0.31±0.09和0.95±0.11。Western blot顯示實驗組PTEN蛋白水平較對照組和空白組明顯降低(P<0.05),見圖3。

    Figure 2. The mRNA expression of PTEN in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖2肺癌A549細胞PTEN的mRNA表達

    Figure 3. The protein expression of PTEN in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖3肺癌A549細胞PTEN蛋白的表達

    3 miR-221促進A549細胞增殖

    CCK-8實驗顯示,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics的實驗組細胞在30~60 h,吸光度明顯高于對照組及空白組(P<0.05);而對照組及空白組間無明顯差異,見圖4。平板克隆形成實驗顯示,miR-221 mimics組集落形成數(shù)比對照組和空白組明顯增加(P<0.05),而對照組與空白組集落形成數(shù)量之間無統(tǒng)計學(xué)差異,見圖5。

    4 PTEN是miR-221的下游靶基因

    運用生物信息學(xué)軟件TargetScan進行靶基因預(yù)測,顯示PTEN可能是miR-221的下游靶基因。雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,在含野生型PTEN的3’-UTR序列細胞中,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics組與對照組相比,螢光素酶活性明顯下降(P<0.05);而在含突變型PTEN的3’-UTR序列細胞中,實驗組與對照組和空白組的螢光素酶活性無明顯差異,見圖6。

    Figure 4. Proliferation curves of lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖4肺癌A549細胞的增殖曲線

    Figure 5. Flat plate colony formation test results of lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖5肺癌A549細胞的克隆形成率

    Figure 6. The effect of miR-221 on the target sequence ofPTENdetected by luciferase enzymatic activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

    圖6螢光素酶活性檢測miR-221對PTEN靶序列的作用

    討 論

    miRNA是人體內(nèi)長度約22個核苷酸的非編碼雙鏈小RNA。 miRNA能與相應(yīng)的信使RNA的互補序列結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控靶基因的表達,進而在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[8]。在多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程都存在miRNA的表達異常。根據(jù)miRNA對腫瘤細胞的影響,將其分為致癌miRNA和抑癌miRNA。研究發(fā)現(xiàn),即使是同一種miRNA在不同的腫瘤中表達也會有差異,有時甚至截然不同,對腫瘤細胞的影響也千差萬別[9]。前期我們運用PCR技術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)miR-221在肺癌組織中表達較癌旁正常組織明顯增加,提示miR-221可能在肺癌的發(fā)展中起重要作用。

    miR-221在人類組織及細胞中發(fā)現(xiàn)比較早、存在范圍廣泛,并且在多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)其表達異常,其作用得到了越來越多的重視。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中miR-221含量較正常肝細胞明顯升高,其負向調(diào)控細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子CDKN1B/p27以及CDKN1C/p57,促進肝癌細胞增殖[10]。Pallante等[11]通過微陣列芯片分析甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-221在癌組織中顯著升高;而沉默miR-221表達后,癌細胞的增殖水平明顯降低。在本研究中,在A549細胞中轉(zhuǎn)染miR-221 mimics后,肺癌細胞增殖能力明顯升高;集落形成數(shù)比對照組、空白組均明顯增加。這與我們前期發(fā)現(xiàn)miR-221在肺癌組織中表達增加是吻合的。

    為了進一步確定miR-221的下游作用靶點,我們運用了公認的TargetScan靶基因預(yù)測軟件,并結(jié)合相關(guān)文獻,提示第10號染色體缺失的PTEN可能是其作用靶點之一。PTEN是第1個被發(fā)現(xiàn)的有磷酸酶活性的抑癌基因,其編碼的蛋白含有脂質(zhì)磷酸酶及蛋白磷酸酶的雙重特異性酶活性,與腫瘤的關(guān)系密切[12]。研究發(fā)現(xiàn)在肺癌中PTEN表達的缺失會導(dǎo)致其不能抑制PI3K/AKT信號通路,進而促進肺癌的發(fā)展[13]。在人白血病K562細胞中轉(zhuǎn)染PTEN后,細胞生長明顯受到抑制,且能增強青蒿琥酯的抑癌作用[14]。在本實驗中,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics后肺癌細胞中PTEN蛋白及mRNA表達明顯下降,且雙螢光素酶報告基因進一步確定了PTEN為miR-221的下游靶基因。miR-221抑制PTEN表達后會如何影響下游信號通路還需我們進一步地研究。

    綜上所述,本研究通過細胞轉(zhuǎn)染使miR-221在肺癌細胞中過表達,檢測細胞的增殖能力,并進一步探討其作用機制。研究結(jié)果表明miR-221能夠抑制PTEN的表達,進而促進肺癌細胞的增殖。本研究揭示肺癌中miR-221調(diào)控的新機制,有望為肺癌的治療提供可能的作用靶點。

    [1] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2):115-132.

    [2] Carrington JC, Ambros V. Role of microRNAs in plant and animal development[J]. Science, 2003, 301(5631):336-338.

    [3] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2):281-297.

    [4] Hayes J, Peruzzi PP, Lawler S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy[J]. Trends Mol Med, 2014, 20(8):460-469.

    [5] Eissa S, Matboli M, Sharawy A, et al. Prognostic and biological significance of microRNA-221 in breast cancer[J]. Gene, 2015, 574(1):163-167.

    [6] Yang Y, Zhao X, Li HX. MiR-221 and miR-222 simultaneously target ARID1A and enhance proliferation and invasion of cervical cancer cells[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2016, 20(8):1509-1515.

    [7] Wang L, Liu C, Li C, et al. Effects of microRNA-221/222 on cell proliferation and apoptosis in prostate cancer cells[J]. Gene, 2015, 572(2):252-258.

    [8] Abba M, Mudduluru G, Allgayer H. MicroRNAs in can-cer: small molecules, big chances[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2012, 12(7):733-743.

    [9] Tutar L, Tutar E, Tutar Y. MicroRNAs and cancer: an overview[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2014, 15(5):430-437.

    [10] Fornari F, Gramantieri L, Ferracin M, et al. MiR-221 controls CDKN1C/p57 and CDKN1B/p27 expression in human hepatocellular carcinoma[J]. Oncogene, 2008, 27(43):5651-5661.

    [11] Pallante P, Visone R, Ferracin M, et al. MicroRNA deregulation in human thyroid papillary carcinomas [J]. Endocr Relat Cancer, 2006, 13(2):497-508.

    [12] Song MS, Salmena L, Pandolfi PP. The functions and re-gulation of the PTEN tumour suppressor[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(5):283-296.

    [13] Hollander MC, Balogh AR, Liwanag J, et al. Strain-specific spontaneous and NNK-mediated tomorigenesis inPten+/-mice[J]. Neoplasia, 2008, 10(8):866-872.

    [14] 成志勇, 徐 倩, 趙亞玲, 等. 野生型PTEN基因增強青蒿琥酯抑制K562細胞的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(1):112-117.

    miR-221 promotes proliferation of lung cancer A549 cells by down-regulating PTEN

    ZHENG Li-ping, ZHANG Nan, LIANG Cui-wei, DU Jun-xiang, GONG Wu-xing

    (DepartmentofOncology,ZhuhaiPeople’sHospital,ZhuhaiHospitalAffiliatedtoJinanUniversity,Zhuhai519000,China.E-mail:zlpzs1987@126.com)

    AIM: To explore the effect of microRNA-221 (miR-221) on the proliferation of lung cancer A549 cells, and to investigate its mechanism.METHODSThe A549 cells were transfected with miR-221 mimics by Lipofectamine 2000. The expression of miR-221 was detected by RT-qPCR. The expression of PTEN at mRNA and protein le-vels was detected by RT-qPCR and Western blot, respectively. The cell proliferation was examined by CCK-8 assay and colony formation assay. The 3’-UTR ofPTENwas cloned into luciferase reporter vector and its enzymatic activity was detected to verify whether miR-221 targeted toPTEN.RESULTSThe expression level of miR-221 in the A549 cells was significantly increased after transfection with miR-221 mimics as compared with negative control group and blank group (P<0.01). The mRNA and protein levels of PTEN were significantly down-regulated compared with control group and blank group (P<0.05). In addition, miR-221 over-expression significantly promoted the proliferation of A549 cells (P<0.05). Moreover, miR-221 inhibited the enzymatic activity of luciferase reporter vector ofPTEN.CONCLUSIONOver-expression of miR-221 significantly promotes the proliferation ability of human lung cancer A549 cells by down-regulation of PTEN.

    Lung cancer; A549 cells; MicroRNA-221; PTEN protein; Cell proliferation

    1000- 4718(2017)12- 2208- 04

    2017- 05- 15

    2017- 05- 27

    △通訊作者 Tel: 0756-2158932; E-mail: zlpzs1987@126.com

    R734.2; R363

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.015

    (責(zé)任編輯: 林白霜, 羅 森)

    猜你喜歡
    螢光克隆肺癌
    火蟲發(fā)光為什么一閃一閃的
    中醫(yī)防治肺癌術(shù)后并發(fā)癥
    克隆狼
    對比增強磁敏感加權(quán)成像對肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤檢出的研究
    浙江:誕生首批體細胞克隆豬
    流螢之光
    活色螢光“耀”個性
    鳳凰生活(2018年8期)2018-09-03 10:38:12
    流螢之光
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    microRNA-205在人非小細胞肺癌中的表達及臨床意義
    亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日本黄色视频三级网站网址| 不卡av一区二区三区| 超碰成人久久| 国产1区2区3区精品| 中文字幕高清在线视频| 色综合婷婷激情| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产成人av激情在线播放| 久久伊人香网站| 国产成人欧美在线观看| 久久久国产成人精品二区| 国产区一区二久久| 在线播放国产精品三级| 在线国产一区二区在线| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产一区二区在线av高清观看| 日本一二三区视频观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 激情在线观看视频在线高清| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲国产中文字幕在线视频| 岛国在线观看网站| 丝袜美腿诱惑在线| 一级作爱视频免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 两个人免费观看高清视频| 亚洲av熟女| 91麻豆av在线| 国产精品免费视频内射| 岛国视频午夜一区免费看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲男人的天堂狠狠| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜影院日韩av| 极品教师在线免费播放| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲自拍偷在线| 亚洲九九香蕉| 老司机福利观看| 欧美性长视频在线观看| 久久99热这里只有精品18| 一级片免费观看大全| 成人亚洲精品av一区二区| 757午夜福利合集在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 国产成人精品无人区| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久久久久久久中文| 女同久久另类99精品国产91| 精品国产亚洲在线| 亚洲精品色激情综合| 国产精品一区二区三区四区久久| АⅤ资源中文在线天堂| 嫩草影院精品99| 好男人在线观看高清免费视频| 又大又爽又粗| 欧美zozozo另类| 色精品久久人妻99蜜桃| 黄色片一级片一级黄色片| 成年免费大片在线观看| 精品日产1卡2卡| 国产精品永久免费网站| 高清在线国产一区| 九色国产91popny在线| 久久久久久久久免费视频了| 午夜日韩欧美国产| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 两个人的视频大全免费| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美午夜高清在线| 国产午夜精品久久久久久| 91av网站免费观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99久久国产精品久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久久精品大字幕| 日韩欧美在线乱码| 国产精品亚洲一级av第二区| 此物有八面人人有两片| 国产高清激情床上av| 色综合亚洲欧美另类图片| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产高清有码在线观看视频 | 国产真实乱freesex| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产99久久九九免费精品| 757午夜福利合集在线观看| 国产精品免费视频内射| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 男女之事视频高清在线观看| 国产一区二区激情短视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲人成电影免费在线| 国产久久久一区二区三区| 国产激情偷乱视频一区二区| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产三级在线视频| 久久久久久久久久黄片| 日日干狠狠操夜夜爽| 久9热在线精品视频| 性欧美人与动物交配| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲av成人一区二区三| 国产高清视频在线观看网站| 久久香蕉精品热| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美一区二区精品小视频在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 老司机深夜福利视频在线观看| 全区人妻精品视频| 亚洲全国av大片| 黄片小视频在线播放| 我要搜黄色片| 后天国语完整版免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久久精品大字幕| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 我要搜黄色片| √禁漫天堂资源中文www| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 听说在线观看完整版免费高清| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 午夜福利高清视频| 在线永久观看黄色视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产熟女xx| 精品国内亚洲2022精品成人| www日本在线高清视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美性猛交黑人性爽| 日本一二三区视频观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 免费观看精品视频网站| 久久久久免费精品人妻一区二区| 一二三四在线观看免费中文在| 国产三级在线视频| 变态另类丝袜制服| 一本久久中文字幕| 午夜福利成人在线免费观看| 国产亚洲精品av在线| 久久精品人妻少妇| 十八禁网站免费在线| 三级毛片av免费| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美午夜高清在线| 欧美黄色淫秽网站| 两个人的视频大全免费| 母亲3免费完整高清在线观看| xxx96com| 美女大奶头视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品电影一区二区三区| 欧美在线黄色| 在线观看日韩欧美| av免费在线观看网站| 香蕉av资源在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧美日本亚洲视频在线播放| 日本一二三区视频观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 波多野结衣高清作品| 国产区一区二久久| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产激情久久老熟女| 亚洲成人久久性| 国产高清有码在线观看视频 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久精品综合一区二区三区| 一个人免费在线观看的高清视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 色在线成人网| 国产午夜福利久久久久久| 成人一区二区视频在线观看| 91大片在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 激情在线观看视频在线高清| 精品人妻1区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲天堂国产精品一区在线| 色老头精品视频在线观看| 丁香欧美五月| 嫩草影院精品99| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 老汉色∧v一级毛片| 在线永久观看黄色视频| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲国产精品久久男人天堂| 91九色精品人成在线观看| 亚洲美女黄片视频| 1024香蕉在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 88av欧美| 亚洲人成电影免费在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产在线观看jvid| 1024视频免费在线观看| 久久人妻av系列| 午夜福利高清视频| 欧美成人性av电影在线观看| 99热这里只有是精品50| 欧美一区二区精品小视频在线| 免费看美女性在线毛片视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲熟女毛片儿| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品亚洲美女久久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 麻豆一二三区av精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频 | 中出人妻视频一区二区| 国产精品久久久久久久电影 | 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲国产精品合色在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品久久久人人做人人爽| 99精品久久久久人妻精品| 一本综合久久免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲最大成人中文| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲七黄色美女视频| www.熟女人妻精品国产| 嫩草影视91久久| 免费搜索国产男女视频| 日日夜夜操网爽| 一级a爱片免费观看的视频| 国产成人影院久久av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久这里只有精品19| 色老头精品视频在线观看| 久久中文看片网| 好男人在线观看高清免费视频| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲国产看品久久| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 91大片在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 国产伦在线观看视频一区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 久久久久久久久免费视频了| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美国产日韩亚洲一区| 国语自产精品视频在线第100页| 深夜精品福利| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 人妻久久中文字幕网| 女同久久另类99精品国产91| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲 欧美一区二区三区| 不卡一级毛片| 天堂√8在线中文| 亚洲人与动物交配视频| 一区二区三区国产精品乱码| 男人舔女人的私密视频| 亚洲av电影在线进入| 国产视频内射| 精品福利观看| 黄片小视频在线播放| 好男人在线观看高清免费视频| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩欧美精品v在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 91国产中文字幕| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲专区国产一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 嫩草影院精品99| 窝窝影院91人妻| 国产精品一及| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品国产清高在天天线| svipshipincom国产片| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产麻豆成人av免费视频| 不卡一级毛片| 好男人在线观看高清免费视频| 国产亚洲av高清不卡| 99国产精品一区二区蜜桃av| 色老头精品视频在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 91九色精品人成在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产99久久九九免费精品| 亚洲专区国产一区二区| 国产私拍福利视频在线观看| 日韩有码中文字幕| 韩国av一区二区三区四区| 精品电影一区二区在线| 一个人免费在线观看电影 | 99久久国产精品久久久| 国产亚洲精品一区二区www| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品 国内视频| 91老司机精品| 日本五十路高清| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 他把我摸到了高潮在线观看| 国产亚洲欧美98| 免费在线观看影片大全网站| cao死你这个sao货| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 黄片小视频在线播放| √禁漫天堂资源中文www| 男人舔女人的私密视频| 香蕉丝袜av| 一a级毛片在线观看| 99riav亚洲国产免费| 国产亚洲精品av在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品无人区乱码1区二区| 99国产精品一区二区三区| 国产成年人精品一区二区| 国产69精品久久久久777片 | 看片在线看免费视频| 国产在线观看jvid| 禁无遮挡网站| 国产伦在线观看视频一区| 欧美午夜高清在线| 午夜免费激情av| 99精品在免费线老司机午夜| 人人妻人人澡欧美一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩欧美免费精品| 久久 成人 亚洲| 在线永久观看黄色视频| 三级毛片av免费| 动漫黄色视频在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 麻豆国产97在线/欧美 | 中文字幕高清在线视频| 老司机靠b影院| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久天堂一区二区三区四区| 三级毛片av免费| 在线观看免费视频日本深夜| 国产av不卡久久| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| 在线观看66精品国产| 淫秽高清视频在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 最近最新中文字幕大全电影3| 身体一侧抽搐| 岛国在线免费视频观看| 波多野结衣巨乳人妻| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产99白浆流出| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲天堂国产精品一区在线| 男人舔奶头视频| 成人手机av| 超碰成人久久| 99在线人妻在线中文字幕| 国产单亲对白刺激| 国产爱豆传媒在线观看 | 午夜激情福利司机影院| 成人永久免费在线观看视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品久久久久久久电影 | 特大巨黑吊av在线直播| 久久香蕉精品热| 99国产综合亚洲精品| 日本在线视频免费播放| 亚洲 国产 在线| 欧美乱妇无乱码| 欧美成人午夜精品| 日韩欧美免费精品| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲国产看品久久| 久久久国产成人免费| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久精品综合一区二区三区| 观看免费一级毛片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 我的老师免费观看完整版| 日本 欧美在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| aaaaa片日本免费| 亚洲精品在线观看二区| 欧美极品一区二区三区四区| 久久中文看片网| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲国产精品合色在线| 午夜福利视频1000在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久亚洲真实| 身体一侧抽搐| av片东京热男人的天堂| 一a级毛片在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 国产一区二区激情短视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 淫妇啪啪啪对白视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美极品一区二区三区四区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 悠悠久久av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 成人av在线播放网站| 日韩欧美在线乱码| 亚洲,欧美精品.| 国产成人欧美在线观看| 在线观看www视频免费| 成人午夜高清在线视频| 91在线观看av| 1024香蕉在线观看| 欧美3d第一页| 亚洲电影在线观看av| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一级黄色大片毛片| 久久久精品欧美日韩精品| 中文字幕av在线有码专区| 久久精品国产清高在天天线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲精品在线观看二区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日本免费一区二区三区高清不卡| 精品久久蜜臀av无| 岛国视频午夜一区免费看| 在线国产一区二区在线| 老鸭窝网址在线观看| 我的老师免费观看完整版| 亚洲免费av在线视频| 黄色女人牲交| 一级毛片高清免费大全| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 熟女电影av网| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 99re在线观看精品视频| 中文字幕久久专区| 51午夜福利影视在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 国产真实乱freesex| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美大码av| a级毛片a级免费在线| 白带黄色成豆腐渣| 欧美日韩一级在线毛片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲av电影在线进入| 国产乱人伦免费视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲精品一区av在线观看| 国产片内射在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 天天一区二区日本电影三级| 国产av又大| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产v大片淫在线免费观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 免费看美女性在线毛片视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 成人精品一区二区免费| 国产亚洲欧美在线一区二区| 麻豆一二三区av精品| 久久久久久大精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 露出奶头的视频| 91在线观看av| 我要搜黄色片| 欧美激情久久久久久爽电影| 男女视频在线观看网站免费 | 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 中亚洲国语对白在线视频| 国产视频一区二区在线看| 欧美乱妇无乱码| 久久久久久人人人人人| 很黄的视频免费| 午夜福利18| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产精品av视频在线免费观看| 中文字幕最新亚洲高清| 五月玫瑰六月丁香| 丁香六月欧美| 搡老妇女老女人老熟妇| 激情在线观看视频在线高清| 久久亚洲真实| 日本黄色视频三级网站网址| 黄片大片在线免费观看| 免费无遮挡裸体视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久久国产欧美日韩av| 又爽又黄无遮挡网站| www日本黄色视频网| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美黑人精品巨大| 国产av一区在线观看免费| 1024香蕉在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日韩欧美精品v在线| 色av中文字幕| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩国内少妇激情av| cao死你这个sao货| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产成人系列免费观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 免费av毛片视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 俄罗斯特黄特色一大片| 婷婷亚洲欧美| 久久久久国内视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 成人av在线播放网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产区一区二久久| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久这里只有精品19| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 婷婷六月久久综合丁香| 精品欧美一区二区三区在线| 男女下面进入的视频免费午夜| 日本在线视频免费播放| 亚洲精品色激情综合| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩欧美免费精品| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精华一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 精品欧美一区二区三区在线| 国产主播在线观看一区二区| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲无线在线观看| 欧美性长视频在线观看| 俺也久久电影网| 好男人电影高清在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 他把我摸到了高潮在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品1区2区在线观看.| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产男靠女视频免费网站| 午夜成年电影在线免费观看| 十八禁网站免费在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产日本99.免费观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 9191精品国产免费久久| 欧美色视频一区免费| av天堂在线播放| 老司机福利观看| 国产一区二区三区视频了| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品亚洲美女久久久| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲电影在线观看av|